Expression von fluoreszierenden Proteinen in

Wir berichten hier über die robuste und effiziente Expression von fluoreszierenden Proteinen nach der mRNA-Injektion in unbefruchtete Eizellen von Branchiostoma lanceolatum. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in dieser basalen chordate wird den Weg für tiefgreifende technische Innovationen in diesem aufstrebenden Modellsystem, auch in-vivo-Bildgebung und genspezifischen Manipulationen zu ebnen.

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Bei der Entwicklung, eine einzelne Zelle führt zu einem ganzen Organismus in einem sehr komplexen Prozess, der beide Zellteilungen und Bewegungen beinhaltet. Um die biologische Prinzipien der Dynamik des Zellverhalten besser zu verstehen, haben Entwicklungsbiologen begonnen, fluoreszenzbasierten In-vivo-Imaging-Techniken verwenden. Bestimmten Kompartimenten der Zellen, wie Zellmembranen, kann entweder durch Behandlungen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, wie dies bereits durch einen Mangel an Spezifität und der Gewebepenetration ¹ behindert oder durch die spezifische Einführung in den Embryo von exogenen mRNAs fluoreszierenden Proteinen ² kodiert. Verschiedene Techniken können für die effiziente Bereitstellung von exogenen Verbindungen, wie mRNAs verwendet werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroinjektion, Elektroporation, Beschuss mit Mikropartikeln, Lipofektion und Transduktion ^3,4 beschränkt. Obwohl alle diese Ansätze können verwendet werden, um exogene Verbindungen in ein einzuführensich entwickelnden Embryo, erlaubt nur die Mikroinjektion der Anwendung vordefiniert und genauen Mengen in jede Zelle ^3. Mikroinjektionstechniken für alle wichtigen Entwicklungsmodell Systeme beschrieben ⁴ (zB Fruchtfliegen, Fadenwürmer, Zebrafisch, Frösche, Mäuse) sowie für einige alternative Modelle ^4, auch für Vergleichsstudien auf das Verständnis der Evolution der Entwicklungsmechanismen abzielen verwendet (zB, Seeanemonen, Ringelwürmer, Seeigel, ascidian Manteltiere, die Schädellose Amphioxus).

Cephalochordata, die zusammen mit Manteltieren und Wirbeltieren Herstellung der Chordaten Stamm, sind besonders gut geeignet, Modelle, die Entwicklung der Chordaten und die Diversifizierung der Wirbeltiere von einem wirbellosen Vorfahren ^5-8 studieren. Die Schädellose Linie abwich sehr früh während der Chordaten Evolution; und vorhandenen Cephalochordata, die in drei Gattungen unterteilt sind (Branchiostoma, Asymmetron und Epigonichthys), ähneln Wirbeltieren sowohl in Bezug auf die gesamte Anatomie und Genom-Architektur ^8.5. Von den etwa 30 Arten von Cephalochordata, die bisher beschrieben wurden, fünf sind für embryologische und Entwicklungsstudien ^6,9 verfügbar: Asymmetron lucayanum (der Bahama Lanzettfisch) Branchiostoma floridae (der Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Europäische Amphioxus) Branchiostoma belcheri (die chinesische Amphioxus) und Branchiostoma japonicum (der japanische Amphioxus). Reife Erwachsene von drei dieser Arten (B. lanceolatum, B. belcheri und B. japonicum) induziert werden kann, um bei Bedarf während der Brutzeit ^10,11 laichen. Darüber hinaus zumindest für B. lanceolatum, effiziente Laich kann auch in künstlichem Meerwasser ¹² induziert werden, wodurch diese besondere Schädellose Arten zugänglich für laboratorer Jahren, die keinen Zugang zu natürlichen Meerwasser. Die Kombination, in B. lanceolatum, eine bequeme und sichere Zugang zu Embryonen mit einem effizienten Liefermethode, wie Mikroinjektion, bisher das einzige Fördertechnik, bei Amphioxus entwickelt (sowohl in B. floridae und B. belcheri) ^13-15, wird die Entwicklung einer zu ermöglichen neue Suite von manipulativen Techniken, einschließlich Linie tracing- und dynamische Zellverhaltensbasierte Ansätze.

Ein Protokoll für die effiziente Mikroinjektion von mRNAs, um fluoreszierende Proteine, die in dem B. auszudrücken lanceolatum Embryo wurde daher entwickelt. Darüber hinaus, um einen grundlegenden Toolkit für Live-Imaging von B. liefern lanceolatum Embryonen wurden Vektorsysteme entwickelt, die membranassoziierten und nukleare Expression von fluoreszierenden Proteinen ermöglichen. Für Membran Targeting wurde enhanced green fluorescent protein (eGFP) in die menschliche HRAS CAAX-Box und Kernlokalisation von mCherry und eGFP fusioniert wardurch Fusion an der Zebrafisch Histon 2B (H2B) Exon (Abbildung 1, Ergänzungs Datei 1) erhalten. Weiterhin mit dem Ziel, um die Proteintranslation zu optimieren, die Kozak-Sequenzen und Codons der Konstrukte wurden modifiziert und auf den Einsatz in B. angepaßt lanceolatum. Zusammengenommen können die hier vorgestellten Einspritzverfahren und Expressionsvektoren, als Grundlage für die Erzeugung von neuen experimentellen Ansätzen für Kephalochordaten dienen, insbesondere Analysen unter Verwendung der in vivo-Abbildungstechniken letzte Fluoreszenzbasis.

