16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

박테리아는 치주염, 치수염, pericoronitis, 봉와직염, 골수염과 같은 다양한 구강 질환의 병인에 중요한 역할을한다. 질병의 발병 기전에서 세균의 역할을 이해하고 치료의 효과를 모니터링하기 위하여, 조직 내의 박테리아의 현지화 중요하다. 치주염 환자의 치은 조직 내의 박테리아의 존재는 fluorescence-를 사용하여 계내 혼성화 (FISH) ⁸ 전자 현미경 ^1,2, 면역 조직 화학 및 면역 이용한 박테리아 특이 항체 ^3-7 및 형광체를 포함하여, 다양한 방법을 이용하여 도시 한 16S rRNA의 타겟팅 된 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법은 널리 기술적 한계 나 어려움에 사용되지 않습니다. 항체와 비교하는 16s rRNA를 타겟팅 프로브 생산 종 특이성을 달성하기 쉽다. 물고기는 BACT의 시각화를위한 훌륭한 도구가 될 입증되었습니다이러한 플라크 바이오 필름 등의 자연 환경에서 eria. 그러나, 조직 샘플에 대한 FISH의 적용으로 인해 다양한 조직 성분의자가 형광에 한정된다. 그들은 ^{9 출혈} 것을 포함 할 때, 예를 들어, 적혈구의 강한 형광도는 종종 염증 조직으로 형광 기술의 적용을 방해.

염증 잇몸 조직 내의 박테리아를 지역화하기 위해, 따라서, 디곡 시게 닌을 사용하여 동일계에서 혼성화 방법 (DIG) 표지 된 DNA 프로브를 개발되었으며 ^10,11 성공적으로 ^적용 하였다. 피를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 현지화에 대한 다음은 상세한 프로토콜 진지 발리 - 특정 보편적 eubacterial 프로브는 설명 하였다. 이것은 특히 유사한 결과가 다른 실험실에서 재현 될 수 있도록하는 방법의 표준화에 집중된다. 이 프로토콜은 자신의 조직 학적 상황과 resu 내 박테리아의 현지화를 할 수 있습니다LTS는 높은 재현성 있습니다. 설명 프로토콜은 어느 다양한 조직에서 종 특이 또는 범용 방식 박테리아 지역화하는데 사용될 수있다. 범용 프로브는 polymicrobial 질환 박테리아를 검출하고 특정 박테리아의 역할을 알 수없는 경우 질병에 박테리아의 잠재적 인 역할을 연구하는 데 특히 유용합니다.

