Floresan protein ifadesindeki

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Gelişimi sırasında, tek bir hücre, hücre bölünme ve hareketleri hem de içeren oldukça karmaşık bir işlem olarak, bütün bir organizma neden olur. Iyi hücre davranış dinamiklerini yatan biyolojik prensiplerini anlamak, gelişimsel biyologlar floresan tabanlı vivo görüntüleme teknikleri kullanmaya başlamıştır. Bu tür hücre membranları gibi hücre spesifik bölmeleri, ya floresan boyalar ile muameleler ile spesifiklik eksikliği ve doku penetrasyonu ¹ engellenmektedir bir yaklaşım olarak etiketlenmiş olabilir, ya da floresan proteinleri ² kodlayan eksojen mRNA'ların embriyo özgü sokulmuştur. Farklı teknikler mRNA gibi eksojen bileşikler, etkili bir şekilde verilmesi için kullanılabilir. Bunlar arasında, ancak mikroenjeksiyon, elektroporasyon, mikro parçacıklar, lipofeksiyon ve transdüksiyon ^3,4 ile bombardıman, bunlarla sınırlı değildir. Bu yaklaşımların her bir egzojen bileşikleri sokmak için kullanılabilir, ancakgelişmekte olan embriyo, sadece mikroenjeksiyon, her hücrede ³ içine önceden tanımlanmış ve hassas miktarlarda uygulama sağlar. Mikroenjeksiyon teknikleri tüm önemli gelişim model sistemler için de tarif edilmiştir ⁴ (örneğin, meyve sinekleri, nematod kurtlar, zebra balığı, kurbağa, fareler) ve gelişim mekanizmalarına evrimini anlamak amacıyla karşılaştırmalı çalışmalar için kullanılanlar dahil olmak üzere, bazı alternatif modeller ^4, olduğu gibi (örneğin, deniz lalesi, halkalı solucanlar, deniz kestaneleri, ascidian gömlekliler, Kafatassızlar Amphioxus).

Birlikte gömlekliler ve kordalı filumunu kurmak omurgalılar ile, özellikle çok uygun modeller sefalokordatlar, omurgalılar evrimini ve omurgasız atadan ^5-8 arası omurgalıların çeşitlendirilmesi çalışma. Kafatassızlar soyu çok erken kordalı evrimi sırasında ayrılmaktadır; ve üç cins bölünmüştür kaybolmamış sefalokordatlar, (Branchiostoma, Asymmetron ve Epigonichthys), omurgalılar benzer hem genel anatomi ve genom mimarisi ^5-8 açısından. Şimdiye kadar tarif edilmiş sefalokordatlar yaklaşık 30 türün, beş embriyolojik ve geliştirme çalışmaları ^6,9 için kullanılabilir: Asymmetron lucayanum (Bahama lancelet) Branchiostoma floridae (Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Avrupa Amphioxus), Branchiostoma belcheri (Çin Amphioxus) ve Branchiostoma japonicum (Japon Amphioxus). Bu türlerin üç olgun yetişkin (B lanceolatum, B. belcheri ve B japonicum) isteğe bağlı üreme mevsiminde ^10,11 boyunca yumurtlamaya indüklenebilir. Buna ek olarak, en az bir B. lanceolatum verimli yumurtlama böylece ayrıca LABORATOR için bu özel Kafatassızlar türleri erişilebilir hale yapay deniz suyu ¹² indüklenebilirDoğal deniz suyuna erişimi olmayan ler. B. kombinasyon, lanceolatum, mikroenjeksiyon gibi etkin bir dağıtım yöntemi ile embriyo için uygun ve güvenli erişim, şimdiye kadar ^13-15, (b floridae ve B belcheri hem de) amphioxus içinde gelişmiş sadece uygulama tekniği, geliştirilmesini mümkün kılmaktadır soy tracing- ve dinamik hücre davranış tabanlı yaklaşımları içeren manipülatif teknikler, yeni paketi.

MRNA etkin mikroenjeksiyon için bir protokol B floresan proteinleri ifade etmek için lanceolatum embriyo dolayısıyla geliştirilmiştir. Ayrıca, B. canlı görüntüleme için bir temel araç seti temin etmek lanceolatum embriyolar, vektör sistemleri zara bağlı ve floresan proteinleri nükleer ekspresyon izin veren geliştirilmiştir. Membran hedeflemesi için, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) mCherry ve eGFP insan HRAS CAAX kutusu ve nükleer lokalizasyon oldu erimiş olduzebra balığı histon 2B (H2B) ekson (Şekil 1, ek İçerik 1) füzyon yoluyla elde edilmiştir. Ayrıca, protein dönüşümünü optimize etmek amacı ile, konstruktların Kozak dizilerini ve kodonlar değiştirilmiş ve B kullanılmak üzere uyarlanmış lanceolatum. Birlikte ele alındığında, burada sunulan enjeksiyon yöntemi ve ifade vektörleri özellikle son vivo görüntüleme teknikleri floresan tabanlı kullanarak analizler, sefalokordatlar için yeni deneysel yaklaşımlar üretilmesi için bir temel olarak hizmet verecek.