1. Vorbereitung der Instrumente und Reagenzien

1. Übertragen Pasteurpipetten
   1. Erzeugt eine Reihe von Transferpasteurpipetten mit unterschiedlichen Spitzendurchmesser, indem 230 mm langen Pasteurpipetten über einer Flamme mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Sicherzustellen, dass die Verjüngung so lange wie möglich für glatte und feine Steuerung der Aspiration.
   2. Mit einem Diamantschreiber, kratzen die Pipette entlang einer Linie senkrecht zu der Länge der Pipette. Mit beiden Händen, ziehen Sie die Pipette parallel zu seiner Länge, um einen stumpfen Schnitt erzeugen. Schnell flammLack die Pipette ohne Abdichtung der Spitze.
   3. Variieren die Durchmesser der Spitze mit dem Stadium der Eizellen / Embryonen zu pipettierende: 300-400 & mgr; m für die unbefruchteten Eizellen (etwa 150 & mgr; m im Durchmesser), 600 um für die befruchteten Eier (etwa 500 & mgr; m im Durchmesser), 200 bis 400 & mgr; m für schraffierten Neurulae. Pipetten mit einem Mund-überwacht Absaugschlauch Eizellen / Embryonen von einem Gericht überzum anderen.
2. Injektionsnadeln
   1. Bearbeiten Sie die Kapillaren mit Handschuhen an RNase-freien Bedingungen zu gewährleisten. Verwenden Borosilikatglas mit Filament Kapillaren mit Abmessungen von 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, Länge 10 mm.
   2. Wenn Kapillaren von der Art der Heizung Faden Nadelzieher in der Materialliste beschrieben herausgezogen wird, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 600, ziehen 50, Velocity 80, Zeit 60, 200 oder 300 Druck andernfalls sicher, dass die Form, das ist Entscheidend für die erfolgreiche Injektionen, wie in Figur 2 mit den folgenden Eigenschaften gezeigt: 4-8 & mgr; m Außenkopfdurchmesser von 2 cm Verjüngungslänge.
      HINWEIS: Nadeln kann vor der Laichzeit gezogen und während der Saison verwendet werden.
3. 5% Phenol Red-Stammlösung (4x)
   1. Bereiten Sie frisch vor jedem Laichzeit.
   2. In ein 0,22 um-Filterrohr, wiegen 25 mg Phenol Red Pulver.
   3. 0,5 ml der DNase- und RNase-freies Wasser aufdas Rohr mit dem Pulver.
   4. Spin für 3-5 min bei 18.000 × g bei Raumtemperatur an filter Sterilisieren der Lösung und die Kristalle, die die Injektionsnadel verstopfen können.
   5. Lagerung bei 4 ° C oder lagern Sie 250 ul Aliquots bei -20 ° C.
4. 0,25 mg / ml poly-Lysin-Lösung
   1. Bereiten Sie frisch vor jedem Laichzeit.
   2. Man löst 5 mg Poly-L-Lysin in 20 ml destilliertem Wasser. Speicher 5 ml Aliquots bei -20 ° C.
   3. Verwenden eine aufgetaute Aliquots sofort und nur einmal, um reproduzierbare und stabile Haftung der Oozyten zu dem Poly-Lysin-beschichtete Schale gewährleisten.
5. mRNA-Synthese
   1. Bereiten Sie frisch vor jedem Laichzeit.
   2. Linearisieren 5 ug DNA von Interesse mit dem angemessenen Enzym (üblicherweise 2 Stunden, bei 37 ° C). Um die Vollständigkeit der Verdauung zu ermitteln, führen 2% des Volumens der Verdauung Mischung auf einem 1% Agarose-TBE-Gel in TBE-Puffer bei 150 W für 20 min.
   3. Entpacken Sie die lineatigte DNA mit 25: 24: 1 Phenol (pH 8,0): Chloroform: Isoamylalkohol. Vortex für 20 Sekunden, Zentrifuge 10 min bei 18.000 xg und sammeln die wässrige (obere) Phase.
   4. Die wässrige Phase wird nochmals mit 24: 1 Chloroform: Isoamylalkohol. Vortex für 20 sec, Zentrifuge 10 min bei 18.000 xg wird die wäßrige Phase.
   5. Auszufällen die linearisierte DNA mit 100: 10: 300 linearisierte DNA: 3 M Natriumacetat (pH 5,2): 100% Ethanol über Nacht bei -20 ° C.
   6. Zentrifuge 20 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Spülen in 70% Ethanol.
   7. Zentrifuge 10 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Trocknen lassen und resuspendieren in RNase-freiem Wasser mit einer Endkonzentration von 0,5 ug / ul.
   8. Transkribieren 1 ug linearisierte DNA unter Verwendung eines mRNA-Synthese-Kits mit der geeigneten Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   9. Entpacken Sie die mRNA mit 5: 1 Phenol (pH 4,7): Chloroform und Ammoniumacetat im Kit enthalten Stop-Lösung.