1. 프로브 준비

1. 프로브의 PCR 증폭
   1. 피하십시오 gingivalis에 특이적인 프로브는, P.의 343 bp의 DNA 단편을 증폭 P.의 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 16S rRNA를 진지 발리 진지 발리 다음 프라이머 : 5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 '과 5'-ACT GCC CGT CGT ATC TAT ^TC-3'10. 다음 사이클 조건 증폭을 수행 35주기를 95 ℃에서 30 초, 30 초, 60 ° C, 72 °에서 5 분 연장 한 다음 1 분 20 초 72 ° C C ^{(10, 11)에} 대해.
   2. 70 bp의 DNA 절편 (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG를 사용하여 프로브를 증폭 eubacterial
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 '올리고 뉴클레오티드 프라이머를 다음과 같이 합성) : 5'-CAG CTG GTR GGY ^CMT-3'11 5'-AGG GCG GTT GTT CTC-3. 다음 사이클 조건을 증폭를 수행 : 40주기를30 초 30 초 9 4 ℃, 60 ℃, 1 분 72 ℃에서 ^{11, 12에서} 5 분 연장 한 다음 20 초 동안 72 ° C에서.
   3. 2 시간 동안 -20 ° C에서 배양 한 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) 및 (: 1의 비율이 10에서) 100 % 에탄올을 첨가하여 PCR 제품 (≥500 μL)을 침전.
   4. 원심 혼합물을 15 분 동안 14,000 XG에, TE 완충액 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁하고 260 nm에서 흡광도에 의해 DNA 농도를 측정한다.
2. DIG DNA 표지 및 검출 키트를 사용하여 DIG는-라벨
   1. 15 μL의 최종 부피 물로 프로브 3㎍을 섞는다.
   2. 10 분 동안 95 ° C에서 DNA 변성 빨리 얼음에 진정.
   3. 10 배 hexanucleotide 믹스 2 μL,의 dNTP - 라벨 믹스 2 μL 및 변성 된 DNA의 15 μL에 클레 나우 효소 1 μl를 추가합니다.
   4. 혼합하고 48 시간에 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하고 65 ℃에서 가열하여 반응을 중지합니다.
3. DIG DNA 라벨링 및 검출 키트를 사용하여 DIG 표지 된 프로브의 민감도를 확인
   1. 수동 RT에서 5 분간 키트에 양성 대조군 프로브의 희석액 1 μL 및 나일론 막에 DIG 표지 된 프로브의 1 NG 건조로드.
   2. 간단히 배 SSC 버퍼 (0.3 M의 NaCl, 30 mM의 시트르산 나트륨, pH를 7.0)에 담가 멤브레인 DNA 고정화, 1 시간 동안 80 ° C에서 배양 한 멤브레인.
   3. 간단히 말레 산 버퍼 (MAB, 0.1 M 말레 산, 0.15 M의 NaCl, pH를 7.5)를 막 담가 및 안티 DIG 알칼리 포스 파타 아제 컨쥬 게이트 항체를 희석 (AP)와 함께 품어 : 제공된 차단 솔루션의 6 ml의 (1 5,000) 실온에서 30 분 동안 키트.
   4. MABT (MAB 1 % 트윈 20을 포함)와 멤브레인을 씻고 상에 2 ml의 검출 버퍼 (0.1 M 트리스 - 염산, 0.1 M의 NaCl, 0.05 M의 MgCl _2, pH를 9.5)와 혼합 NBT / BCIP 용액 40 μl를 적용 1 분 동안 막. 표지 된 프로브의 감도이면만족하지, 1.1.3에서 1.3.4로 단계를 반복합니다.
   5. 표지 프로브 (OD260)의 DNA 농도를 측정 ng를 100 μL의 농도를 조정 ^-1.
4. DIG 표지 프로브의 특이성을 확인
   1. 게놈 DNA 샘플을 변성 10 분 동안 95 ° C에서, 특정 프로브의 대상이 박테리아 등 다양한 박테리아 종에서 (25 세 μL ^-1 각 샘플 당을 ng를) 빠르게 얼음에 진정.
   2. 수동으로 실온에서 20 분 동안 변성 나일론 막에 DNA와 건조를로드합니다.
   3. 간단히 배 SSC 버퍼 막을 담가 DNA 고정화 2 시간 동안 80 ° C에서 배양 한 멤브레인.
   4. 1 시간 동안 실온에서 차단 용액으로 차단 막.
   5. 혼성화 완충액에 희석 된 프로브를 변성하고, 막에 적용 μL ^-1 1 NG에 프로브를 희석.
   6. 1 시간 동안 45 ° C에서 막을 인큐베이션.
   7. 멤브레인을 씻으 세배 SSC 버퍼와 시간.
   8. 간단히 MAB에 담가 멤브레인.
   9. 1 시간 동안 실온에서 차단 용액 6 ㎖에 (000 1) 희석 항 DIG AP 공역 항체와 인큐베이션.
   10. MABT으로 막을 세척하고 2 ml의 검출 버퍼와 혼합 NBT / BCIP 용액 40 μl를 적용합니다.
   11. 프로브는 특이성을 달성 할 것으로 예상되지 않을 때 특이성이 관찰 될 때까지, 혼성화 온도를 증가시킨다.

현장 하이브리드 2.

참고 : 시료 및 시약의 건조를 방지 젖은 종이 타월로 줄 지어 가습 실에있는 모든 배양을 수행 할 수 있습니다.

