三明治般的微环境来驾驭细胞/材料相互作用

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

细胞培养物已被传统上进行二维的（2D）基板，其中细胞粘附使用腹侧受体的生物材料的表面上。然而， 在体内 ，大部分细胞完全由细胞外基质（ECM）所包围，从而导致受体的三维（3D）分布。这可能会触发外信号传导途径，从而在细胞行为​​中的差异。

本文表明刺激已经附着到2D衬底通过叠置一种新材料（形成夹芯状培养物）的膜单元的背侧受体触发相对于标准的2D培养物的重要变化。此外，腹侧和背侧受体的同时激发转移细胞行为更接近，在3D环境中。另外，由于该系统的性质，形成夹芯状培养是一种多用途的工具，它允许在小区/材料INTE不同参数的研究ractions， 例如 ，地形，刚度和不同的蛋白质涂层同时在腹侧和背侧两侧。最后，由于三明治般的文化是基于二维基质，已经开发了几个分析程序的标准的2D文化都可以正常使用，需要克服的3D系统更复杂的程序。

传统上，细胞培养物已进行了对两维（2D）基板，但大多数的体内细胞微环境有一个三维（3D）的性质。这种不自然的2D环境触发一个平坦的世界，改变细胞的行为作为自适应性的一种方式，这直接影响细胞的命运^1,2。因此，获得的二维细胞培养结果并不总是可再现的体内 。这鼓励了新的有关文化系统寻求提供更多的生理条件一样获得进一步深入了解任何尺寸依赖性生物学机制^3,4发展。

之一的二维培养和3D 体内环境之间的主要区别是锚定到细胞外基质（ECM）的细胞受体的分布:而在2D基板细胞附着腹侧，大部分细胞在体内的由ECM和被完全包围因此CELL粘附是通过受体的三维分布。这会触发不同的细胞粘附信号传导途径，从而调节重要的过程，如细胞生长，细胞分化和基因表达。在过去的十年中，许多不同的3D培养系统已经建立^5-8，虽然他们的变异性和复杂性，阻碍它们在通常的细胞培养过程标准化。此外3D系统通常不容易处理和二维衬底目前的实验过程不能用于3D培养容易建立。此外，文学比较罕见的3D文化具有同等条件的2D或其他3D系统，阻碍了在这些模型中细胞行为的正确理解。

一旦具有附着一个2D衬底，背侧受体的激发在细胞上 - 由叠加新材料（夹芯状培养物）的膜 - 可以触发细胞的反应一样的3D环境。该REA子后面，这是同时激活两个背侧和腹侧受体粘附及夹心环境内传播（ 图^1）9,10。其结果是，细胞经历相对于2D培养^11,12重要的变化。因此，细胞的命运，是因为夹层文化的组装过程中确定，因为背的刺激触发的变化的关键细胞途径。因此，在细胞命运是高度由当夹层状培养组装¹¹的时间来确定。

由于该系统的性质，形成夹芯状培养是一个简单的和通用的工具，它允许在小区/材料相互作用，诸如化学，地形，刚度和蛋白质涂层不同的参数同时在腹侧和背侧两侧的研究。这提供了一个更高的通用性相比其他3D系统（ 图2），由于独立背宽诉和腹侧组合ariety的表面状况。此外，不同的细胞系和不同的时间来组装夹芯状培养可以研究，增加的可能性的宽光谱。

夹心状培养物的标准协议是以下详述使用任一聚L-乳酸（PLLA）电纺丝纤维或薄膜作为背侧基板，玻璃盖玻片作为腹侧基底和纤连蛋白作为蛋白质涂层。三明治般的培养物刚过细胞种植或3小时二维培养后组装。然而，请注意，其他材料的系统和蛋白质可用于;同样的夹层状培养物可以在不同的时间点进行组装。