   10. Vortex für 20 Sekunden, CEntrifuge 10 min bei 18.000 xg und sammeln Sie die wässrige Phase.
   11. Die wässrige Phase wird nochmals mit 24: 1 Chloroform: Isoamylalkohol. Vortex für 20 sec, Zentrifuge 10 min bei 18.000 xg wird die wäßrige Phase.
   12. Fällt die mRNA mit 100% Isopropanol über Nacht bei -20 ° C.
   13. Zentrifuge 20 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Spülen in 80% Ethanol.
   14. Zentrifuge 10 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Lassen Sie das Pellet trocken bei Raumtemperatur nicht länger als 5-10 Minuten, da es dann schwierig, wieder zu suspendieren können. Resuspendieren in DNase- und RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von mindestens 2 & mgr; g / & mgr; l, um ein ordentliches endgültigen mRNA-Konzentration in der Injektionsmischung sicherzustellen.
   15. Um die Qualität und Größe des Transkriptionsprodukts zu überprüfen, führen 0,5 ul der mRNA auf einer RNase-freie 1% Agarose-TBE-Gel in TBE-Puffer bei 150 W für 20 min. Shop 2 ul Aliquots bei -80 ° C.
6. Poly-Lysin-beschichteten Schalen
   HINWEIS: Poly-Lysin CoAted Gerichte werden verwendet, um die Eizellen während der Injektion zu immobilisieren.
   1. Für jede 35 mm Zellkulturpetrischale (insgesamt 5), bedecken den Boden der Petrischale mit 1 ml der aufgetauten 0,25 mg / ml poly-Lysin-Lösung. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min.
   2. Für jede 35 mm Zellkulturpetrischale (insgesamt 5), übertragen Sie die 0,25 mg / ml Poly-Lysin-Lösung in einen anderen 35-mm-Zellkultur-Petrischale. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min.
   3. Entsorgen Sie die 0,25 mg / ml Poly-Lysin-Lösung.
   4. Lassen Sie die Petrischalen trocken, kopfüber bei Raumtemperatur für 2 Std.
   5. Bewahren Sie die Poly-Lysin-beschichtete Gerichte in Plastikfolie eingewickelt bei 4 ° C, um eine Verunreinigung für maximal eine Woche zu vermeiden.
7. Agarose-beschichteten Schalen
   Hinweis: Sie werden an Kultur injizierten Embryonen verwendet. Die Agarose ein Kissen für die injizierten Embryonen und verhindert, dass sie das Festhalten an dem Boden der Schale.
   1. Stellen künstlichem Meerwasser (ASW) mit 37 bis 38 g / l commercial Salze + 0,25 mM _NaHCO3 in Umkehrosmosewasser.
   2. Löse Agarose zu einer Konzentration von 1% in 0,22 & mgr; m-filtriert ASW durch Erwärmen der Lösung in einer Mikrowelle.
   3. Rasch gießen warmen Agarose-Lösung aus einer 35 mm Petrischale in eine andere, um eine sehr dünne Agarose Beschichtung der Schale zu sichern.
   4. Bewahren Sie die Agarose-beschichteten Schalen in Saran Wrap verpackt bei 4 ° C, um eine Verunreinigung für maximal eine Woche zu vermeiden.
8. Einspritzmischung und Beladung der Injektionsnadeln
   1. Über 2 Stunden vor Beginn der Injektionen, einen 2 ul Injektion Mischung in RNase- und DNase-freiem Wasser mit einer Endkonzentration von 1 bis 1,8 ug / ul von mRNA, 15% Glycerin, 1,25% Phenolrot.
      HINWEIS: Die Phenolrot färbt die Lösung, die die Injektionseffizienz und die Identifizierung erfolgreich injizierten Embryonen ermöglicht. Glycerol begünstigt mRNA Diffusion innerhalb der Eizelle.
   2. Zentrifuge 4 min bei 18.000 xg zuPellet-Kristallen. Halten Sie auf dem Eis bis zum Gebrauch.
   3. Mit einer 10 ul-Pipette gesammelt 0,5 ul der Injektionsmischung, die Vermeidung der Boden des Röhrchens, wo die Kristalle wurden pelletiert.
   4. Verfüllen mindestens zwei Einspritznadeln (im Falle einer bricht während der Injektion) durch Pipettieren der 0,5 ul Tropfen der Einspritzmischung in der großen Öffnung der Nadel.
   5. Installieren Sie die Nadeln in einem Vorratsglas mit Flüssigkeit am Boden bei 4 ° C, um Verdunstung der Injektionsmischung zu verhindern. Lassen die Injektionsmischung langsam zu der Spitze der Injektionsnadel Dauer von mindestens 1 Stunde, um die Erzeugung von Blasen zu minimieren.
   6. Speicher zusätzliche Einspritzung Mischung bei -80 ° C für maximal drei weitere Verwendungen, wonach der mRNA Qualität verschlechtert sich (Daten nicht gezeigt).