Araçların ve Reaktifler 1. Hazırlık

1. Pasteur pipet aktarın
   1. Farklı hızlarda bir alev üzerinde 230 mm uzunluğunda Pasteur pipetler çekerek, farklı uç çapları transfer Pasteur pipetler bir dizi oluşturun. Konik aspirasyon düzgün ve ince kontrolü için mümkün olduğunca uzun olduğundan emin olun.
   2. Bir elmas çizici ile, dik pipet uzunluğu bir hat boyunca pipet çizmeyin. Her iki elinizle, künt kesim oluşturmak için kendi uzunluğuna pipet paralel çekin. Hızla alev lehçe ucu sızdırmazlık olmadan pipet.
   3. , 200-400 mikron (mikron çapında 500 civarında) döllenmiş yumurta, 600 mikron döllenmemiş oosit için 300-400 mikron (çapı 150 mikron civarında): oosit / embriyo aşamasında olan ucunun çapı pipetle için Vary taranmış neurulae için. Ağız-izlenen aspirasyon tüpü ile kullanın pipetler bir çanak oosit / embriyo transferbaşka.
2. Enjeksiyon iğneleri
   1. RNaz ücretsiz koşulları sağlamak için eldiven ile kılcal işleyin. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, uzunluğu 10 mm boyutlarında olan Filament kılcal ile borosilikat camını kullanın.
   2. Kılcal damarlar Malzeme Listesi'nde tanımlanan ısıtma telli iğne çektirmenin türüne çekti, aşağıdaki ayarları kullanın: Isı 600, Velocity 80, Zaman 60, Basınç 200 veya 300. Aksi takdirde 50 çekin, şekil, hangi sağlamak Başarılı enjeksiyonlar için önemli, aşağıdaki özelliklere sahip olan, Şekil 2'de gösterildiği gibi, 4-8 um dış uç çapı 2 cm konik uzunluğu.
      NOT: İğneler yumurtlama sezonu öncesi çekti ve sezon boyunca kullanılır.
3. % 5 Fenol Kırmızısı stok çözeltisi (4x)
   1. Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın.
   2. 0.22 mikron filtre tüpünde, fenol kırmızı bir toz halinde 25 mg tartılır.
   3. Için DNase- ve RNaz içermeyen su, 0.5 ml ilave ediliriçeren toz tüpü.
   4. Çözelti filtre-sterilize ve enjeksiyon iğnesi tıkayabilecek kristallerin uzaklaştırılması için, oda sıcaklığında 18,000 x g'de 3-5 dakika boyunca dönerler.
   5. 4 ° C'de saklayın veya -20 ° C'de 250 ul alikotları saklayın.
4. / Ml poli-lizin çözeltisi, 0.25 mg
   1. Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın.
   2. Damıtılmış su, 20 ml poli-L-lisin, 5 mg eritin. -20 ° C'de, 5 ml lik bir kısmı.
   3. Poli-lisin-kaplanmış çanak oositlerin tekrarlanabilir ve sağlam yapışmasını sağlamak için sadece bir kez hemen çözülmüş kısım kullanın.
5. mRNA sentezini
   1. Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın.
   2. (37 ° C'de, genellikle 2 saat süre ile,) uygun enzim ile ilgili DNA'nın 5 ug linearize. Sindirim eksiksiz olduğunu kontrol etmek için, 20 dakika boyunca 150 W TBE tampon maddesi içinde bir% 1 agaroz TBE jeli üzerinde sindirim karışımı hacminin% 2 çalıştırın.
   3. Linea Özü24: 1 fenol (pH 8.0): kloroform: 25 rized DNA izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 18.000 xg'de 10 dakika ve sulu (üst) faz toplamak için Vortex.
   4. 24 ile tekrar ektraktlayınız: 1 kloroform: izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 10 18.000 x g'de dakika ve sulu faz toplamak için Vortex.
   5. 10: 300 doğrusallaştırılmış DNA: 3 M sodyum asetat (pH 5.2): -20 ° C de bir gece% 100 etanol 100 ile doğrusallaştırılmış DNA'nın çökeltilmesi.
   6. 4 ° C'de 18,000 x g'de santrifüj 20 dk. % 70 etanol içinde durulayın.
   7. 4 ° C'de 18,000 x g'de santrifüj 10 dk. RNase içermeyen su içinde, kuru ve tekrar süspansiyon 0.5 ug / ml bir son konsantrasyonda olsun.
   8. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir polimeraz ile bir mRNA sentez kiti kullanılarak doğrusallaştırılmış DNA'nın 1 ug yazıya.
   9. 1 fenol (pH 4,7): 5 ile mRNA Özü kiti ile sağlanan kloroform ve amonyum asetat durdurma çözüm.
