16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Bakteriler gibi periodontitis, pulpitis, Perikoronitis, selülit ve osteomyelit gibi çeşitli ağız hastalıklarının etiyolojisinde rol oynarlar. Hastalığın patojenezinde bakteri rolünü anlamak ve tedavilerin etkisini izlemek amacıyla, doku içindeki bakterilerin yeri önemlidir. periodontitis olan hastalardan alınan dişeti dokusu içinde bakterilerin varlığı Floresan-kullanarak, in situ hibridizasyon (FISH) ⁸ elektron mikroskobu ^1,2, immünohistokimya ve immünofloresan kullanılarak bakterilerin spesifik antikorlar ^3-7, ve floresan dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak gösterilmiştir 16S rRNA hedef etiketli oligonükleotid prob. Bununla birlikte, bu yöntemler yaygın nedeni, teknik sınırlama veya zorluklara kullanılmamaktadır. Antikorlar ile karşılaştırıldığında, 16S rRNA hedefleme probları üretmek ve tür spesifikliğini elde etmek kolaydır. BALIK Bact görüntülenmesi için mükemmel bir araç olduğunu kanıtlamıştırBöyle plak biyofilm olarak kendi doğal ortamlarında eria. Bununla birlikte, doku numunelerini, FISH uygulanması nedeniyle çeşitli doku bileşenlerinin otofloresansı sınırlıdır. Bunlar ⁹ kanama barındırır, örneğin kırmızı kan hücrelerinin kuvvetli otofloresansı genellikle iltihaplı dokulara floresans teknolojisinin uygulanmasını engellemektedir.

Iltihaplı diş eti dokularda bakterilerin lokalize etmek için, bu nedenle, digoksigenin kullanılarak bir in situ hibridizasyon metodu (DIG) -etiketli DNA probu geliştirilmiştir ve başarılı bir şekilde ^10,11 uygulanır. P kullanarak parafine gömülü dokularda bakteri lokalizasyonu için Burada detaylı bir protokol gingivalis-spesifik ve genel eubacterial sondalar açıklanmıştır. Özellikle içindeki sonuçlar diğer laboratuarlarda yeniden böylece yöntemin standardizasyon odaklanmıştır. Bu protokol histolojik bağlam ve resu içindeki bakterilerin lokalizasyonu veriyorlt son derece tekrarlanabilir. Açıklanan protokol, ya çeşitli dokularda bir türe özel veya genel bir şekilde bakterileri lokalize etmek için de kullanılabilir. Evrensel prob polimikrobial hastalıklarda bakteri tespit etmek ve belirli bir bakteri rolü bilinmemektedir burada hastalıklarda bakteri potansiyel rolünü araştırmak için yararlıdır.