1. 탈 paraffinization와 조직 절편의 재수
   1. 파라핀 블록에서 4 μm의 두께 조직 섹션을 준비합니다. 포르말린, 파라 포름 알데히드, 아연 기반의 정착이 프로토콜과 호환됩니다.
   2. DEPC 처리 된 물을 사용하는 모든 시약을 준비합니다.
   3. 30 분 동안 60 ° C에서 건조 오븐에서 열 슬라이드와 30 분 동안 RT에서 슬라이드를 배양.
   4. 5 분 3 회 100 % 크실렌 슬라이드 담가; 신선한 크실렌 때마다 사용합니다.
      참고 : 화학 물질 흄 후드이 드 왁싱 절차를 수행합니다.
   5. 회 5 분 동안 100 % 에탄올에 담가 슬라이드마다 신선한 에탄올을 사용하고, 5 분마다 90 %에서 일련의 시편, 80 % 및 70 % 에탄올 용액을 재수.
   6. 1 분 동안 DEPC 처리 된 물에 슬라이드를 담그고 6 분 동안 DEPC 처리 된 PBS (PH 7.4)에 슬라이드를 씻으십시오.
2. 조직 절편의 전처리
   1. 20 분 동안 0.1 N 염산에 슬라이드를 담그고 30 초 동안 DEPC 처리 된 물에 슬라이드를 씻으십시오.
   2. 왁스 펜을 사용하여 표본을 둘러싼 소수성 장벽을 그립니다.
      참고 : 소수성 장벽의 크기는 표본의 크기에 따라 달라집니다. 따라서, 다음 단계에 사용되는 시약의 양을 시료의 크기에 의존하지만 HY을 작성할 필요가 달라drophobic 장벽 (작은 시편 50 μL 큰 시편 400 μL).
   3. 30 분 동안 37 ℃에서 건조 오븐에서 단백질 분해 효소 K (1 ~ 10 μg의 ml의 ^-1 DEPC 처리 된 PBS에)의 50-400 μL로 표본을 치료하고 1 분 동안 DEPC 처리 1X PBS에서 슬라이드를 씻으십시오.
   4. 10 분 동안 DEPC 처리 된 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드에 슬라이드를 만끽 한 후 1 분 동안 DEPC 처리 된 PBS에 슬라이드를 씻으십시오.
   5. 0.1 M 트리에탄올 아민 염산 20 분 동안 0.5 % 무수 초산을 포함하는 (PH 8.0)에 슬라이드를 담가 30 초 동안 DEPC 처리 된 물에 슬라이드를 씻으십시오.
3. 프로브 및 세척과 교잡
   1. 20 분 동안 2 배 SSC 버퍼에 슬라이드를 담가.
   2. 혼성화 완충액 μL ^-1 1 NG (4X SSC에서 프로브 희석 50 % [의 부피 / 부피] 포름 아미드, 1X 덴 하르트 용액, 10 % [중량 / 부피] 황산 덱스 트란, 0.1 % [중량 / 부피 나트륨 도데 실 설페이트, 0.4 mg을 ml의 ^-1 연어 정자 DNA). 음성 대조군의 경우와 표지 프로브를 혼합비 표지 프로브의 10 배 과량.
   3. 희석 된 프로브를 변성 및 조직 섹션에 50-400 μl를 적용합니다. 슬라이드 커버 슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉.
   4. 45 ° C 또는 최적의 온도에서 가습 실 O / N에서 10 분 동안 90 ° C에서 PCR 기계에 열 슬라이드와 부화 슬라이드 단계 1.4.11에서 결정.
   5. 30 분 동안 4 ℃에서 슬라이드 쿨 커버 슬립을 제거하고, 다음과 같은 일련 SSC 버퍼에 슬라이드 젖어 : 4X SSC를 10 분, 예열 된 (45 ℃) 2 × SSC를 위해 20 분 동안 2 배 SSC를 10 분 및 10 분 동안 0.2X SSC.
4. 안티 DIG AP-복합 항체 검출
   1. 5 분 동안 MABT에 슬라이드를 씻으십시오.
   2. 20 분 동안 1 % 트윈 20 용액으로 블로킹 50~400 μL하는 블록.
   3. 솔루션 (1 : 1,000) 차단에 희석 방지 DIG-AP 항체의 50-400 μl를 추가 anld 90 분 동안 37 ° C에서 품어.
   4. 10 분 동안 MABT에 슬라이드를 씻으십시오.
   <리> 5 분 동안 1 % 트윈 20을 함유하는 검출 버퍼에 슬라이드를 담근다.
   5. μ 1 밀리미터의 levamisole의 내인성 알칼리 포스파타제를 실활 5 분간 (1 % 트윈 20을 함유하는 검출 버퍼) 50~400로 처리.
   6. (1 검출 완충액에 희석 : 100) 예 혼합 NBT / BCIP 용액 50~400 μL 분배 각 시험편 상 및 개발 신호가 만족 될 때까지 2 내지 3 시간 동안 실온에서 습윤 챔버에서 슬라이드를 배양한다.
   7. 시각화를 중지하고 10 분 동안 37 ° C에서 0.05 % 카운터 스테인 같이 중량 / 부피] 메틸 녹색의 50~400 μL를 적용하는 탈 이온수로 슬라이드를 씻어.
   8. 100 % 에탄올 탈수, 탈 이온수와 슬라이드를 씻어, 자일 렌에 몰입.
   9. 각각의 슬라이드에 장착 솔루션의 80 μl를 적용하고 커버 슬립 커버.