   10. 20 saniye için Vortex, centrifuge 18,000 x g'de 10 dakika ve sulu faz toplanır.
   11. 24 ile tekrar ektraktlayınız: 1 kloroform: izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 10 18.000 x g'de dakika ve sulu faz toplamak için Vortex.
   12. Gece boyunca -20 ° C de, 100% izopropanol ile mRNA çökeltilmesi.
   13. 4 ° C'de 18,000 x g'de santrifüj 20 dk. % 80 etanol içinde durulayın.
   14. 4 ° C'de 18,000 x g'de santrifüj 10 dk. Daha sonra tekrar askıda bırakılması zordur olacak gibi daha uzun bir süre, 5-10 dakika için oda sıcaklığında pelet kurumaya bırakın. En az 2 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar DNase- ve RNase-barındırmayan su içinde yeniden süspanse enjeksiyon karışımı içinde iyi bir son mRNA konsantrasyonunu sağlamak.
   15. Transkripsiyon ürünün kalitesini ve boyutunu kontrol 20 dakika boyunca 150 W TBE tamponu bir RNaz ücretsiz% 1 agaroz-TBE jel üzerinde mRNA 0.5 ul çalıştırmak için. Mağaza -80 ° C 'de 2 ul alikotları.
6. Poli-lizin kaplı tabaklar
   NOT: Poly-lizin coaTed yemekler enjeksiyon sırasında oosit hareketsiz hale getirmek için kullanılır.
   1. Her 35 mm'lik hücre kültürü Petri çanağı (toplam 5) için, buzu çözülmüş 0.25 mg / ml poli-lisin çözeltisinin, 1 ml Petri kabı alt kapağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   2. Her 35 mm'lik hücre kültürü Petri çanağı (toplam 5), başka bir 35 mm'lik hücre kültürü Petri çanağı içine 0.25 mg / ml poli-lizin çözeltisi aktarın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   3. 0.25 mg / ml poli-lizin çözeltisi atın.
   4. 2 saat süre ile, oda ısısında petri kaplarında kuru ters olsun.
   5. Bir hafta maksimum kirlenmeyi önlemek için 4 ° C'da bir plastik sargı sarılmış poli-lisin-kaplanmış yemekler saklayın.
7. Agaroz kaplı yemekler
   NOT: Bu kültür enjekte edilen embriyolar için kullanılır. Agaroz enjekte edilen embriyolar için bir yastık sağlayan ve çanak dibine yapışmasını engeller.
   1. Yapay deniz suyu (ABY) 37-38 g / L comm kullanarak olunters ozmoz su içerisinde ercial tuzları + 0.25 mM NaHCO _3.
   2. Bir mikrodalga fırında çözelti ısıtılarak 0.22 um filtreden ASW agaroz bir% 1 konsantrasyona çözülür.
   3. Hızla çanak çok ince agaroz kaplama sağlamak amacıyla başka biri ile bir 35 mm Petri kabı, sıcak agaroz dökün.
   4. Saran sarılmış agaroz kaplı yemekler bir hafta maksimum kirlenmesini önlemek için 4 ° C'de sarın saklayın.
8. Enjeksiyon iğne enjeksiyonu karışımı ve yükleme
   1. Yaklaşık 2 saat enjeksiyonları başlamadan önce, 1-1,8 mRNA ug / ul,% 15 gliserol,% 1.25 Fenol Red nihai konsantrasyonları ile 2 ul enjeksiyon RNase- içinde karışımı ve DNaz-ücretsiz su yapmak.
      NOT: Fenol Kırmızı renk enjeksiyon verimlilik ve başarıyla enjekte edilen embriyoların belirlenmesi izlenmesine olanak sağlar çözümü. Gliserol oosit içinde mRNA difüzyon yanadır.
   2. Santrifüj 4 dk 18.000 xg'dePelet kristaller. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin.
   3. 10 ul pipet ile, kristaller, topak haline edilmiş boru, alt kaçınarak enjeksiyon karışımı 0.5 ul toplar.
   4. İğnenin büyük açılışında enjeksiyon karışımı 0.5 ul damla pipetleme (durumunda enjeksiyon sırasında bir tatili) en az iki enjeksiyon iğneleri dolduramaz.
   5. Enjeksiyon karışımı buharlaşmasını önlemek için 4 ° C'de altındaki sıvı bir depo kabı iğneler takın. Enjeksiyon karışımı yavaş yavaş kabarcıklar oluşumunu en aza indirmek için, en az 1 saat süre ile enjeksiyon iğnesinin ucunun tümünü olsun.
   6. MRNA kalitesi bozulur, bundan sonra, üç ek kullanımları, en fazla -80 ° C'de saklayın, ek enjeksiyon karışımı (veriler gösterilmemiştir).