1. Probe Hazırlık

1. Prob PCR amplifikasyonu
   1. P. gingivalis spesıfik prob, P. bir 343-bp DNA fragmanını çoğaltmak P. genomik DNA kullanılarak PCR ile gingivalis 16S rRNA gingivalis aşağıdaki primerler: 5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 've 5'-ACT ATC CGT CGT GCC TAT TC-3' ^10. Aşağıdaki döngü koşulları amplifikasyonlar yapın: 35 döngü 95 ° C'de 30 saniye, 30 saniye için 60 ° C, ve 72 ° 'de 5 dakika uzatma ve ardından 1 dakika 20 saniye için 72 ° C C ^10,11 için.
   2. 70 bp'lik bir DNA parçası (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG kullanılarak eubacterial prob yükseltin
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 'bir oligonükleotid aşağıdaki primerler olarak sentezlenir): 5'-CAG CTG GTR CMT GGY-3' ¹¹ ve 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3. Aşağıdaki döngü koşulları amplifikasyonlar gerçekleştirin: 40 döngüleri30 saniye için 30 saniye için 9 4 ° C, 60 ° C ve 1 dakika 72 ° C ^11,12 sıcaklıkta 5 dakikalık bir uzatma ve ardından 20 saniye süreyle 72 ° C'de.
   3. Ve 2 saat boyunca -20 ° C'de inkübe 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve (: 1: 2 oranında 10 de),% 100 etanol ilave edilerek PCR ürünleri (≥500 ul) hızlandırabilir.
   4. Santrifüj karışım 15 dakika için 14,000 x g'de, TE tamponu, 100 ul pelet tekrar süspansiyon ve 260 nm'de optik yoğunluk ile DNA konsantrasyonu ölçülür.
2. DIG DNA etiketleme ve saptama kiti kullanılarak DIG-etiketleme
   1. 15 ul bir son hacme su ile prob 3 ug karıştırın.
   2. 10 dakika boyunca 95 ° C 'de DNA'yı denatüre ve hızlı bir şekilde buz üzerine soğuk.
   3. 10x heksanükleotid karışımı 2 ul dNTP etiketleme karışımı 2 ul ve denatüre edilmiş DNA 15 ul Klenow enzimi 1 ul ekle.
   4. Karıştırın ve 48 saat için 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 65 ° C'de ısıtma ile reaksiyonu durdurun.
3. DIG DNA etiketleme ve saptama kiti kullanılarak DIG-etiketli prob duyarlılığını kontrol
   1. El ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kitte sağlanan pozitif kontrol probu seri dilüsyonları 1 ul naylon membran üzerinde DIG etiketli prob 1 ng ve kuru yük.
   2. Kısaca 2x SSC tamponu (0.3 M NaCI, 30 mM sodyum sitrat, pH 7.0) 'de membran ıslatın ve DNA immobilize etmek için 1 saat boyunca 80 ° C' de membran inkübe edin.
   3. Kısaca maleik asit tamponu (MAB, 0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) membran emmek ve anti-DIG alkalin fosfataz ile birleştirilmiş bayır antikoru seyreltildi (AP) ile inkübe: Resim bloke çözeltisi içinde 6 ml (1 5000) 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kiti.
   4. MABT (MAB% 1 Tween 20 ihtiva eden) ile zarın yıkanması ve üzerine 2 ml saptama tamponu (0.1 M Tris-HCI, 0.1 M NaCI, 0.05 M _MgCl2, pH 9.5) ile karıştırılmıştır NBT / BCIP çözeltisi 40 ul geçerlidir 1 dakika için membran. Etiketlenmiş prob duyarlılığı isetatmin edici değil, 1.1.3 den 1.3.4 için adımları tekrarlayın.
   5. Etiketli prob (OD260) DNA konsantrasyonu ölçülür ve ul ng 100 konsantrasyonunu ayarlamak ^-1.
4. DIG-etiketli prob özgünlüğünü kontrol
   1. Genomik DNA örnekleri denatüre 10 dakika boyunca 95 ° C 'de, belirli bir prob hedef bakteri dahil olmak üzere çeşitli bakteri türlerinin gelen (25 3 ul ^-1, her numune başına ng) ve hızlı bir şekilde buz üzerinde soğuk.
   2. El ile oda sıcaklığında 20 dakika için denatüre edilmiş naylon membran üzerine DNA ve kuru yük.
   3. Kısaca 2x SSC tamponu membran ıslatın ve DNA immobilize etmek için 2 saat boyunca 80 ° C 'de membran inkübe edin.
   4. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici bir solüsyonuyla membran bloke.
   5. Hibridizasyon tamponu içinde seyreltilmiş probları denatüre ve membran üzerine uygulanır ul ^-1 1 ng probu ile seyreltilir.
   6. 1 saat süre ile 45 ° C 'de membran inkübe edin.
   7. Zarın yıkanması Üç2x SSC tamponu ile kere.
   8. Kısaca MAB membran ıslatın.
   9. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi içinde 6 ml (2.000 1) ile seyreltildi, anti-DIG AP-konjuge antikor ile inkübe edin.
   10. MABT ile zarın yıkanması ve 2 ml saptama tamponu ile karıştırıldı NBT / BCIP çözeltisi 40 ul uygulanır.
   11. Sonda beklenen özgüllük elde değil zaman özgünlüğü görülünceye kadar, melezleme sıcaklığını arttırın.

İn Situ Hibridizasyon 2.

Not: örnekler ve reaktifler kurumayı önlemek ıslak kağıt havlu ile astarlanmış bir nemlendirilmiş oda içinde Bütün inkübasyonlar, gerçekleştirmek için.

