原位检测使用地高辛标记的DNA探针石蜡包埋组织中的细菌靶向16S rRNA基因

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

菌发挥各种口腔疾病如牙周炎，牙髓炎，冠周炎，蜂窝组织炎，骨髓炎的病因中起作用。为了了解细菌在疾病的发病机制中的作用，并监测治疗的效果，在组织内的定位的细菌是重要的。细菌牙龈组织内与牙周炎的存在从患者已经使用各种方法被证明，包括使用荧光-电子显微镜^1,2，免疫组织化学和免疫荧光细菌特异性抗体^3-7，和荧光原位杂交^（FISH）8标记的寡核苷酸探针靶向16S rRNA基因。然而，这些方法都没有得到广泛由于技术限制或困难使用。与抗体相比，靶向16S rRNA基因的探针是容易产生和实现的种特异性。鱼已被证明是一个极好的工具BACT的可视化ERIA在其天然环境中，如菌斑生物膜。然而，应用FISH对组织样品是由于各种组织成分的自体荧光的限制。例如，红血细胞的强的自体荧光常常妨碍荧光技术对发炎组织的应用程序时，它们涉及出血^9。

为了在发炎的牙龈组织内细菌定位，因此，使用地高辛原位杂交法（DIG）标记的DNA探针已经开发并成功应用^10,11。这里细菌利用P.石蜡包埋组织内的本地化的详细协议牙龈特异性和通用的真细菌的探针进行了说明。它特别着重于方法，使得类似的结果可以在其他实验室被再现的标准化。该协议允许他们组织上下文和RESU内细菌的定位LTS是高度可重复的。所描述的协议可以用于无论是在各种组织中的一种特异性或通用方式细菌本地化。的通用探针是特别有用的，以检测多微生物疾病的细菌，并研究细菌的潜在作用，在疾病，其中具体的细菌的作用是未知的。

1.探针制备

1. 探针的PCR扩增
   1. 为P.牙龈特异性探针，放大P的343 bp的DNA片段牙龈 16S通过PCR使用P的基因组DNA的rRNA 牙龈和下列引物:5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3'和5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT ^TC-3'10。用下面的循环条件进行扩增:35个循环的95℃30秒，60℃30秒，和72℃进行1分20秒，然后用5分钟延伸^{72℃，10,11。}
   2. 使用70-bp的DNA片段（5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG扩增真细菌探头
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3'）合成的寡核苷酸和下列引物:5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3'和5'-AGG GTT GCG CTC ^GTT-3'11。用下面的循环条件进行扩增:40个循环在9 4℃，30秒，60℃30秒和72℃1分钟20秒，然后用5分钟延伸^{72℃，11,12。}
   3. 并在-20℃下温育2小时，加入3M乙酸钠（pH 5.2）和100％乙醇（:1 2的比例在10）沉淀的PCR产物（≥500微升）。
   4. 离心机将混合物在14000×g离心15分钟，重新悬浮于100μlTE缓冲液中的沉淀物，并测量260nm处光密度的DNA浓度。
2. 使用DIG DNA标记和检测试剂盒DIG标签
   1. 拌3微克探针与水的15微升的最终体积。
   2. 使DNA变性在95℃下进行10分钟，并迅速变冷冰上。
   3. 加入2微升10X六核苷酸组合，2微升的dNTP标记组合，和1微升克列诺酶以15微升的变性DNA。
   4. 混合并在37℃进行24小时至48小时，并停止反应加热到65℃。
3. 检查该DIG标记的探针使用DIG DNA标记和检测试剂盒的灵敏度
   1. 手动加载1微升阳性对照探针的试剂盒中提供连续稀释和1ng对尼龙膜中的DIG标记的探针，并干燥5分钟，在室温。
   2. 简要地浸泡的膜在2×SSC缓冲液（0.3M NaCl的30 mM柠檬酸钠，pH 7.0）中孵育该膜在80℃下1小时，以将DNA固定。
   3. 简要地浸泡在膜中的马来酸缓冲液（MAB，0.1M马来酸，0.15M氯化钠，pH值7.5）中，用抗DIG碱性磷酸酶（AP）缀合的抗体稀释孵育（1:5,000）在6ml封闭溶液提供在试剂盒中，在室温搅拌30分钟。
   4. 与MABT（含1％吐温20，MAB）洗膜，并应用40微升的NBT / BCIP溶液用2ml检测缓冲液（0.1M的Tris-HCl，0.1M氯化钠，0.05M的_氯化镁 ，pH 9.5）中到混合的膜1分钟。如果该标记探针的灵敏度是不能让人满意，重复步骤从1.1.3到1.3.4。
   5. 测量标记的探针（OD260）的DNA的浓度和浓度调整到100ng微升^-1。
4. 检查该DIG标记的探针的特异性
   1. 变性的基因组DNA样品（25纳克3微升^-1每每个样品）从各种细菌物种，包括由特定探针靶向的细菌，在95℃下进行10分钟，并迅速变冷冰上。
   2. 手动加载在尼龙膜上，变性DNA和干燥20分钟，在室温。
   3. 简要地浸泡在2×SSC缓冲液的膜孵育该膜在80℃下2小时，进行固定化的DNA。
   4. 方框与在RT封闭液1小时的膜。
   5. 稀释探头在1纳克微升^-1杂交缓冲液，变性稀释探针，并应用到膜上。
   6. 孵育该膜在45℃下1小时。
   7. 洗膜3次2X SSC缓冲。
   8. 简言之泡膜MAB。
   9. 孵育抗DIG的AP缀合的抗体稀释（1:2,000）在6ml封闭溶液在RT 1小时的。
   10. 与MABT洗膜，并应用40微升的NBT / BCIP溶液2毫升检测缓冲液混合。
   11. 当探针未达到预期的特异性，增加杂交温度直到特异性观察。