Biyolojik Malzeme, Mikroenjeksiyon ve Embriyo Kültürü 2. Koleksiyonu

1. Yumurta ve sperm toplama
   NOT: Theodosiou görünve ark. yumurtlama uyaran ve gamet toplama için ayrıntılı bir protokol için ^12.
   1. 24 saat süre ile, 23 ° C'de ASW Şok erkek ve dişi.
   2. Çoğu yetişkin gün batımından sonra 1-2 saat doğacaktır, çünkü gün batımından önce bir iki saat, 19 ° C'de ASW bireysel bardak içine yetişkin aktarın.
   3. Filtrelenmiş ASW'nin 35 mm Petri kapları durulayın ve onlara çanak dibine yapışmasını önlemek oosit kuru ters-üzdüm.
   4. Yumurtlama üzerine, derhal 1.000 ul pipet ile sperm ve oosit toplamak.
      1. Sperm tutun ve iletişim gamet sağlığı için zararlı olduğu için oosit yetişkin amphioxus ayrı (veriler gösterilmemiştir).
      2. Dahası, sperm ve oosit hem dağılımı hareketlere neden olur, bu yetişkin şaşırtıcı önlemek ve dolayısıyla seyreltin. Mümkün olduğunca uzun süre aktif sperm tutmak için ve döllenme oranını optimize mümkün olduğunca konsantre olarak sperm toplamak için.
   5. Tutmak1.5 ml tüp buz üzerinde sperm.
   6. Önceden durulanmış, 35 mm Petri kutularına süzüldü ASW oosit aktarın.
   7. Transferi 100-500 enjeksiyonları gerçekleştirmek için başka bir 35 mm'lik Petri kabı önceden çekti 300-400 mikron transferi Pasteur pipeti ile oocytes.
   8. Sperm ve oosit kalitesi için ya da diğer deney için bir kontrol olarak kavramanın kalan döller.
2. Oosit enjeksiyonu
   1. Yatay düzleme 50 ° açıyla mikromanipülatör enjeksiyon iğnesi takın.
      NOT: Birden fazla 50 ° açıları oosit iğne pozisyonda uygun bir izleme izin vermez iken daha az 50 ° açıları, çanak etrafında oosit itecektir.
   2. 25X oküler floresan kesme kapsamında, süzüldü ASW içeren bir poli-lisin-kaplanmış tabağına 300-400 um aktarım Pasteur pipeti ile 30 oosit aktarın.
   3. Taşımak için bir hat boyunca oosit yatırındüzenli bir şekilde ve üzerinden enjeksiyonu olmayan enjekte edilmiş oositlerde enjekte ayırt etmek üzere. Gelişmekte olan embriyolar deforme eğiliminde poli-lisin, oositlerin maruz kalma süresini en aza indirmek için çok az sayıda (30 oosit) enjekte edilir (veriler gösterilmemiştir).
   4. Mümkün olduğunca saydam olarak oosit işlemek için karanlık alan aydınlatma kullanın.
   5. Mikromanipülatör kaba hareket topuzu, bir oosit yakın enjeksiyon iğnesi getirmek.
   6. Ince forseps ile ucu kavisli olması başlar düzeyde iğne açmak kesti. Enjektör ile darbe olarak, kırmızı enjeksiyon karışımı aslında iğnenin dışarı akan doğrulayın.
   7. 200X büyütmede ve mikromanipülatör ince hareketi topuzu, hafifçe oosit çekirdek içinde bir iğne hareket.
      NOT: Çok yüzeysel takılırsa, enjekte çözüm oosit içinde kalmayacak. Çok takılırsa, oosit yok edilecek.
   8. 120 msn Durat 1-3 darbeleri ile enjekteiyon ve 1-10 psi basınç. İğne yeterince iyi değilse, sabit basınçta sürekli akış ile enjekte. Enjeksiyon hacmi, tek bir oosit hacminin 1/3, 1/5 karşılık emin olun.
   9. Enjeksiyonu takiben, oosit sızıntısını önlemek için hızla iğneyi çekin.
   10. Enjekte çözüm oosit içinde kalır ve bir kaç saniye sonra, enjekte çözüm oosit yayılır doğrulayın.
   11. Doğrultusunda bir sonraki oosit üzerine taşıyın.
   12. Enjekte embriyolar için tararken arka plan floresan tahmin negatif kontrol olarak her dizinin bazı uninjected embriyolar tutun.
3. Enjekte embriyolar ve embriyo kültürü Döllenme, seçim
   1. En kısa sürede bir dizi enjekte edildiği gibi oosit döller. Oosit kalitesi zamanla azalır gibi, enjekte ve ¹² yumurtlama sonra 1 saat içinde oosit döller.
   2. Sperm konsantrasyonu bağlı olarak, oosit sperm 1-5 damla ekleyin veçanak girdap.
      Not: fertilizasyon zarf hakkında 1 dk sonra embriyolar üzerine belirgin hale gelmelidir.
   3. Oosit bir dizi enjekte edilirken, embriyolar, poli-lisin kaplı çanak ayırmak için izin verin.
   4. Bir agaroz kaplı Petri kabı içine 600 mikron transferi Pasteur pipeti ile embriyolar transfer. Mümkünse 2 hücreli aşamada önce, eğer, en kısa sürede, poli-lisin kaplı tabak embriyolar çıkarın.
      Not: poli-lizin, uzun süre maruz kalması durumunda, embriyolar, çanağın tabanı dokunmadan yan düzleştirilmiş yoğun dolu blastulae, olma eğilimindedir.
   5. 2-hücreli 4-hücreye aşamada, DSR filtreli bir floresan diseksiyon kapsamı ile seçin başarıyla enjekte embriyolar, yani, bir Fenol Kırmızı-türetilmiş kırmızı floresan sinyali sergilediği normal morfolojiye sahip olanlar.
   6. İstenilen aşamada kadar 19 ° C'de agaroz kaplı Petri kapları süzülür ASW kültür embriyolar tutunin vivo görüntüleme.

Yukarıda ayrıntılı protokol B mikroenjeksiyonu için temel sağlar lanceolatum oositler ve dolayısıyla B geliştirilmesi dahil edilmek için mRNA lanceolatum embriyolar in vivo görüntüleme için floresan proteinleri kodlayan. Tekniği kesinlikle sağlam ve güvenilir olmasına rağmen, bu protokolü kullanarak başarılı enjeksiyonları oranı değişken (Tablo 1) kalır. Bu ilginç aslında çok olası bir açıklama oosit kavramaları aşırı değişkenlik olduğunu: enjeksiyon basıncına maruz kaldığında farklı yumurta partiler gerçekten çok farklı davranırlar yoktur. Diğerleri oldukça sert ve enjeksiyon üzerine yuvarlak kalırken bazı oosit, oldukça esnek ve çanak dibinde düzleştirmek için eğilimindedir. Diğerleri sadece lize (veriler gösterilmemiştir) Diğer taraftan, bir oosit gruplar, enjeksiyon üzerine kendi koryon membranlar şişirmek eğilimindedir. Hiçbir belirgin bir korelasyon enjeksiyonu ve embriyonik üzerine oosit davranışı arasında ilişki kurulamadıDöllenme sonrası gelişme. Bu mikroenjeksiyon için en uygun oosit hangi kategori tahmin böylece zordur. Ancak döllenmeden sonra, normal gelişimini geçiren embriyolar bölünme aşamaları gibi erken teşhis edilebilir: blastomerlere arasındaki temas yüzeyi küçük olduğunda 4-hücreli dönem embriyoların 2-hücreli, normal kabul edilebilir bir sıkıştırılmış bölünme aşamalı embriyo, bireysel hücrelerin ise ayırt etmek zordur, kesinlikle anormal.