1.生产背基质

1. 生产PLLA的通过溶剂浇铸平坦膜构成。
   1. 在通风橱中操作，在室温下（RT）下，直到完全溶解（3小时左右）搅拌，以制备2％溶液（重量/体积）的PLLA的氯仿（100毫升氯仿2克PLLA）。
   2. 放在玻璃培养皿的垫圈。
      注意:使用不锈钢垫圈10.5毫米（比腹侧样品直径稍小）的内径，使得所述垫圈被放置在腹侧衬底的顶部。其他材料，如聚四氟乙烯（PTFE）或玻璃垫圈可以使用。
   3. 加入200μl在洗衣机的PLLA溶液，并让蒸发慢慢为在室温30分钟。为了使溶剂缓慢蒸发，关闭培养皿用铝箔与几个洞。
   4. 加热在120℃下将样品5分钟以蒸发溶剂的痕迹。
   5. 让样品做凉WN在RT。
   6. 一旦样品已经冷却下来（30分钟左右），盖上18.2兆欧·厘米水的培养皿孵育在室温8分钟。
      注意:如果样品没有完全冷却下来，他们可能会采取比上年增长18.2MΩ·cm的水，并采用橡胶态。另外，培养在18.2MΩ·cm的水为小于8分钟，可能会导致不正确的脱离，用于从所述垫圈在脱离超过8分钟。
   7. 用刀片撬垫圈剥离其关闭的培养皿。
   8. 从用镊子垫圈的边缘除去的任何缺陷，并让样品风干。
   9. 存储在真空干燥器（80毫巴），直至试验当天的样品，因为PLLA是降解由水解。
2. 生产聚乳酸纤维通过静电纺丝。
   1. 在通风橱中操作，制备了8％的溶液（重量/体积）的PLLA在六氟异丙醇（100毫升六氟异丙醇8克PLLA）由stirr荷兰国际集团在室温至完全溶解（3小时左右）。
   2. 放置的聚四氟乙烯（PTFE）垫圈上的铝薄片或在滚筒上的静电，以获得随机或排列的纤维分别。
      注意:使用聚四氟乙烯（PTFE）垫圈10.5毫米（比腹侧样品直径稍小）的内径，使得所述垫圈被放置在腹侧衬底的顶部。其他材料，如不锈钢或玻璃垫圈可以使用。所述滚筒应以角速度的160.7秒^-1（半径= 7厘米），以获得排列的纤维旋转。较慢的速度可能不会触发光纤对准和更快的速度会导致断丝。
   3. 装载注射器与聚合物溶液，并放置于注射器泵。
   4. 静电纺丝用0.9毫升/小时的流速为30千伏的电压和为12cm的集电极的距离的PLLA溶液。
   5. 停止静电纺丝过程中船尾呃20-30分，一旦一个良好的纤维密度达到（因为细胞有同时与若干纤维进行交互）。
   6. 加热在120℃下将样品5分钟以蒸发溶剂的痕迹。
   7. 存储在真空干燥器（80毫巴），直至试验当天的样品，因为PLLA是降解由水解。

2.三明治文化

1. 组装夹层状培养一旦细胞被粘附到腹侧2D衬底。
   1. 在培养罩工作，以确保在无菌条件并通过紫外线照射消毒的所有材料（玻璃盖玻片上，背侧基片，镊子等 ）30分钟。
   2. 涂层的腹侧和背侧基板用纤连蛋白，以便引导特异性细胞蛋白的粘附。要做到这一点，孵育的样品中的纤连蛋白的20微克/毫升溶解在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）含Ca ²⁺和Mg ^2+（200微升/秒充足）1小时。
      注意:由于在制造过程中，背侧基片具有一个指定顶侧和底侧，因为溶剂浇铸膜和电纺丝纤维附着到垫圈的侧面之一。因此，这一边是一面临的细胞（ 图3）。
      1. 蛋白质涂布后，用DPBS两次洗样品，以在过量除去蛋白质。然后孵育在DPBS中的样品，直到其以防止样品从得到干燥，因为这会导致蛋白质变性用途。含Ca ²⁺和Mg ^2+，因为二价阳离子使用DPBS调节蛋白质折叠。
   3. 在玻璃上的种子细胞的盖玻片^13。
      注意:作为夹层状培养基于2D基板，细胞接种将同样作为一个2D样本来执行。例如，C2C12成肌细胞接种17,500细胞厘米^-1分化实验和NIH3T3成纤维细胞接种在7000ÇELLS厘米^-1孤立的文化研究细胞的形态和附着力。
   4. 放置在温箱中的样品在37℃，5％的CO _2，并允许细胞粘附于腹侧基底3小时。
   5. 将腹侧播种基板在12多孔板的一个新井（其中垫圈适合）。
      注:在组装新井夹心样的文化是一种方式来摆脱那些坚持的底部播种后好细胞，因为这些会消耗养分和分泌，影响细胞内的培养生长因子和浪费三明治类的系统。这也是蜂窝萃取以裂解仅夹层状环境中培养的细胞是必须的。
   6. 小心并用一对镊子的帮助下，覆盖在细胞上的背衬底。笔芯与介质（1毫升），37℃，5％的CO _2。
      注意:该垫圈的重量将防止背子浮动STRATE。
   7. 一个星期换两次培养基作为标准的2D文化。别动背底，因为这可能会导致细胞损伤。
2. 刚过细胞种植组装三明治般的文化。
   1. 在培养罩工作，以确保在无菌条件并通过紫外线照射消毒的所有材料（玻璃盖玻片上，背侧基片，镊子等 ）30分钟。
   2. 涂层的腹侧和背侧基板用纤连蛋白，以便引导特异性细胞蛋白的粘附。要做到这一点，孵育的样品中的纤连蛋白的20微克/毫升溶解在含有Ca ²⁺和Mg ^2+（200微升/样品）进行1小时的DPBS。
      1. 蛋白质涂布后，用DPBS两次洗样品，以在过量除去蛋白质。然后孵育在DPBS中的样品，直到其以防止样品从得到干燥，因为这会导致蛋白质变性用途。含有^钙和镁的使用DPBS 2+，因为二价阳离子调节蛋白质折叠。
   3. 在玻璃盖玻片在12多穴板的孔种子细胞（其中垫圈适合）。要做到这一点，使用高浓缩细胞悬浮液，以避免铺设背底后的细胞损失。
   4. 小心并用一对镊子的帮助下，覆盖在细胞上的背衬底。笔芯与介质（1毫升），37℃，5％的CO _2。
      注意:该垫圈的重量将防止背衬底浮起。
   5. 一个星期换两次培养基作为标准的2D文化。
      注意:不要将背底，因为这可能会导致细胞损伤。