2. Sammlung von biologischem Material, Mikroinjektion und Embryo Kultur

1. Eizelle und Samensammlung
   HINWEIS: Siehe Theodosiouet al. ¹² für ein detailliertes Protokoll zur Induktion von Laich- und zur Keimzelle Sammlung.
   1. Shock Männer und Frauen in ASW bei 23 ° C für 24 Stunden.
   2. Ein bis zwei Stunden vor Sonnenuntergang, übertragen Sie die Erwachsenen in einzelne Tassen in ASW bei 19 ° C, weil die meisten Erwachsenen werden 1-2 Stunden nach Sonnenuntergang zu laichen.
   3. Spülen Sie 35 mm Petrischalen in gefiltert ASW und trocknen lassen upside-down, um die Eizellen von Festhalten an der Boden der Schale zu verhindern.
   4. Nach dem Laichen sofort sammeln Spermien und Eizellen mit einem 1000 ul Pipette.
      1. Halten Spermien und Eizellen getrennt von Erwachsenen Amphioxus, da der Kontakt ist schädlich für die Gesundheit Gameten (Daten nicht gezeigt).
      2. Darüber hinaus vermeiden erschreckte die Erwachsenen, die zu Bewegungen, die zerstreuen führt und damit zu verdünnen, sowohl Spermien und Eizellen. Um die Spermien aktiv so lange wie möglich zu halten und zu optimieren Befruchtungsrate, sammeln das Sperma so konzentriert wie möglich ist.
   5. HaltenSperma auf Eis in einem 1,5-ml-Tube.
   6. Übertragen Oozyten in gefiltert ASW in die vorgespült 35 mm Petrischalen.
   7. Über 100-500 Oozyten mit einer zuvor gezogen 300-400 um Transfer Pasteur-Pipette in ein anderes 35 mm Petrischale, die Injektionen durchzuführen.
   8. Befruchten der Rest der Kupplung als Kontrolle für Spermien und Eizelle Qualität oder für andere Experimente.
2. Oocyteninjektion
   1. Installieren der Injektionsnadel auf dem Mikromanipulator in einem Winkel von 50 ° relativ zu der horizontalen Ebene.
      HINWEIS: Winkel von weniger als 50 ° werden die Oozyten herum auf der Schale zu drücken, während die Winkel von mehr als 50 ° wird eine angemessene Kontrolle der Nadelposition relativ zu der Eizelle nicht zulassen.
   2. Unter einem Fluoreszenz-Binokular mit 25X Okulare, übertragen 30 Oozyten mit der 300 bis 400 & mgr; m Übertragungspasteurpipette auf einer Poly-Lysin-beschichtete Schale mit ASW gefiltert.
   3. Zahlen Sie die Eizellen entlang einer Linie durchout-Injektionen in einer geordneten Art und Weise und von nicht-injizierten Oozyten injiziert unterscheiden. Injizieren kleine Zahlen (30 Oozyten), um die Belichtungszeit der Oozyten zu Poly-Lysin, die sich entwickelnden Embryonen zu deformieren neigt minimieren (Daten nicht gezeigt).
   4. Verwenden Sie die Dunkelfeldbeleuchtung, um die Eizellen machen, wie durchlässig wie möglich.
   5. Mit der Grobbewegungsknopf des Mikromanipulators, bringen die Injektionsnadel in der Nähe einer Eizelle.
   6. Mit einer feinen Pinzette, aufgeschnitten die Nadel auf der Ebene, wo die Spitze beginnt, gekrümmt sein. Durch Pulsen mit dem Injektor, überprüfen Sie, ob Rot Injektion Mischung ist eigentlich aus der Nadel fließen.
   7. Bei 200-facher Vergrößerung und mit der Feinbewegungsknopf des Mikromanipulator, sanft bewegen die Injektionsnadel in den Kern der Eizelle.
      HINWEIS: Wenn zu oberflächlich eingesetzt, wird der injizierten Lösung nicht im Inneren der Eizelle bleiben. Wenn sie zu weit eingeführt wird, wird die Eizelle zerstört werden.
   8. Spritzen Sie mit 1-3 Impulsen von 120 msec duratIon und 1-10 psi Druck. Wenn die Nadel fein genug ist, zu injizieren mit kontinuierlichen Fluss bei konstantem Druck. Sicherstellen, dass das Injektionsvolumen entspricht 1/5 bis 1/3 des Volumens einer einzelnen Eizelle.
   9. Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel heraus schnell, um ein Auslaufen der Eizelle zu vermeiden.
   10. Stellen Sie sicher, dass die eingespritzte Lösung innerhalb der Eizelle bleibt und nach ein paar Sekunden, breitet sich das eingespritzte Lösung in der gesamten Eizelle.
   11. Fahren Sie mit dem nächsten Eizelle in der Schlange.
   12. Halten Sie ein paar nicht injizierten Embryos auf jede Serie als Negativkontrolle, um die Hintergrundfluoreszenz schätzen bei der Suche nach injiziert Embryonen.
3. Düngung, Auswahl der injizierten Embryonen und Embryokultur
   1. Befruchten die Oozyten, sobald eine Reihe eingespritzt wurde. Wie Oozytenqualität nimmt mit der Zeit zu injizieren und befruchten Eizellen innerhalb 1 Stunde nach dem Laichen ^12.
   2. In Abhängigkeit von der Spermienkonzentration, fügen Sie 1-5 Tropfen Sperma zu den Eizellen undschwenken Sie die Schüssel.
      HINWEIS: Die Befruchtung Umschlag ist auf den zu Embryonen werden nach ca. 1 min.
   3. Ermöglichen die Embryos aus dem Poly-Lysin-beschichtete Schale zu trennen, während der Injektion eine weitere Reihe von Oozyten.
   4. Übertragen Sie die Embryonen mit dem 600 um Übertragungs Pasteur-Pipette in ein Agarose-beschichteten Petrischale. Entfernen Sie die Embryos aus dem Poly-Lysin-beschichtete Schale so bald wie möglich, wenn überhaupt, vor dem 2-Zellstadium möglich.
      HINWEIS: Bei längerer Einwirkung von Poly-Lysin, neigen die Embryonen zu dicht gepackten blastulae, an der Seite berühren den Boden der Schale abgeflacht werden.
   5. An der 2-Zelle, um 4-Zell-Stadium, wählen mit einem fluoreszierenden Binokular mit DSR Filter die erfolgreich-injizierten Embryonen, dh solche mit einer normalen Morphologie, die ein Phenol Red abgeleiteten roten Fluoreszenzsignal aufweisen.
   6. Halten Sie die Embryonen in Kultur gefiltert ASW in Agarose-beschichteten Petrischalen bei 19 ° C, bis die gewünschte Stufe fürin vivo Bildgebung.