Bizim ellerde, oosit yaklaşık yarısı enjeksiyonu ile ve enjeksiyon sergileyin belli bir floresan etiket hayatta yapmak embriyoların yarısı neden travma hayatta yok. Böylece, bu enjeksiyon protokolü ile, 50 ila 120 embriyolar başarıyla 15 ve 60 etiketli embriyolar arasında verimli bir verilen yumurtlama gününde enjekte edilebilir tahmin.

4-hücreli dönem embriyoların 2-hücrede Fenol Red kırmızı floresan çok güvenilir sahip embriyolar işaretlerBu şekilde seçilen embriyoların% 100 daha sonra enjekte mRNA tarafından kodlanan floresan proteinleri üretmek gibi düzgün, enjekte edilmiş. Buna ek olarak, 2-hücresi 4-hücre aşamasında Fenol kırmızı floresans yoğunluğu ve enjekte mRNA tarafından kodlanan proteinlere flüoresansının başlangıç ​​zamanı arasında çok açık bir korelasyon vardır. Bu ilişki, böylece enjeksiyon işlemi sırasında mRNA en yüksek miktar almış olan embriyoların belirlenmesini sağlar.

Enjekte mRNA tarafından kodlanan floresan protein sinyal Fenol Kırmızı-pozitif embriyoların seçimi tespit değilse, biz mRNA bozulması veya yakalama kontrol etmek için bir RNAse ücretsiz jel üzerinde enjeksiyon karışımı çalıştırmak için tavsiye (Şekil 3) . Şerit 1 'de, bir dokunulmamış mRNA bandı tespit edilmiştir. Bu karışımı Enjeksiyon embriyo güçlü floresan sinyal yol açtı. Aksine, şerit 2 başka experimen karşılık gelenFenol Kırmızı (Daha fazla bilgi için tartışma bakınız) karışımı Dekstran boya ile değiştirildi t, mRNA embriyo floresan sinyal yol asla bu karışımı Dekstran boya ve enjeksiyon tarafından tuzağa gibi görünüyor.

Bu mikroenjeksiyon tekniği ve bizim yapıları (Tablo 2 ve 3, Ek Dosya 1) (tartışma), biz böylece tekrarlanabilir membran çekirdeğinde ve eGFP ile mCherry veya eGFP ile embriyo boyunca homojen floresan etiketleme üretebilir Kullanma (Şekil 4) . Görüntüleme protokolü Şekil 4, başka bir yerde tarif edilecektir (Faure vd., şu hazırlama) üretmek için kullanılabilir. MRNA miktarına bağlı olarak flüoresan protein ekspresyonu, tipik olarak 16-hücre (Şekil 4A) ve 64-hücre aşamaları arasında tespit edilebilir hale gelir ve en az bir son neurula aşamasına kadar tespit kalır enjekte edildi (veriler gösterilmemiştir). Daha sonra aşamalar test edilmemiştir. Nükleer sinyalitipik olarak, potansiyel nedeniyle çekirdeğin kompakt yapısı ile karşılaştırıldığında, zarın özünde yaygın doğası, membran sinyalinden daha erken dönemde ortaya çıkan (veriler gösterilmemiştir). Sistematik takip edilmiş olmasına rağmen, embriyolar nükleer eGFP etiket ile sadece enjekte edilen embriyolar daha az sağlıklı gibi görünen bir nükleer ve bir membran etiket hem enjekte. Enjekte mRNA toplam miktarı, bir ya da iki mRNA türleri karışıma dahil edilmesi, aynı olarak Şaşırtıcı bir bu etki enjekte mRNA toplam miktarından bağımsız olduğu görülmektedir (veriler gösterilmemiştir).

Şekil 1: ayrıntıları Construct. (A) Eskizler membran hedefli eGFP (eGFP: CAAX kutusu), (B), nükleer hedefli eGFP (H2B: eGFP) ve (C) nükleer hedefli MCherry (H2B: mCherry) ar oluştururE gösterilmiştir.

Şekil 2: Örnek enjeksiyon iğnesinin Şekil. (A), konik, yaklaşık 2 cm uzunluğunda ve ucunda iğne eğriler. Ölçü bar = 2 mm arasındadır. A'da kutulu alan (B) Büyütme iğnesi (ok) Kesime konumu iğne eğrisi bulunmaktadır. iğne ucu ok ile belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Şeritte 1 mRNA ve Fenol Red içeren bir karışımı göç mRNA Etkileşimler ve seçilen floresan boyalar (A) Sonuç vemRNA ve hat (3.3 mg / ml'lik bir son konsantrasyonda), mRNA ve Oregon Yeşili dekstran ihtiva eden bir karışım göç şerit 2 (B) 'Sonuç olarak (3.3 mg / ml bir son konsantrasyonda), Texas Red dekstran 3 mRNA ve A ve B hat 5. Jel geçiş zamanında (3.3 mg / ml bir son konsantrasyonda), şerit 4 ve mRNA ve rodamin dekstran (3.3 mg / ml bir son konsantrasyonda), FITC dekstran oldu Farklı. Açıklık uğruna, bir ışık yansıması ve kesik çizgiler göç şerit belirginleştiren bir maskeleri siyah dikdörtgen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: mRNA'ları floresan proteinleri kodlayan enjekte Amphioxus embriyoların 3D render (Amira yazılım) Görüntüler vardır.iyileştirilmiş bir Leica SP5 2-fotonlu lazer tarama mikroskobu ile elde edilen 3D zaman sona erdikten çıkarılan (A), 16-hücre aşamasındaki embriyo, nükleer H2B sentezleyen.:. mCherry ve membran-hedefli: EGFP (B) Gastrula aşamasındaki embriyo, nükleer H2B sentezleyen eGFP:. CAAX kutusu (C) Gastrula sahne embriyo nükleer H2B ifade: mCherry ve membran hedefli eGFP: CAAX kutusu. Optik bölümü nükleer mCherry ve zara bağlı EGFP sinyalleri ile iç hücrelerini göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 mikron =.