2. 在原位杂交

注意:为了避免标本和试剂的干燥，执行所有的孵化在湿盒内衬用湿纸巾。

1. 去石蜡和组织切片补液
   1. 从石蜡包埋块准备4微米厚的组织切片。福尔马林，多聚甲醛，以及锌系固定剂与本协议兼容。
   2. 准备用DEPC处理过的水全部试剂。
   3. 在干燥烘箱中在60℃下进行30分钟热幻灯片孵育载玻片在室温30分钟。
   4. 沉浸在100％二甲苯幻灯片5分钟三次;用新鲜二甲苯各一次。
      注:请去打蜡过程中的化学通风柜。
   5. 沉浸在100％的乙醇5分钟载玻片两次，使用新鲜的乙醇，每次，和再水合样品以串行90％，80％和70％的乙醇溶液，每次5分钟。
   6. 沉浸载玻片于DEPC处理水1分钟和在DEPC处理的PBS（pH 7.4）中6分钟洗幻灯片。
2. 组织切片的预处理
   1. 沉浸在0.1N盐酸载玻片20分钟，并于DEPC处理过的水冲洗载玻片30秒。
   2. 周围绘制用蜡笔样品疏水屏障。
      注意:所述疏水性屏障的大小取决于试样的大小。因此，在下面的步骤中使用的试剂的量取决于试样的大小，但必须填写的HYdrophobic屏障（50微升的小试件和400微升的大样本）。
   3. 治疗的标本，并且在干燥烘箱50至400微升蛋白酶K（1至10微克毫升^-1在DEPC处理的PBS）中于37℃进行30分钟，并在DEPC-处理的1×PBS，1分钟洗幻灯片。
   4. 泡在4％低聚甲醛的幻灯片在DEPC-处理的PBS 10分钟，然后于DEPC处理过的PBS洗涤玻片，持续1分钟。
   5. 浸泡载玻片在0.1M三乙醇胺 - 盐酸含0.5％乙酸酐进行20分钟（pH 8.0）中和在DEPC处理过的水冲洗载玻片30秒。
3. 杂交探针和洗涤
   1. 浸入2X SSC缓冲滑轨20分钟。
   2. 稀释探针在1纳克微升^-1在杂交缓冲液（4×SSC中，50％[体积/体积]甲酰胺，1×Denhardt溶液，10％[重量/体积]硫酸葡聚糖，0.1％[重量/体积]十二烷基硫酸钠， 0.4毫克毫升^-1鲑鱼精子DNA）。对于阴性对照，用混合的标记探针10倍过量的非标记探针的。
   3. 变性稀释探针和应用50〜400微升到组织切片。广场上的幻灯片盖玻片和密封用指甲油。
   4. 热滑动PCR仪在90℃下进行10分钟，并孵育玻片在加湿室中O / N在45℃或最佳的温度，在步骤1.4.11确定。
   5. 冷却该玻片在4℃下进行30分钟，除去盖玻片，并浸入滑动以串行SSC缓冲液如下:4×SSC中10分钟，预热（45℃）2×SSC中20分钟，2×SSC中10分钟，0.2×SSC中10分钟。