Die zuvor dargelegten Protokoll stellt die Grundlage für die Mikroinjektion von B. lanceolatum Oocyten und damit die Einführung in die Entwicklung von B. lanceolatum Embryonen von mRNA kodiert fluoreszierenden Proteinen für die in vivo Bildgebung. Obwohl die Technik ist sicherlich robust und zuverlässig ist, die Rate der erfolgreichen Injektionen mit diesem Protokoll bleibt variabel (Tabelle 1). Die sehr wahrscheinliche Erklärung für diese interessante Tatsache ist die extreme Variabilität der Eizelle Kupplungen: verschiedene Eigelege der Tat sehr unterschiedlich verhalten, wenn sie auf die Einspritzdruck unterzogen. Einige Oozyten sind ziemlich elastisch und neigen dazu, sich am Boden der Schale zu glätten, während andere ziemlich steif und rund bleiben nach der Injektion. Außerdem neigen einige Oozyte Chargen in ihren Chorion Membranen bei Injektion aufzublasen, während andere einfach lysieren (Daten nicht gezeigt). Keine offensichtliche Korrelation konnte zwischen Eizelle Verhalten bei der Injektion und embryonalen eingerichtet werdenEntwicklung nach der Befruchtung. Deshalb ist es schwierig vorauszusagen, welcher Kategorie von Oozyten besten geeignet für die Mikroinjektion ist. Jedoch nach der Befruchtung, können Embryonen, normale Entwicklung so früh identifiziert werden als Spaltstufen: 2-Zelle, um 4-Zell-Stadium Embryonen können als normal angesehen werden, wenn die Kontaktfläche zwischen Blastomeren klein ist, während ein verdichteter Spaltungs-Zellstadium, in dem einzelne Zellen sind schwer zu erkennen, ist definitiv nicht normal.

In unseren Händen, nicht etwa die Hälfte der Eizellen nicht das Trauma durch die Injektion und etwa die Hälfte der Embryonen, die überleben, die Injektion weisen eine spezifische Fluoreszenzmarkierung zu tun verursacht überleben. Somit schätzen wir, dass mit diesem Injektionsprotokoll, von 50 bis 120 Embryonen können erfolgreich auf einem gegebenen Laich Tag ergab zwischen 15 und 60 markierten Embryos injiziert werden.

Die rote Fluoreszenz des Phenolrot in 2-Zelle, um 4-Zell-Stadium Embryos sehr zuverlässig markiert Embryonen, die habenrichtig injiziert wurde, als 100% der Embryos auf diese Weise ausgewählten anschließend die fluoreszierenden Proteinen, die von der injizierten mRNA codiert werden. Zusätzlich gibt es eine sehr deutliche positive Korrelation zwischen der Intensität der Fluoreszenz von Phenolrot in der 2-Zelle, um 4-Zellen-Stadium und dem Zeitpunkt des Auftretens des durch die Proteine ​​von der injizierten mRNA codiert erzeugten Fluoreszenz. Diese Korrelation ermöglicht somit die Identifizierung derjenigen Embryonen, die die höchste Menge an mRNA während des Spritzvorgangs erhalten.

Wenn das Signal des fluoreszierenden Proteins von der injizierten mRNA codiert wird nach Auswahl von Phenol Red-positiven Embryonen festgestellt wird, wird empfohlen, die Spritzmischung auf einer RNAse freie Gel, um laufen, um mRNA-Abbau oder Überfüllen (Abbildung 3) . In Spur 1 ist eine intakte mRNA-Bande nachgewiesen. Die Injektion von dieser Mischung führte zu einem starken Fluoreszenzsignal im Embryo. Im Gegenteil, in Spur 2, die auf eine andere experimen entsprichtt wobei Phenolrot wurde mit Dextran Farbstoff in der Mischung ersetzt (siehe Diskussion für weitere Details), erscheint die mRNA, die von dem Farbstoff und Dextran Injektion dieser Mischung nie Fluoreszenzsignal im Embryo führten hängenbleiben.