Tablo 1:. Başarılı enjeksiyonları genel yüzdesi olarak enjeksiyon başarı oranları enjekte konstruktlar, enjeksiyon ve etiketlenmiş (veya başarılı bir şekilde enjekte etme) embriyo sayısı hayatta enjekte edilen embriyoların sayısı belirtilmiştir.

Tablo 2:. Kozak sekansları Geçici optimizasyonu Orijinal ve mutasyona uğramış Kozak sekansları, her bir yapı için endikedir. mütasyonlar B. Kozak dizisini geri kazanmak çok yakından andıran lanceolatum aktin geni olduğunu amphioxus bir olayla teorik tercih Kozak dizisi (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / BT).

Tablo 3: kodon kullanımının Geçici optimizasyonu. Özgün ve mutasyona uğramış kodonların her yapı için endikedir. Bu deneysel test edilmiş olsa da, Mutati tanıttıons amphioxus mRNA çevirisi optimize etmek içindir.

Ek İçerik 1: dizilerinin yapımında, (A) membran-hedefli EGFP nükleotid dizileri. (EGFP: CAAX kutusu), (B) çekirdek hedefli EGFP (H2B: EGFP) ve (C) çekirdek hedefli MCherry (H2B : MCherry) yapıları pCS2 vektör omurgası bağlamında verilmiştir. yapıların her biri tarafından kodlanan en temel renkte gösterilir: EGFP (yeşil), MCherry (kırmızı), insan HRAS (CAAX kutusunun) zar lokalizasyon sinyali (mavi mavi), zebra balığı histon 2B ekson (H2B) (sarı).

Bu makalede, B. enjeksiyonu için, ilk kez için, ayrıntılı ve yeniden üretilebilir bir protokol mevcut lanceolatum oositleri, burada, daha sonra B floridae ^13,14 ve B belcheri ^15, bu nedenle bu tür bir teknik tarif edilmiş olan üçüncü Amphioxus türdür. Önemli olarak, iletişim kuralı, aynı zamanda B floresan protein üretimi için uygun vektör sistemlerinin açıklamasını içerir Burada açıklanan in vitro koşullarda üretilen enjekte mRNA'dan lanceolatum (aşağıda tarif edilen). Birlikte, bu yeni araçlar amphioxus erken gelişim ve bölünme ve gastrulasyon olarak embriyo erken morfogenetik olayları altında yatan dinamik hücre davranışları, analizi in vivo görüntüleme sağlar.

Genel olarak, mikro-enjeksiyon tekniği spesifik bileşiğin önceden belirlenmiş bir hacim, bir hedef hücreye, bir teslimatına izin vererek bir yararı vardır. Bu varlık syardım, bu tekniğin bir önemli bir sınırlama, belirli bir deney sırasında enjekte edilebilir hücrelerin kısıtlı olmasıdır. Örneğin, protokol B burada tarif edilen lanceolatum yarısı etiketli edilecek olan enjeksiyon oturum başına 100-120 yumurta, (Tablo 3) bir enjeksiyonu sağlar. B. için floridae, sayılar% 50'den fazla enjeksiyon ^13,14 hayatta olan günde enjekte edilebilir, 500 veya daha fazla yumurta, çok benzerdir. B. enjekte için protokoller iken lanceolatum ve B floridae yumurta yakından B., birbirlerine benzerler belcheri teknik biraz farklıdır: farklı marka bir mikroenjektör kullanılarak bir ters mikroskop altında yumurta poli-lisin kaplı lamelleri yerleştirilir ve enjeksiyonlar yapılmaktadır. Bu yaklaşım, görünüşe göre 200 ila 300 B. enjekte edilmesine imkan tanıyan Bir hayatta kalma oranı ile, neurula aşamasında yumurtadan sonra enjeksiyon oturum başına belcheri yumurta, of 95,83% ¹⁵ 89,39%. Protokoller farklılıkları göz önüne alındığında, bu başarı oranlarındaki farklılıklar türlerin ilgili veya protokol ile ilgili farklılıklar nedeniyle olup olmadığını bilmek zordur. Bir bu soruyu cevaplamak için farklı protokoller ile paralel olarak farklı türler test etmek gerekir. Bununla birlikte, daha fazla eksojen bileşiklerin verilmesi için hedef oosit sayısını artırmak için diğer protokoller amphioxus için geliştirilmiş olması gerekir. Aday teknikleri elektroporasyon, mikro, lipofeksiyon ile bombardıman ve transdüksiyonunu ⁴ içerir. Notun, elektroporasyon zaten döllenmiş yumurta ascidian tunikat dışsal malzeme tanıtımı için bir standart teknik olarak kurulmuş olup, başka omurgasız kordalı modeli gelişim mekanizmaları ⁸ evrimini incelemek için kullanılır.