1. De-paraffinization ve doku bölümleri rehidrasyon
   1. Parafin bloklardan 4 mikron kalınlığında doku bölümleri hazırlayın. Formalin, paraformaldehit ve çinkoya-dayalı sabitleyici bu protokol ile uyumludur.
   2. DEPC arıtılmış su kullanılarak tüm reaktifler hazırlayın.
   3. 30 dakika boyunca 60 ° C 'de kuru bir fırın içinde ısı slaytlar ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar inkübe edin.
   4. 5 dakika üç kez% 100 ksilen slaytlar daldırın; Taze ksilen, her zaman kullanın.
      Not: Bir kimyasal davlumbaz, bu de-ağda işlemi yapın.
   5. Iki kez 5 dakika% 100 etanol içinde slaytlar bırakın, her zaman taze etanol kullanılarak, ve her biri 5 dakika için seri% 90 örnekleri,% 80 ve% 70 etanol çözüm rehidrate.
   6. 1 dakika süre ile, DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar daldırın ve 6 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS (pH 7.4) içinde slaytlar yıkayın.
2. Doku bölümlerinin ön işlemler
   1. 20 dakika için 0.1 N hidroklorik asit içinde slaytlar daldırın ve 30 saniye süreyle DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar yıkayın.
   2. Bir mum kalem kullanarak örnekleri çevreleyen bir hidrofobik bariyer çizin.
      Not: bir hidrofobik bariyer boyutu örneklerinin büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, aşağıdaki aşamalarda kullanılan reaktif miktarları örneklerinin boyutuna bağlı olarak, ancak hy doldurmak zorunda değişirdrophobic bariyer (küçük numuneler için 50 ul ve büyük numuneler için 400 ul).
   3. 30 dakika için 37 ° C 'de kuru bir fırında proteinaz K (1-10 ug mi ^-1 DEPC ile muamele edilmiş, PBS içinde) ve 50-400 ul numune tedavi ve 1 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş 1 x PBS içinde slaytlar yıkayın.
   4. 10 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde slaytlar bekletin, daha sonra 1 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS slaytlar yıkayın.
   5. 0.1 M trietanolamin-HCl, 20 dakika boyunca% 0.5 asetik anhidrit içeren (pH 8.0) slaytlar ıslatın ve 30 saniye için DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar yıkayın.
3. Prob ve yıkama ile hibridizasyon
   1. 20 dakika boyunca 2x SSC tamponu slaytlar bırakın.
   2. Hibridizasyon tamponu içinde ul ^-1 1 ng (4x SSC probu ile seyreltilir,% 50 [hacim / hacim] formamid, 1 x Denhardt çözeltisi,% 10 [ağırlık / hacim] dekstran sülfat,% 0.1 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat, 0.4 mg mi ^-1 salmon sperm DNA'sı). Negatif kontroller için, ile etiketlenmiş prob karışımıolmayan işaretli prob, bir 10-kat fazla miktarda.
   3. Seyreltilmiş probları denatüre ve doku bölümleri üzerine 50-400 ul uygulayın. Slaytta bir kapak kayma yerleştirin ve oje ile mühür.
   4. 45 ° C veya en uygun ısıda nemlendirilmiş bir odacık O / N 10 dakika boyunca 90 ° C 'de, PCR makinesi ısı slaytlar ve inkübe slaytlar aşama 1.4.11 de tespit edilmiştir.
   5. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de slaytlar soğutun kapak slipi kaldırmak ve aşağıdaki gibi, bir seri SSC tamponu slaytlar sokmak: 4x SSC 10 dakika, önceden ısıtılmış (45 ° C) 2 x SSC, 20 dakika, 2 x SSC, 10 için dakika ve 10 dakika süre ile 0.2x SSC.
4. Anti-DIG AP-konjüge edilmiş antikor ile tespit
   1. 5 dakika boyunca MABT slaytlar yıkayın.
   2. 20 dakika boyunca,% 1 Tween 20 ile bloklama çözeltisi 50-400 ul engeller.
   3. Çözeltisi (1: 1000) bloke içinde seyreltilmiş anti-DIP-AP antikoru 50-400 ul ekle anld 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. 10 dakika boyunca MABT slaytlar yıkayın.
   5. 5 dakika boyunca% 1 Tween 20 içeren algılama tamponu slaytlar bırakın.
   6. Μ 1 mM levamisol endojen alkalin fosfataz inaktive edilmesi için 5 dakika için (% 1 Tween 20 içeren saptama tamponu içinde) 50-400 ile tedavi edin.
   7. (1 bulgulama tamponu içinde seyreltilmiş 100) önceden karıştırılmış NBT / BCIP çözeltisi 50-400 ul dağıtma Her örnek üzerinde ve gelişmiş sinyal tatmin kadar 2 ila 3 saat boyunca oda sıcaklığında nemli bir haznede slaytlar inkübe edin.
   8. Görselleştirme durdurmak ve 10 dakika için 37 ° C 'de% 0.05 bir karşı leke olarak [ağırlık / hacim] metil yeşili 50-400 ul uygulamak için de-iyonize edilmiş su ile slaytlar durulayın.
   9. % 100 etanol içinde dehidre, de-iyonize su ile slaytlar durulayın ve ksilen batırın.
   10. Her bir slayt üzerine montaj çözümü 80 ul uygulayın ve kapak slipleri ile kaplayın.