4. 检测用抗DIG的AP缀合的抗体
   1. 在MABT 5分钟洗幻灯片。
   2. 拥有50至400微升阻断与1％吐温20溶液中20分钟的阻塞。
   3. 加50至400微升抗DIG-AP抗体稀释在封闭溶液（1:1,000）anld孵育在37℃下90分钟。
   4. 在MABT 10分钟洗幻灯片。
   <利>浸入滑动含有1％吐温20进行5分钟的检测缓冲液中。
   5. 用50至400治疗μ1mM的左旋咪唑（在含有1％吐温20的检测缓冲液）中5分钟以灭活内源性碱性磷酸酶。
   6. 分发50-400微升预混NBT / BCIP溶液（在1稀释于检测缓冲液:100）到每个样品孵育载玻片在潮湿的腔室在RT 2至3小时，直到开发出信号是令人满意的。
   7. 冲洗载玻片用去离子水以停止可视化和应用50〜400微升的0.05％[重量/体积]甲基绿作为复染剂在37℃下进行10分钟。
   8. 冲洗载玻片用去离子水，脱水在100％乙醇，并沉浸在二甲苯。
   9. 应用80微升安装解决方案到每张幻灯片，并盖上盖玻片。

图1显示了斑点印迹DIG标记的探针，在所述试剂盒，以确定其灵敏度提供的阳性对照探针进行比较。 343 bp的P.牙龈特异性探针是25倍，比70 bp的真细菌探针更敏感。 图2示出了在从慢性牙周炎患者检测P的获得牙龈组织的原位杂交牙龈和真细菌。细菌的信号，在紫所示，分别位于组织外的上皮，固有层，并且生物膜内检测。但是，P的分布牙龈和内齿龈组织真细菌是不同的。在细菌的高放大倍率（1000倍），各种形状（球菌，棒状，纺锤形，有毛的形式）均可见用真细菌探头，而只有杆状细菌的检测P.牙龈特异性探针。细菌信号的形式分散还观察到。

Hajishengallis 等 。证实共生细菌在P的发展中的重要作用诱发牙龈牙周炎实验小鼠^14。葡聚糖硫酸钠的应用（DSS），紧密连接（TJ）-disrupting化学，上龈粘膜诱导牙周炎和牙槽骨丧失的小鼠^13。在真细菌探针成功地检测细菌从DSS组不是由P.检测到牙龈组织内牙龈特异性探针（ 图3）。

的真细菌的探针是用于细菌的其他疾病的潜在参与的研究是有用的。由于国际癌症研究机构指定的幽门螺杆菌为I级致癌物质胃癌^15，细菌在其他癌症的发展潜力参与已被广泛研究。当SE肺活检ctions诊断患有鳞状细胞癌是原位杂交的真细菌的探针，细菌内的肿瘤细胞和周围的间质中检测两者/使用真细菌探针浸润细胞（ 图4）。 原位杂交也适用于探索细菌在口腔扁平苔藓，炎症免疫疾病，病因不明病变的存在。有趣的是，检测到不仅在上皮，而且在固有层何处观察带状浸润细菌信号。在高倍率下，细菌信号在许多细胞中（ 图5）的细胞核中检测到。