Başarılı bir mikro enjeksiyon ve floresan proteinleri müteakip in vivo görüntüleme, uygun içinifade vektörleri zorunlu önkoşuldur. Bu amaçla, üç plasmidler (Şekil 1, ek İçerik 1) geçerli deneysel olarak geliştirildi ve edilmiştir: CAAX kutusu yapısı: Membran hedefleme için, EGFP geni insan HRAS, CAAX kutusu olarak 3 'ucunda erimiş (a EGFP sonuçlanan ) ¹⁶ ve nükleer hedefleme için, EGFP ve MCherry genleri hem 5 birleştirilmiştir ve 'bir H2B olarak, elde edilen zebra balığı histon 2B (H2B) ekson (uçlarını: EGFP ve H2B: MCherry yapısı) ^17. Bu yapıların her biri, bir SV40 geç poliadenilasyon sitesi ve in vitro başlıklı mRNA sentezini ^18,19 tanıyan bir SP6 başlatıcısını içeren pCS2 plazmiti içine klonlanmıştır. Bundan başka, bir hedef ile B. yapıların çeviri optimize lanceolatum Kozak dizileri ve kodonlar, hem tek nükleotid mutagenez (Tablo 2 ve 3, Ek İçerik 1) kullanılarak kolayca adapte edilmiştir. BasNakagawa ^20, B. küçük bir havuz yaklaşımı ed lanceolatum genleri bu türlerde tercih edilen bir Kozak dizisini belirlemek için analiz edilmiştir. bu teorik tercih dizisine en yakın bilinen, doğal olarak meydana gelen bir dizisi B. olmasıdır aktin geni lanceolatum. Üç yapıdan Kozak sekansları, bu nedenle bu aktin geni dizisini eşleşecek şekilde modifiye edilmiştir. Ayrıca, B. kodon kullanımı lanceolatum B'de düşük kullanım olasılığı ile konstruktlarda kodon kullanımı veri tabanı ²¹ ve kodonlar kullanılarak analiz edilmiştir lanceolatum (<% 10) daha yüksek bir kullanım olasılığı ile eşdeğer kodonlarla tarafından, mümkün, değiştirildi.

enjeksiyonu sonuçları, bu vektörlerden protein ifadesi seviyesi, görüntüleme analiz için in vivo olarak uygun olduğunu göstermektedir. Modifiye vektörlerin ifade çıkışı değiştirilmemiş yapıları ile karşılaştırıldığında henüz göz önüne alındığında, biz con değilKozak konsensüs ve kodlama dizileri tanıtıldı değişiklikler verimliliği ihtimal. Kesinlikle bu değişiklikler gerçekten protein ekspresyon düzeyleri üzerinde bir etkisi olup olmadığını test etmek için ilginç olacaktır. Bu doğrultuda, son analiz B. içine mikroenjeksiyon dayalı belcheri Diğer, modifiye edilmemiş vektörler de amphioxus ¹⁵ floresan protein üretimi için mRNA sentezi için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir.

Amphioxus'un endojen yeşil floresan protein ²² içerir. Embriyolar bu nedenle yeşil düşük seviyelerde yanı sıra kırmızı floresan (bizim yayınlanmamış gözlemler) sergiler. Bununla birlikte, bu endojen seviyelerinin eden mRNA yapılarından enjeksiyonundan kaynaklanan floresan seviyeleri ile ilgili olarak önemsizdir. Bu nedenle, Amphioxus embriyoların endojen floresan floresan dürbün ya da çoklu-lazer tarama mikroskopları kullanılarak deneysel gözlemleri rahatsız etmez. Ek olarakEnjeksiyon deneyleri mRNA enjeksiyon ile oluşturulan dışsal floresan yoğunluğu, doğrudan püskürtme karışımı kullanılan mRNA nihai konsantrasyon ile ilişkilidir enjekte edilen malzemenin gerçek miktarına bağlı olduğunu göstermektedir. B. lanceolatum embriyolar kadar 1.8 mcg konsantrasyonu gerçek mRNA konsantrasyonu bağımsız, bazı mRNA kombinasyonları gibi görünüyor, her ne kadar / ul mRNA, daha az B. tarafından tolere edilmesi tahammül eğilimi diğerlerinden daha embriyolar lanceolatum. Bu nedenle, çekirdek MCherry ve membran EGFP mRNA'ların kombinasyonu, tek başına çekirdek eGFP püskürtülmesi daha toksik olduğu ortaya çıktı.