3.分析

注意:三明治状培养物基于二维基板，所以可以通过已制定了标准的2D培养程序可以共同进行分析。例如，由于聚乳酸是透明和大公LS被约束为在xy平面内移动，显微镜是作为二维衬底。细胞迁移可因此分析作为2D培养物，而不在z轴作为用于3D培养，从而简化了实验和图像分析追踪单元的需要。要通过划痕试验研究伤口愈合实验遵守此协议:

1. 研究细胞迁移（伤口愈合测定法）的三明治般的文化中。
   1. 在培养罩工作，以确保在无菌条件并通过紫外线照射消毒的所有材料（玻璃盖玻片上，背侧基片，镊子等 ）30分钟。
   2. 涂层的腹侧和背侧基板用纤连蛋白，以便引导特异性细胞蛋白的粘附。要做到这一点，孵育的样品中的纤连蛋白的20微克/毫升溶解在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）含Ca ²⁺和Mg ²⁺ 1小时。
      1. 蛋白质涂布后，用DPBS洗两次的样品为了在过量除去蛋白质。然后孵育在DPBS中的样品，直到它们的使用，以防止样品从因为这获得干燥可能会导致蛋白质变性。含Ca ²⁺和Mg ^2+，因为二价阳离子使用DPBS调节蛋白质折叠。
   3. 种子细胞在玻璃盖玻片以高密度^13。
   4. 放置在温箱中的样品在37℃，5％的CO _2，并允许细胞达到汇合。
   5. 使用移液管头划伤细胞单层以获得由间隙隔开的2细胞群。
   6. 放置在一个新井合适的腹侧播种底物时间推移采集并且其中背基板适合（ 即 12多孔板）。
   7. 小心并用一对镊子的帮助下，覆盖在细胞上的背侧基板，然后用培养基填充（1毫升12多孔板）。
      注意:该垫圈的重量将防止吨他背底浮动。
   8. 将样品中的时间推移显微镜（设定为37℃和5％的CO _2），并采取间隙闭合，每20分钟的图像。
   9. 使用特定软件的差距封闭分析如ImageJ的插件^MiToBo。14

注:蛋白质和核酸提取作为2D基板同样进行。只有一个额外的步骤，由在拆卸夹层状培养直接添加裂解缓冲液的细胞以提高提取效率。例如，对于mRNA提取:

2. 从三明治般的文化基因提取
   1. 根据制造商的说明从商业试剂盒制备的所有缓冲区。
   2. 就拿三明治般的文化从孵化器。
   3. 从样品中取出培养基。
   4. 含有钙DPBS洗一次样本²⁺和Mg 2+（1毫升），并删除所有的溶液。
   5. 用一对镊子的帮助下，取下背基板与裂解缓冲液（350微升）添加到腹侧基底。再次叠加腹侧基底上的背衬底以便也溶解粘附于背基片上的​​细胞。
   6. 除去背侧基板以分离出裂解溶液。
   7. 按照制造商的说明，以获得表达。