Unter Verwendung dieser Mikroinjektionstechnik und unsere Konstrukte (Tabellen 2 und 3, Ergänzungs Datei 1) (siehe Diskussion), können wir daher reproduzierbar homogene Fluoreszenzmarkierung im gesamten Embryo mit mCherry oder eGFP im Kern und mit eGFP an der Membran (Figur 4) . Das Abbildungsprotokoll zur Erzeugung Abbildung 4 werden an anderer Stelle beschrieben (Faure et al., In Vorbereitung). Abhängig von der Menge an mRNA injiziert, fluoreszierende Proteinexpression wird typischerweise zwischen 16-Zelle (4A) und 64-Zellstadien nachweisbar und bleibt mindestens bis zur späten Neurulastadium nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Spätere Stadien wurden nicht getestet. Nuclear Signaltypischerweise früher erscheint als Membran Signal möglicherweise aufgrund der intrinsisch diffuse Natur der Membran im Vergleich zu der Packungsdichte des Kerns (Daten nicht gezeigt). Obwohl es noch nicht systematisch überwacht worden, Embryonen sowohl mit einem Kern- und einem Membran-Label injiziert erscheinen weniger gesund als Embryonen ausschließlich mit einem nuklearen eGFP-Label eingespritzt sein. Interessanterweise scheint dieser Effekt unabhängig von der Gesamtmenge an mRNA injiziert zu sein als die Gesamtmenge der injizierten mRNA gleich ist, ob ein oder zwei mRNA-Spezies werden zu der Mischung enthalten (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 1: Konstruieren Sie Details. Skizzen von (A) die Membran-Targeting eGFP (eGFP: CAAX-Box), (B) die Kernziel eGFP (H2B: eGFP) und (C) die Kernziel mCherry (H2B: mCherry) konstruiert are gezeigt.

Abbildung 2: Form einer repräsentativen Injektionsnadel. (A) Die Verjüngung beträgt ungefähr 2 cm in der Länge und die Nadelkurven an der Spitze. Balken = 2 mm. (B) Vergrößerung des eingerahmten Bereich in A. Die Position zum Abschneiden des Nadel (Pfeil) ist in der Kurve der Nadel. Die Spitze der Nadel wird durch den Pfeil angedeutet. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abb. 3: Wechselwirkungen von mRNA und ausgewählte Fluoreszenzfarbstoffe (A) durch die Migration aus einer Mischung, die mRNA und Phenolrot in Spur 1 undvon mRNA und Texas Red Dextran (mit einer Endkonzentration von 3,3 mg / ml) in Spur 2 (B) Ergebnis der Migration von einer Mischung, enthaltend mRNA und Oregon Green Dextran (mit einer Endkonzentration von 3,3 mg / ml) in Spur 3, der mRNA und FITC-Dextran (mit einer Endkonzentration von 3,3 mg / ml) in Spur 4 und der mRNA und Rhodamin-Dextran (mit einer Endkonzentration von 3,3 mg / ml) in Spur 5. Gel Migrationszeit in A und B war anders. Aus Gründen der Klarheit, die schwarzen Rechtecke in einer Maske eine Lichtreflexion und die gestrichelten Linien umreißen die Migrationswege. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 4: 3D-Rendering (Amira Software) von Amphioxus Embryonen mit mRNAs für fluoreszierende Proteine ​​kodieren injiziert Bilder sind.aus 3D Zeitlücken auf einer optimierten Leica SP5 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen extrahiert (A) 16-Zell-Stadium Embryos exprimiert Kern H2B.:. eGFP (B) Gastrulastadium Embryo exprimiert Kern H2B: mCherry und die Membran-Targeting eGFP:. CAAX-Box (C) Gastrulastadium Embryo exprimieren nukleare H2B: mCherry und die Membran-Targeting eGFP: CAAX-Box. Der optische Abschnitt zeigt interne Zellen mit Kern mCherry und membranassoziierten eGFP Signale. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m.

Tabelle 1:. Injection Erfolgsraten Die injizierten Konstrukte, die Anzahl der injizierten Embryonen, die Injektion und die Anzahl von markierten (oder injizierten erfolgreich) Embryonen überlebten sind angegeben, ebenso wie der Gesamtanteil der erfolgreicher Injektionen.

Tabelle 2:. Vorläufige Optimierung der Kozak-Sequenzen Ursprüngliche und mutiert Kozak-Sequenzen sind für jedes Konstrukt angegeben. Die eingeführten Mutationen zu erholen die Kozak-Sequenz des B. lanceolatum Actin-Gens, das sehr stark ähnelt, dass der abgeleiteten theoretischen bevorzugt Kozak Sequenz von amphioxus (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).

Tabelle 3: Vorläufige Optimierung der Codon-Nutzung. Ursprüngliche und mutierten Codons für jedes Konstrukt angegeben. Während dies nicht experimentell getestet, die eingeführte Mutations sollen mRNA-Translation in Amphioxus zu optimieren.

Ergänzende Datei 1: Konstruieren Sequenzen Die Nukleotidsequenzen von (A) die Membran-Targeting eGFP. (EGFP: CAAX-Box), (B) die Kernziel eGFP (H2B: eGFP) und (C) die Kernziel mCherry (H2B : mCherry) Konstrukte werden im Rahmen der pCS2 + Vektorgerüst gegeben. Die Hauptbereiche von jedem der Konstrukte codiert sind farblich gekennzeichnet: eGFP (grün), mCherry (rot), Membranlokalisierungssignal aus menschlichen HRAS (CAAX-Box) (cyan blue), Zebrafisch-Histon-2B Exon (H2B) (gelb).

In diesem Artikel zeigen wir, zum ersten Mal, eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für die Injektion von B. lanceolatum Oozyten, die nach B. floridae ^13,14 und B. belcheri ^15, ist somit die dritte amphioxus Spezies, für die eine solche Technik ist beschrieben worden. Wichtig ist, dass das hier beschriebene Protokoll enthält auch die Beschreibung des Vektor-Systeme zur Herstellung von fluoreszierenden Proteinen in B. geeignet lanceolatum von injizierten mRNA in vitro hergestellt (nachstehend beschrieben). Zusammen erlauben in vivo-Abbildung von der frühen Entwicklung von amphioxus und die Analyse von dynamischen Zellverhalten, dass die frühesten Ereignisse morphogenetic im Embryo zugrunde liegen, wie beispielsweise Spaltung und Gastrulation diese neuen Werkzeugen.