Şekil 1 hassasiyetini belirlemek için sette bulunan pozitif kontrol probu ile karşılaştırıldığında DIG etiketli probları nokta blotlama. 343 bp P. gingivalis spesıfik sonda 70 bp eubacterial prob 25 kat daha hassastır. P. tespiti için kronik periodontitisli hastalardan elde edilen dişeti dokularının in situ hibridizasyon 2 gösterileri Şekil gingivalis ve Eubacteria. mor gösterilen bakteriyel sinyaller, doku dışında bulunan epitel, lamina propria ve biyofilm içinde tespit edildi. Bununla birlikte, P. dağılımı gingivalis ve dişeti dokusu içinde Eubacteria farklıydı. Sadece çubuk şekilli bakteriler P. tarafından tespit edildi ise bakterilerin yüksek büyütme (1,000X), çeşitli şekillerde (kok, çubuk, fusiform ve tüylü formda) olarak, eubacterial prob kullanılarak görünür gingivalis -spesifik sonda. Bakteriyel sinyalleri dağılmış biçimlerigözlemlendi.

Hajishengallis ve diğ. P. gelişiminde bakterilere temel rolünü göstermiştir gingivalis farelerde ¹⁴ deneysel periodontitis -kaynaklı. dekstran sülfat sodyum uygulaması (DSS), dişeti mukoza kaynaklı periodontitis ve fareler ¹³ alveol kemik kaybı üzerine sıkı bir kavşak (TJ) -disrupting kimyasal. eubacterial sonda başarıyla P. tarafından tespit edilmedi DSS grubundan dişeti dokuları içinde bakteri tespit gingivalis spesıfik prob (Şekil 3).

eubacterial sondanın, diğer hastalıklarda bakteri potansiyel katılımı çalışma için yararlıdır. Ben mide kanseri ¹⁵ kanserojen notu olarak Helicobacter pylori belirlenen Kanser Araştırma Uluslararası Ajansı yana, diğer kanserlerin gelişmesinde bakterilerin potansiyel katılımı yaygın çalışılmıştır. Ne zaman seskuamöz hücre karsinoması teşhisi konmuştur, akciğer biyopsisi seksiyonlar eubacterial probu ile hibridize yerinde duran, bakteriler de uygulanmıştır eubacterial probu kullanılarak in situ melezleme. (Şekil 4) infiltre edilen hücrelerin / tümör hücreleri içinde ve çevresindeki stromal arasında hem de tespit edilmiştir Oral liken planus, etiyolojisi bilinmeyen inflamatuar immün hastalık lezyonlarında bakterilerin varlığını araştırmak. İlginçtir, bakteriyel sinyaller epitel içinde değil, aynı zamanda bant şeklinde infiltrasyon gözlendi lamina propria değil sadece tespit edildi. Yüksek büyütme altında, bakteriyel sinyaller birçok hücre (Şekil 5) çekirdeklerinde tespit edildi.