注:蛋白质的免疫检测可以也执行与二维衬底。因为夹层状培养物会妨碍抗体和缓冲液的正确扩散，孵育时间应该增加。此外，夹层可以在开始染色方案之前被拆卸，但在后一种情况下，一些细胞将保持附着于背基片和一些向腹侧基底。

3. 内形成夹芯状培养Immunodetect蛋白
   1. 用DPBS洗涤一次样品并用在PBS中的4％甲醛为20分钟，在4℃下固定。
      注意:背衬底可以在固定过程，从而避免扩散问题被除去。
   2. 冲洗用DPBS（1毫升）中，然后用0.5％的Triton X-100中的DPBS（1毫升）通透5分钟，室温。
   3. 阻断非特异性结合位点与在DPBS中1％白蛋白（1毫升）中在室温30分钟。
   4. 孵育与初级抗体（2微克/毫升1毫升）的阻断溶液中3小时，在室温。
   5. 10分钟用DPBS / 0.5％吐温20（1毫升）洗3次。
   6. 孵育2小时用二级抗体（2微克/毫升）和1微克/毫升的DAPI在封闭溶液（1毫升）中于RT。
   7. 在DPBS 10分钟/ 0.5％吐温20（1毫升）洗3次。
   8. 在DPBS洗。
      注意:样品可以被安装在一个具有的Vectashield滑动并用指甲油密封时背衬底之前移除免疫检测。
   9. 在荧光显微观察范围作为标准的2D衬底。

背受体的夹层状培养中的刺激触发细胞形态变化，细胞粘附和细胞内信号通路（ 例如粘着斑激酶^{，FAK）10-12。}作为一个例子，成纤维细胞的夹层状系统内培养过表达的_α5整亚基相比2D，作为观察到的其他3D培养^15,16。

细胞命运是高度依赖于当背受体受到刺激的时间和由背相互作用的性质，类似于其他3D系统发生诸如水凝胶。例如，水凝胶，其中蛋白质是紧密结合的，通常较小的展示和圆形细胞与未开发的肌动蛋白细胞骨架和扩散粘着斑。这可以模仿在形成夹芯状使用培养基材即吸附蛋白质紧密，从而使细胞不能机械地重新组织该层蛋白质和细胞sprea的丁受阻。类似地，水凝胶，其中细胞可重塑的ECM可以通过使用吸附蛋白质更松散¹⁰基板来模拟与三明治系统。

背侧受体的刺激已显示调节的C2C12细胞命运。当涂覆有纤连蛋白，但不是在用牛血清白蛋白（非黏着蛋白）涂覆的背静电的PLLA纤维直接的细胞对准。该结果指出细胞做生物感和反应以背侧输入（ 图^4）9。此外，夹层状培养物与平面背PLLA触发增加肌形成的水平。这也取决于背生物刺激自与在不同分化率不同背蛋白的结果（ 图^5）9的相互作用。

相比，二维培养的夹层状培养内细胞迁移也被改变。它是烯表明，在伤口愈合测定法，夹心培养内细胞采用高度细长形态和迁移距离较短比2D基板（ 影1和2）。细胞迁移率进一步相关的腹侧和背侧刺激¹²的性质。

类似于内三维纤连蛋白和胶原凝胶^17,18，三明治状培养增加细胞介导的ECM重组（ 即腹侧纤连蛋白）在相对 ​​于所述二维条件（ 图^6）12。这个过程依赖于背侧机械刺激和细胞骨架的稳定性由于使用收缩性抑制剂（II型肌球蛋白，Y27632）受阻的过程。有趣的是，使用不同的背蛋白涂层（ 即玻连蛋白和牛血清白蛋白）时的腹侧纤连蛋白也被重组，即使不涂覆^12。