该DIG标记的探针的图1.敏感性测试。连续稀释的定制标记的探针和正对照试剂盒中提供醇探针进行斑点印迹用抗DIG-AP缀合的抗体。加入底物，使印迹与P.后牙龈特异性探针30秒研发，同时与真细菌探针的印迹1分钟开发的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.检测从慢性牙周炎患者获得牙龈组织内的细菌。从健康位点（A）和牙周炎患者的患病部位（B）的牙龈活检切片进行苏木精-曙红（H＆E）染色或在任一体育原位杂交牙龈特异性探针或真细菌探头。是负面Ë对照与探针杂交以10倍过量的未标记探针混合。放大的区域被指示具有正方形框。代表积极信号，在紫色所示，标有细箭头。粗箭头指示组织以外的菌斑生物膜。菌斑生物膜研究的1,000X放大显示在插图。 请点击此处查看该图的放大版本。

图中的鼠标的牙龈组织口服共生细菌的检测3.实验牙周炎诱导在BALB / c小鼠口服接种P的牙龈 （PG）或应用DSS的牙龈上黏膜。从小鼠牙龈切片进行H＆E染色或原位杂交无 ​​论是< EM> P上。牙龈特异性探针或真细菌探头。代表正信号，在紫所示，以箭头标示。原来的放大倍数为400倍。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4.在检测癌症病灶的细菌。从患者确诊为鳞状细胞癌肺活检的切片用H＆E或原位杂交无 ​​论是通用的真细菌探头或阴性对照探针。放大的区域被指示具有正方形框。代表正信号，在紫所示，以箭头标示。肿瘤细胞的边框以表示虚线。ARGET ="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图5.检测口腔扁平苔藓病损内的细菌。活检从颊粘膜诊断为口腔扁平苔藓的切片用H＆E或原位杂交无 ​​论是通用的真细菌探头或阴性对照探针。放大的区域被指示具有正方形框。代表积极信号，在紫色所示，标有箭头。 请点击此处查看该图的放大版本。

这里的协议来定位使用已经描述了DIG标记的DNA探针石蜡包埋组织中的细菌。探针靶向细菌16S rRNA基因的DNA或RNA分子，和16S rRNA基因靶向探针可设计为任意的种特异性或通用。在P的特异性杂交牙龈特异性探针P.牙龈而不是其他口腔内细菌先前已经证明^10。与此相反，在真细菌探针杂交至所有细菌的基因组DNA进行测试（17种不同的种），尽管杂交效率变化^12。的探针内的T核苷酸的数量决定DIG标记的效率。生产具有高灵敏度的DIG标记探针是成功实施所描述的协议中最关键的一步。通过提取蛋白和部分hydrolysi的标本用盐酸处理改进了信噪比的目标序列。在蛋白酶K的浓度的增加而增加探针的目标可访问，但降低组织保存。因此，建议以测试不同浓度的蛋白酶K，这取决于组织的类型。乙酰化步骤降低了带负电荷的探针通过酰化的带正电荷的氨基背​​景结合到组织的蛋白质。经过一系列的准备，这些步骤，组织切片容易撕裂，因此，必须谨慎处理。鱼相比，背景是最小的。然而，从组织中内源性高碱性磷酸酶活性，如骨骼和粘液腺的信号，应严格解释。

相比RNA探针PCR扩增的DNA探针是易产生和稳定。免疫组化检测杂交探针可以识别组织结构，通过与H＆E染色切片对比:上皮细胞，结缔组织，炎性浸润和血管是公区分。之一的描述的方案的局限性是不能同时应用多个探针。此外，信号的部分的表面上排除从细菌污染物是有限的。

这个协议可以适于内的组织切片¹⁶检测其他细菌转录。此外，该协议可以扩展到两倍与免疫组织化学检测的宿主细胞标记物染色。

作者什么都没有透露。

这项研究是由来自韩国国家研究基金会的资助（2013R1A1A3005669）和韩国保健技术研发项目，卫生部与福利的补助金（HI13C0016）的支持。