Im allgemeinen hat der Mikroinjektionstechnik den Vorteil, dass die Abgabe in eine Zielzelle, eines vordefinierten Volumens eines spezifischen Verbindung. Mit diesem als sHilfe ist eine wichtige Einschränkung dieser Technik der begrenzten Anzahl der Zellen, die in einem bestimmten Experiment injiziert werden kann. Beispielsweise ist die hier beschriebene Protokoll für B. lanceolatum die Injektion von 100 bis 120 Eier pro Injektion Sitzung, von denen etwa die Hälfte wird beschriftet werden (Tabelle 3). Für B. floridae, die Zahlen sind sehr ähnlich mit 500 oder mehr Eier, die pro Tag injiziert werden kann, von denen mehr als 50% wird das Einprägen ^13,14 überleben. Während die Protokolle zum Injizieren B. lanceolatum und B. floridae Eier ähneln sich gegenseitig, die B. belcheri Technik ist etwas anders: Die Eier werden auf Poly-Lysin beschichtete Deckgläser unter einem Umkehrmikroskop unter Verwendung eines Mikroinjektorkopfs einer anderen Marke gesetzt und Injektionen werden durchgeführt. Dieser Ansatz ermöglicht es anscheinend die Injektion von 200 bis 300 B. belcheri Eier pro Injektion Sitzung mit einer Überlebensrate nach dem Schlüpfen bei Neurulastadium, of 89,39% auf 95,83% ^15. Unter Berücksichtigung der Unterschiede in den Protokollen, ist es schwierig zu wissen, ob die Unterschiede in der Erfolgsraten durch speziesbedingten oder protokollbezogenen Unterschiede sind. Man müsste die verschiedenen Arten parallel zu den verschiedenen Protokollen zu testen, um diese Frage zu beantworten. Dennoch weiter die Anzahl der Eizellen für die Abgabe von exogenen Verbindungen gezielt zu erhöhen, werden andere Protokolle müssen für amphioxus entwickelt werden. Candidate Techniken umfassen Elektroporation, Beschuss mit Mikropartikeln, Lipofektion, Transduktion und ^4. Bemerkenswerterweise wurde die Elektroporation bereits als Standardverfahren zur Einführung der exogenen Materials in befruchtete ascidian tunicate Eiern festgestellt, für die Untersuchung der Entwicklung von Entwicklungsmechanismen ⁸ eine andere Invertebraten chorModell verwendet.

Für eine erfolgreiche Mikroinjektion und anschließende in vivo-Abbildung von fluoreszierenden Proteinen, geeignetExpressionsvektoren sind eine zwingende Voraussetzung. Zu diesem Zweck wurden drei Plasmide entwickelt und experimentell bestätigt (Abbildung 1, Ergänzungs Datei 1): für die Membran-Targeting, das EGFP-Gen an seinem 3'-Ende mit dem menschlichen HRAS CAAX-Box fusioniert wurde (was eine eGFP CAAX-Box-Konstrukt ) ¹⁶ und zum Kern-Targeting sowohl die eGFP und die mCherry Gene wurden an ihren 5'fusioniert 'Enden mit dem Zebrafisch Histon 2B (H2B) Exon (was jeweils in einer H2B: eGFP und H2B: mCherry Konstrukt) ^17. Jedes dieser Konstrukte wurde in das Plasmid pCS2 + einen späten SV40-Polyadenylierungsstelle und SP6 Promotor, der die in vitro-verkappten mRNA Synthese ^18,19 kloniert worden. Weiterhin mit dem Ziel, um die Translation der Konstrukte in B. optimieren lanceolatum, sowohl die Kozak-Sequenzen und die Codons mit Single Nucleotide Mutagenese (Tabellen 2 und 3, Ergänzungs Datei 1) angepasst. Basauf dem Ansatz von Nakagawa ^20, einem kleinen Pool von B. ed lanceolatum Gene wurde analysiert, um einen bevorzugten Kozak-Sequenz in dieser Spezies zu identifizieren. Das nächst bekannten natürlich vorkommenden Sequenz zu dieser theoretischen Sequenz bevorzugt ist, dass der B. lanceolatum Actin-Gens. Die Kozak-Sequenzen der drei Konstrukte wurden daher geändert, um dieses Actin-Gen-Sequenz entsprechen. Ferner die Codonverwendung von B. lanceolatum wurde mit der Codon Usage Datenbank ²¹ und Codons in den Konstrukten mit einer niedrigen Einsatzwahrscheinlichkeit in B. analysiert lanceolatum (<10%) ersetzt wurden, soweit möglich, durch entsprechende Codons mit einer höheren Einsatzwahrscheinlichkeit.