Şekil 1. duyarlılık DIG etiketli problar test edilmesi. Seri olarak seyreltilmiş özel etiketli probları ve pozitif Contrkitte sağlanan ol prob nokta anti-DIP-AP-konjüge edilmiş antikor ile lekelenir. P., leke substratı ilave edildikten sonra eubacterial prob ile leke 1 dakika için geliştirilen iken gingivalis spesıfik sonda, 30 saniye için geliştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kronik periodontitisli hastalardan alınan dişeti dokularının içindeki bakterilerin Şekil 2. Algılama. Sağlıklı bir sitede (A) ve periodontitis bir hastanın hastalıklı sitesinden (B) dişeti biyopsi bölümleri hematoksilen-eozin tabi tutuldu (H & E) boyama ya da ya da P. in situ hibridizasyon gingivalis spesıfik sonda veya eubacterial prob. NegativE kontrol 10-kat fazla etiketsiz prob ile karıştırılır probu ile çaprazlanır. büyütülmüş alan kare kutu ile gösterilir. Mor gösterilen Temsilcisi olumlu sinyaller, ince oklarla işaretlenmiştir. Kalın oklar doku dışında plak biyofilm göstermektedir. 1,000X büyütmede incelendi plak biyofilm iç metinleri gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Algılama fare dişeti dokusu içinde, oral ortakçı bakteri Şekil 3.. Deneysel periodontitis P. oral aşılama ile, BALB / c farelerinde indüklenmiştir gingivalis (Pg) ya da dişeti mukozasının üzerine DSS uygulama. Farelerden Dişeti bölümleri ile ya situ hibridizasyon H & E boyama veya maruz kaldılar < em> P. gingivalis spesıfik sonda veya eubacterial prob. Mor gösterilen Temsilcisi olumlu sinyaller, oklarla işaretlenmiştir. Orijinal büyütme x400 olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kanser lezyon içinde bakteri Şekil 4. belirlenmesi. Skuamöz hücre karsinoması teşhisi konmuştur hastaların akciğer biyopsisi kesitleri H ve E ile ya da evrensel eubacterial sonda veya negatif kontrol probu ile ya hibridize olarak in situda boyanmıştır. büyütülmüş alan kare kutu ile gösterilir. Mor gösterilen Temsilcisi olumlu sinyaller, oklarla işaretlenmiştir. Tümör hücrelerinin Sınır noktalı çizgiler ile gösterilmiştir.arget = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Oral liken planus lezyonları içinde bakteri Şekil 5. tespiti. Oral liken planus tanısı yanak mukozasından alınan biyopsi bölümleri H & E ile ya da evrensel eubacterial sonda veya negatif kontrol probu ile ya hibritlenmiş yerinde boyandı. büyütülmüş alanlar kare kutu ile gösterilir. Mor gösterilen Temsilcisi olumlu sinyaller, oklarla işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Burada bir protokol tarif edilmiştir, DIG etiketli bir DNA probu kullanılarak parafine gömülü doku içindeki bakteri yerelleştirilmesine. Prob bakteriyel 16S rRNA geninin DNA ya da RNA moleküllerini hedef ve 16S rRNA hedefleme problar ya da türe spesifik ya da evrensel olarak dizayn edilebilir. P. spesifik hibridizasyon P. gingivalis -spesifik prob gingivalis ancak diğer ağız bakterileri daha önce ¹⁰ gösterilmiştir. Hibridizasyon etkinliği ¹² farklı olsa da aksine, eubacterial prob, test edilen tüm bakteriyel genomik DNA (17, farklı türler) hibridize. prob içinde, T-nükleotid sayısı DIG etiketleme etkinliğini belirler. Yüksek hassasiyet, DIG-etiketli prob üretimi tarif edilen protokol başarılı bir şekilde uygulanması için en önemli bir adımdır. Hidroklorik asit ile örneklerin tedavisi proteinleri ve kısmi hydrolysi ekstraksiyonu vasıtasıyla sinyal-gürültü oranını iyileştirirhedef dizilerin s. Proteinaz K konsantrasyonunda bir artış prob, hedef ulaşmak artırır ancak doku korunmasını azaltır. Bu nedenle, doku türlerine bağlı olarak, proteinaz K çeşitli konsantrasyonları test etmek için önerilmektedir. asetilasyon adımı arka pozitif yüklü amino grupları asetile ederek doku proteinlerine negatif yüklü probun bağlanması azalır. Bu preparat bir dizi aşama sonra, doku kesitleri, böylece kolayca gözyaşı dikkatle ele alınması gerekir. Arkaplan FISH ile karşılaştırıldığında çok az. Bununla birlikte, bu kemik ve mukus bezleri gibi yüksek bir endojen alkali fosfataz etkinliği olan dokulardan sinyaller kritik yorumlanmalıdır.

PCR ile amplifiye edilmiş DNA probları RNA probları ile karşılaştırıldığında üretmek kolaydır ve stabildir. , Epitel: hibritlenmiş prob immünohistokimyasal tespiti H & E boyanan kesitler ile karşılaştırıldığında yoluyla histolojik yapıların belirlenmesini sağlarbağ dokusu, enflamatuar infiltrasyon ve kan damarlarının iyi ayırt edilirler. Açıklanan protokol sınırlamaları biri aynı anda birden fazla probları uygulamak için yetersizliğidir. Buna ek olarak, bölümlerin yüzeyinde bakteriyel kirleticiler gelen sinyallerin dışlama sınırlıdır.

Bu protokol, doku bölümleri ¹⁶ içinde diğer bakteriyel transkript tespit etmek için adapte edilebilir. Buna ek olarak, bu protokol, bir konakçı hücre markeri immünohistokimyasal tespiti ile boyama çift için genişletilebilir.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibe (2013R1A1A3005669) ve Kore Sağlık Teknoloji Ar-Ge Projesi, Sağlık ve Refah Bakanlığı hibe (HI13C0016) tarafından desteklenmiştir.