图1:素描标准（2D）和三明治样培养的三明治状文化中背受体的刺激触发额外的细胞粘附信号，其调节重要的细胞过程，请点击此处查看该图的放大版本。

图2:三明治般的文化是一个通用的系统，它允许不同的良好控制参数（输入地形，僵硬，渐变...）的腹侧和背侧基板两者的研究。

图3:背基板勾勒两个，以便显示具有指定顶侧和底侧的顶视图和横截面图（A）平的PLLA膜和（B）的电纺丝纤维。

图4:不同的培养条件下的C2C12形态包括平面（p）和排列的纤维（一）PLLA的那个被用作腹侧（下标）或背侧（上标）衬底的虚线表示纤维取向在必要。细胞在平面基底上培养并覆盖有PLLA的对齐纤维（SW _P ^A）感测所述背侧刺激。特别是，细胞检测时涂上纤连蛋白，但不是在涂无线背纤维个牛血清白蛋白（非黏着蛋白）。因此细胞附着到涂覆有纤连蛋白，纤维和对齐在同一方向上。图片摘自参考^9。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5:细胞分化在夹芯状培养后在分化培养基4天。不同的培养条件进行分析，包括平面（p）和排列的纤维（一）PLLA的那个被用作腹侧（下标）或背侧（上标）的底物。样品涂覆有纤连蛋白在所有的情况下。 （A） 的荧光染色显示肌球蛋白阳性细胞（绿色）和细胞核（红色）。 （二）差异化细胞定向为计算和高速傅立叶变换。 （C）的肌形成由肌球蛋白阳性细胞的百分比来确定。数据标准化为黄金标准控制。统计学差异显著指示与*** P <0.001。图片摘自参考^9。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6:腹侧纤维连接蛋白的重组。 （刷状标签;指出了白色箭头）三明治文化形成新的纤维连接蛋白纤维触发腹侧FN重组。腹侧纤维连接蛋白是在像三明治一样的文化与不同的蛋白质背涂层（纤连蛋白，玻连蛋白和牛血清白蛋白）重组或者即使当背衬底留涂覆。肌动蛋白细胞骨架（绿色），细胞核（蓝色）和FN（红色）显示。 请点击此处查看该图的放大版本。

电影1:2D细胞迁移。 L929成纤维细胞迁移的纤维连接蛋白涂层的玻璃盖玻片在伤口愈合测定。被收购图片16小时（与采取的每20分钟一帧）。 请点击此处观看该视频。

电影2:夹心状培养内细胞迁移的L929成纤维细胞在伤口内形成夹芯状培养愈合测定迁移是腹侧基板是纤连蛋白涂覆的玻璃盖玻片和背基底纤连蛋白涂覆的PLLA膜。被采集的图像进行16小时（与采取的每20分钟一帧）。 请点击此处观看该视频。

如今，3D培养是用于制药和生物技术工业中的重要课题，以及研究在细胞生物学，包括癌症和干细胞。因此几个3D​​培养系统已经开发出来。不幸的是，三维系统之间的差别通常导致不同的细胞行为，阻碍细胞命运的理解。此外，实验程序通常不那么简单，因为二维培养系统。因此开发新的培养系统寻求克服一些上述缺点的是非常重要的。

夹芯状培养已显示强烈影响关键的细胞过程，例如细胞分化，细胞形态，细胞信号传导和细胞迁移。此外细胞份额相似之处细胞的三维培养系统，支持了三明治式的文化联系与二维三维培养系统的声明。生理组织具有孔隙的3〜14μ的范围玛那约束细胞，从而影响细胞过程，如迁移。这是使用三明治状系统以某种方式概括为背侧和腹侧刺激代表本身受约束的环境，限制了细胞形态学和将必然影响细胞迁移无论该蛋白质涂层。

由于背部和腹部受体的同时刺激，三明治般的文化是一种强大的技术探讨维度的细胞行为中的作用。此外，因为它是基于二维基材，该培养系统是高度通用研究不同的材料特性和ECM输入允许细胞行为在不同微环境的研究。此外，对在该背侧受体对细胞命运刺激的时间的影响可以通过叠置在不同时间点的背侧基板进行调查。因此，与其他3D系统，夹心状系统提供了一个宽的光谱的良好控制细胞微环境。因此，该夹层状系统是一个有趣的细胞培养平台，为了研究不同的培养条件下细胞生物学和测试细胞命运模仿不同的生理环境。

如前面提到的，一个优点本系统的是，不同的腹侧和背侧基片可以用不同的蛋白质的涂层进行研究。因此，对于细胞命运的重要参数，例如配体密度可通过控制所用的2D基板中的每一个（ 例如腹侧和背侧基片）的配体密度来调节。然而，请注意，不同的衬底，可能需要改变协议。例如，当使用更大的背侧基板，可能会导致在需要设置适当的温育时间剥离的样品断培养皿。同样地，更大的腹侧基底可能会导致在样品的中心，因为腹侧的有限氧气渗透率缺氧区衬底（由于玻璃盖玻片）。此外，分析程序将依赖于衬底的属性。例如，使用不透明的背底会阻碍标准的显微镜协议，但它仍然会允许蛋白质/核酸提取。另一个关键因素是背基底的渗透性，因为细胞应被允许获得来自介质的营养物质和丢弃废物。

综上所述，形成夹芯状培养是一个简单的系统，该系统提供了可能性，以模仿不同三维状微环境来研究细胞的命运。

The authors have nothing to disclose.

The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.