도 1에 도시 한 민감도를 결정하는 키트에 양성 대조군 프로브에 비해 DIG 표지 된 프로브의 도트 블 롯팅. 343 bp의 P. 진지 발리 - 특정 프로브는 70 bp의 eubacterial 프로브보다 25 배 더 민감하다. (P)의 검출을위한 만성 치주염 환자에서 얻은 치은 조직의 현장 하이브리드의 2는 그림 진지 발리과 진정 세균. 바이올렛에 도시 세균 신호는, 외부에있는 조직 상피, 점막 고유 및 생물막 내에서 검출되었다. 그러나, 경찰의 분포 진지 발리와 치은 조직 내에서 진정 세균은 달랐다. 만 막대 모양의 세균이 피에 의해 감지 동안 박테리아의 높은 배율 (배, 1000 배), 다양한 모양 (구균,로드, 방추형, 털이 양식)에서, eubacterial 프로브를 사용하여 볼 수 있었다 진지 발리 - 특정 프로브. 박테리아 신호의 분산 형태또한 관찰되었다.

Hajishengallis 등. P. 개발의 공생 세균의 필수적인 역할을 입증 진지 발리 쥐 ¹⁴ 실험 치주염을 유도 된. 덱스 트란 황산 나트륨의 응용 프로그램 (DSS), 치은 점막 유도 치주염와 마우스 ¹³ 치조골 손실 상에 꽉 접합 (TJ) -disrupting 화학,. eubacterial 프로브는 성공적으로 경찰에 의해 검출되지 않았다 DSS 그룹에서 치은 조직 내에서 세균 검출 진지 발리 - 특정 프로브 (그림 3).

eubacterial 프로브는 다른 질병에 박테리아의 잠재적 인 참여의 연구에 유용하다. 내가 위암 ¹⁵ 발암 물질 등급으로 헬리코박터 파이로리 지정된 국제 암 연구소 때문에, 다른 암의 개발에 박테리아의 잠재적 인 참여는 널리 연구되고있다. 때 그 자체편평 세포 암으로 진단 폐 생검 ctions가 eubacterial 프로브와 하이브리드 시츄 있었다 박테리아는 또한인가 된 eubacterial 프로브를 사용하는 계내 혼성화한다. (도 4) 세포에 침투 / 종양 세포 내 및 주변 기질 사이를 모두 검출 하였다 구강 편평 태선, 알 수없는 원인으로 염증성 면역 질환의 병변에서 박테리아의 존재를 탐구한다. 흥미롭게도, 세균성 신호 상피 내에 아니라 띠형의 침윤이 관찰되었다 점막 고유 층에서뿐만 아니라 검출 하였다. 높은 배율에서 박테리아 신호는 많은 세포 (그림 5)의 핵 검출되었다.

그림 1. 감도 DIG 표지 프로브 테스트. 직렬 희석 정의 표지 프로브와 긍정적 인 제어 방식키트에 제공된 OL 프로브는 점 방지 DIG-AP-복합 항체로 얼룩진했다. P.으로, 오점 기판을 첨가 한 후 eubacterial 프로브 오점이 1 분을 위해 개발하는 동안 진지 발리 - 특정 프로브, 30 초 동안 개발되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

만성 치주염 환자에서 얻은 치은 조직 내에서 박테리아의 그림 2. 탐지. 건강한 사이트 (A)와 치주염 환자의 병에 걸린 사이트 (b)와 치은 조직 검사의 섹션을 헤 마톡 실린 - 에오신을 실시 하였다 (H & E) 염색 또는 하나 피와 현장 하이브리드에 진지 발리 - 특정 프로브 또는 eubacterial 프로브. Negativ전자 제어는 10 배를 초과하는 레이블이없는 프로브와 혼합 프로브와 하이브리드했다. 확대 된 영역은 사각형 상자로 표시됩니다. 보라색에 표시된 대표 긍정적 인 신호는, 얇은 화살표로 표시됩니다. 두꺼운 화살표는 조직 외부 플라크 생물막을 나타냅니다. 1000 배의 배율로 조사 플라크 바이오 필름이 세트에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