Texas Red dekstran, önceden Amphioxus oosit ^13-15 başarılı bir şekilde enjeksiyon için bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır. Ilginç bir şekilde enjekte edilen mRNA'dan türetilmiş bir flüoresan sinyal Texas Red dekstran içeren çözeltilerin enjeksiyon ve bu durum her iki Amphioxus oosit (n = 4 deney) ve zebrafi sonra elde aslash embriyolar (n = 3 deney). MRNA ve Texas Kırmızı dekstran in vivo transkribe ihtiva eden bir enjeksiyon karışımı, RNaz içermeyen agaroz jeli (Şekil 3, şerit 2) ile yüklendiğinde, mRNA'ya karşılık gelen bant yoktur. Bunun aksine, in vitro transkribe edilmiş mRNA Fenol Red (Şekil 3, hat 1) varlığında bir RNaz içermeyen agaroz jeli üzerinde tespit edilebilir. Jel üzerinde mRNA bozulması için hiçbir kanıt olmadığını göz önüne alındığında, bu sonuçlar Texas Red dekstran tuzak mRNA eğiliminde olduğunu göstermektedir. Bir enjeksiyon solüsyonu olarak kullanıldığında, Texas Red dekstran Bu şekilde enjekte edilen mRNA'nın çevrilmesini önleyebilir. Bu gözlem sonrasında, mRNA ile diğer boyalar (FITC dekstran, Rodamin dekstran ve Oregon Yeşil dekstran) etkileşimleri B. içine agaroz jelleri RNaz-ücretsiz ve enjeksiyon yoluyla hem test edildi lanceolatum veya Zebra balığı (Şekil 3). analizler FITC dekstran jel üzerinde tuzak mRNA değil göstermektedir (Şekil 3, lanE 4) ve (n = 1 deneyi) zebrabalıkları floresan protein ekspresyonuna yol açar, ama B. embriyolar lanceolatum (n = 1 deneyi) (veriler gösterilmemiştir). Rodamin dekstran jel (Şekil 3, kulvar 5) ile ilgili olup tuzak mRNA yapar ve zebra balığı embriyolar floresan protein ekspresyonuna yol açar (n = 1 deneyi) (veriler gösterilmemiştir), ancak ne yazık ki aktivitesi B'de test edilemedi lanceolatum embriyolar. Oregon Green ™ dekstran mRNA, mRNA ile aynı seviyede yer değiştirmektedir Son olarak, agaroz jeli (Şekil 3, hat 3) ile tespit edilemedi hapsi. Bu ikinci boya amphioxus (n = 1 deneyi) floresan protein ekspresyonu engel olmuştur, fakat zebra balığı embriyoları (n = 1 deneyi) (veriler gösterilmemiştir). Sonuç olarak, bu veriler, bir dekstranlar verimli bir şekilde enjekte edilen mRNA'nın translasyonunu inhibe olduğunu ortaya koymaktadır. Doz-yanıt deneyler olmadığını göz önüne alındığında, bu veriler nitel bulunmaktadır. Ilginç bir şekilde bu önleyici etkisi, bağımlı gibi görünmektedirhayvan türleri ileri çalışmalar bu etkinin altında yatan mekanizmaları anlamak için gereğini vurgulamaktadır (zebra balığı karşı Amphioxus). Dekstranlar enjeksiyonlar için renk ajanları olarak kullanılmak üzere Dahası, bu sonuçlar, hazırlık analiz gerektirmektedir.

Belirli bir model için mikroenjeksiyon tekniği geliştirme gene özel manipülasyonlar için kapıyı açar. Amphioxus, örneğin, mikroenjeksiyon ilk tanımı (B floridae olarak) morfolino oligonükleotid enjeksiyonları ^23,24 ile, bir gen, hox1 başarılı demonte izledi. B. sayısı başarılı bir şekilde burada sunulan protokolü kullanılarak her gün enjekte edilebilir lanceolatum embriyolar bu tip çalışmalar ile kesinlikle uyumludur. Ayrıca, bu yöntemlerin ve eldeki yeni yapılarla, bir anda da tasarım ve yerli ilgi mRNA'lara (ya da hâkim-neg enjeksiyonu ile aşırı ekspresyonu ve demonte çalışmalar yapmakative formlar) ya da örneğin microRNA- veya ShRNA tabanlı stratejiler) için gen ifadesini (bozmakta için diğer stratejiler kullanın. Şimdiye kadar, Amphioxus enjeksiyonu sadece bu verimli bir şekilde hareketsiz hale tek aşama, çünkü oosit aşamada gerçekleştirilebilir. Oosit aşamasında enjekte edildikten sonra, ilgi konusu molekülün her yerde bulunan bir embriyo olarak ifade edilir. Gen ekspresyonu değiştirilmiş ya da hücrelerinin bir alt kümesi, yalnızca takip edilmesi gerekiyorsa, bu geliştirme Amphioxus embriyo ^15,25-27 olarak mosaically ifade edilmiştir Böylece, DNA konstruktları, enjekte edilmesi gerekir. DNA yapısı enjeksiyonları da mozaik ifadesi ^15,25-27 yukarıda bahsedilen dezavantajı, geçici transgen deneylerde Amphioxus gelişimi sırasında düzenleyici bölgelerin aktivitesi test etmek için de kullanılabilir.

Sonuçta, Amphioxus mikroenjeksiyon tekniği de belirli genetik loci hedeflenen knock-out veya knock-in dahil stabil transgenesis için kapıyı açar. SistemEksojen DNA'nın kararlı yerleştirilmesi s, hali hazırda böcekler ve amniyota omurgalı ²⁸ hem de işlediği görülmektedir balık transpozon bazlı Tol2 sistemi ile, örneğin mevcuttur. Ayrıca, modifiye çinko-parmak nükleazlardır (ZFNs) veya transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlardır (Talens) veya RNA-güdümlü genom düzenleme araçları dayalı yaklaşımlar (CRISPR / Cas sistemi) nokta mutasyonları üretmek ve knock-spesifik tadilatlar için kullanılan olabilir genomun ²⁹ bölgeleri. Zaten B. kurulmuştur esaret amphioxus yıl boyunca üreme, gerektirecektir Bu çabalar belcheri ^11,30 ve B ^30,31 japonicum ve şu anda A için geliştirilmekte olan lucayanum B. floridae ve Amphioxus türleri B., burada özellikli lanceolatum ^32.

The authors have nothing to disclose.

Yazarlar hayvancılık için "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" tarafından destek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Avrupa Birliği 6. Çerçeve Programı hibe "Embryomics" tarafından ve ANR hibe "tarafından, Michael Schubert ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 ve ANR-11-JSV2-002-01) fonları tarafından desteklenen ANR- Jean-François Nicolas ve Nadine Peyriéras 10-BLAN-121.801 Dev-Süreci ". João Emanuel Carvalho bir FCT doktora bursu ile finanse edilmektedir (SFRH / BD / 86878/2012).

Burada anlatılan vektörler talepleri yazarlara doğrudan ele alınabilir.