탐지 마우스의 잇몸 조직 내에서 구강 공생 박테리아의 그림 3. 실험 치주염은 피 경구 접종에 의해 BALB / c 마우스에서 유도 진지 발리 (대학원) 또는 치은 점막 위에 DSS의 응용 프로그램입니다. 마우스의 잇몸 섹션 중 하나와 함께 현장 하이브리드 H & E 염색 또는에서 실시 하였다 < EM> P. 진지 발리 - 특정 프로브 또는 eubacterial 프로브. 보라색에 표시된 대표 긍정적 인 신호는 화살표로 표시됩니다. 원래 배율 X 400입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

암 병변 내에서 박테리아의 그림 4. 감지. 편평 상피 세포 암으로 진단 된 환자에서 폐 생검의 섹션은 H & E 또는 보편적 eubacterial 프로브 또는 음성 대조군 프로브 중 하나와 하이브리드 현장에서 염색 하였다. 확대 된 영역은 사각형 상자로 표시됩니다. 보라색에 표시된 대표 긍정적 인 신호는 화살표로 표시됩니다. 종양 세포의 테두리가 점선으로 표시됩니다.arget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

구강 편평 태선의 병변 내에서 박테리아의 그림 5. 탐지. 구강 편평 태선으로 진단 구강 점막에서 조직 검사의 섹션은 H & E 또는 보편적 eubacterial 프로브 또는 음성 대조군 프로브 중 하나와 하이브리드 현장에서 염색 하였다. 확대 지역은 사각형 상자로 표시됩니다. 보라색에 표시된 대표 긍정적 인 신호가, 화살표로 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기서 프로토콜 설명 하였다 DIG 표지 된 DNA 프로브를 사용하는 파라핀 포매 조직 내의 박테리아를 지역화. 프로브는 세균 16S rRNA 유전자의 DNA 또는 RNA 분자를 표적으로하고, 16S rRNA의 타겟팅 프로브는 어느 종 특이 또는 범용으로 설계 될 수있다. (P)의 구체적인 하이브리드 경찰에 진지 발리 - 특정 프로브 진지 발리 아니라 다른 구강 박테리아는 이전에 ^(10)를 보였다. 혼성화 효율이 ¹² 변할지라도 대조적 eubacterial 프로브는, 테스트 한 모든 박테리아 게놈 DNA (17 종)로 혼성화. 프로브 내의 T 뉴클레오티드의 수는 DIG 라벨링의 효율을 결정한다. 고감도 DIG 표지 된 프로브의 제조는 기술 된 프로토콜의 성공적인 구현을위한 가장 중요한 단계이다. 염산으로 시편의 치료 단백질 및 부분적 hydrolysi 추출 통해 신호대 잡음비를 향상표적 서열의 S. 단백질 분해 효소 K의 농도의 증가는 프로브의 대상 접근성을 증가하지만 조직 보존을 줄일 수 있습니다. 따라서, 조직의 종류에 따라, 프로 테이나 제 K의 여러 농도를 테스트하도록 권장한다. 아세틸 화 단계는 배경이 양전하 아미노기를 아세틸 화하여 조직의 단백질 음전하 프로브의 결합을 감소시킨다. 이 준비 단계의 일련 후에 조직 절편, 따라서 쉽게 찢어 조심스럽게 취급되어야한다. 배경은 물고기에 비해 최소이다. 그러나, 뼈 및 점액 분비의 높은 내 재성 알칼리 포스 파타 아제 활성을 갖는 조직으로부터의 신호는 매우 폭넓게 해석되어야한다.

PCR 증폭 된 DNA 프로브 RNA 프로브에 비해 제조하기 쉽고 안정적​​이다. , 상피 : 하이브리드 프로브의 면역 검출은 H & E 염색 섹션과의 비교를 통해 조직 학적 구조를 식별 할 수 있습니다결합 조직, 염증성 침윤 및 혈관은 잘 구별된다. 설명 된 프로토콜의 제한 중 하나는 동시에 여러 개의 프로브를 적용 할 수 없다는 것이다. 또한, 단면의 표면에 세균 오염 물질로부터의 신호를 배제 제한된다.

이 프로토콜은 조직 절편 ⁽¹⁶⁾ 내에서 다른 박테리아 사체를 검출하도록 구성 될 수있다. 또한,이 프로토콜은 숙주 세포 마커의 검출 면역 염색 배로 확장 할 수있다.

저자가 공개하는 게 없다.

본 연구는 한국 연구 재단에서 보조금 (2013R1A1A3005669)와 한국 보건 기술의 R & D 사업, 보건 복지부의 허가 (HI13C0016)에 의해 지원되었다.