Die Ergebnisse der Injektionen zeigen, dass das Niveau der Proteinexpression von diesen Vektoren ist für in-vivo-Bildgebung analysiert. Da die Expressionsleistung der modifizierten Vektoren wurde nicht mit der unmodifizierten Konstrukten verglichen wir nicht con kannClude auf die Effizienz der Modifikationen, die in der Kozak-Konsensus und den codierenden Sequenzen eingeführt wurden. Es wäre durchaus interessant sein, um zu testen, ob diese Änderungen tatsächlich eine Auswirkung auf die Protein-Expressionsniveaus. In diesem Sinne, eine neue Analyse auf Mikroinjektionen basiert in B. belcheri bedeutet, dass andere, nicht-modifizierten Vektoren können auch für die Synthese von mRNA, die für fluoreszierende Proteinproduktion in amphioxus ¹⁵ verwendet werden.

Amphioxus enthält endogenen grün fluoreszierende Proteine ^​​22. Die Embryonen weisen daher niedrige grüne als auch rote Fluoreszenz (unsere unveröffentlichte Beobachtungen). Jedoch sind diese endogenen vernachlässigbar gegenüber den Fluoreszenzpegel von der Injektions unserer mRNA-Konstrukte resultieren. Daher wird der endogenen Fluoreszenz amphioxus Embryonen nicht stören experimentellen Beobachtungen unter Verwendung von fluoreszierenden Fernglas oder Mehrlaserrastermikroskope. AußerdemDie Injektionsexperimente zeigen, dass die Intensität der Fluoreszenz, die durch exogene mRNA Einspritzung erzeugt, hängt von der tatsächlichen Menge des eingespritzten Materials, das direkt mit der Endkonzentration von mRNA in der Einspritzmischung verwendet korreliert. B. lanceolatum Embryonen dazu neigen, um eine Konzentration von bis zu 1,8 & mgr; g / & mgr; l mRNA, wobei, unabhängig von der tatsächlichen mRNA Konzentration, einige Kombinationen mRNA scheint weniger von B. toleriert tolerieren lanceolatum Embryonen als andere. Somit kann die Kombination von Kern mCherry und Membran eGFP mRNAs erschien toxischer als die Injektion von Kern eGFP allein.

Texas Red Dextran vorher als Tracer für die erfolgreiche Injektionen in amphioxus Oozyten ^13-15 verwendet. Interessanterweise wurde ein Fluoreszenzsignal von der injizierten mRNA abgeleitet nie nach der Injektion von Lösungen, Texas Red Dextran und dies in beiden amphioxus Oocyten (n = 4 Experimenten) und zebrafi erhaltenensh Embryos (n = 3 Experimente). Wenn eine Einspritzmischung, die in vitro transkribierte mRNA und Texas Red Dextran auf einem RNase-freien Agarosegel (Abbildung 3, Spur 2) geladen ist, ist die Bande, die dem mRNA fehlt. Im Gegensatz dazu wird in vitro transkribierte mRNA ist auf einem RNase-freien Agarosegel in Gegenwart von Phenolrot (Abbildung 3, Spur 1) detektierbar ist. Da es keine Hinweise auf mRNA-Abbau auf dem Gel, legen diese Ergebnisse nahe, dass Texas Red Dextran neigt zu stoppen mRNA. Wenn in einer Injektionslösung verwendet wird, könnte Texasrot Dextran verhindern so die Übersetzung der injizierten mRNA. Nach dieser Beobachtung wurden die Wechselwirkungen von anderen Farbstoffen (FITC-Dextran, Rhodamin Dextran und Oregon Green Dextran) mit mRNA auf RNase-freies Agarosegelen und durch Injektion in B. geprüft, sowohl lanceolatum oder Zebrafisch (Abbildung 3). Die Analysen zeigen, dass FITC-Dextran wirkt einem mRNA auf Gel (Abbildung 3, lane 4) und führt zu einer Fluoreszenzprotein-Expression in Zebrafischen (n = 1 Versuch), aber nicht in Embryos von B. lanceolatum (n = 1 Versuch) (Daten nicht gezeigt). Rhodamin-Dextran wirkt einem mRNA auf Gel (Abbildung 3, Spur 5) und führt zu einer Fluoreszenzprotein-Expression in Zebrafisch-Embryos (n = 1 Versuch) (Daten nicht gezeigt), aber seine Aktivität kann leider nicht in B. getestet werden, lanceolatum Embryonen. Schließlich, da der Oregon Green Dextran wandert auf dem gleichen Niveau wie die mRNA, mRNA Trapping nicht durch Agarosegel (Abbildung 3, Spur 3) bewertet werden. Diese letztere Farbstoff verhindert fluoreszierenden Proteinexpression in amphioxus (n = 1 Versuch), aber nicht Zebrafischembryos (n = 1 Versuch) (Daten nicht gezeigt). Zusammengefasst legen diese Daten nahe, dass einige Dextrane effizient Übersetzung des injizierten mRNA hemmen. Da die Dosis-Antwort-Experimente nicht durchgeführt wurden, sind diese Daten qualitative. Interessanterweise scheint diese hemmende Wirkung abhängig zu seindie Tierarten (Zebrafisch gegen Amphioxus), die den Bedarf an weiteren Studien, die Mechanismen dieser Wirkung zugrunde liegen hervorhebt. Darüber hinaus rufen diese Ergebnisse für die vorbereitenden Analysen wenn Dextrane sind als Farbtracer für Injektionszwecke verwendet werden.

Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik für ein gegebenes Modell öffnet die Tür für genspezifischen Manipulationen. In amphioxus beispielsweise die erste Beschreibung von Mikroinjektionen (in B. floridae) wurde durch die erfolgreiche Zuschlags eines Gens, hox1 gefolgt, unter Verwendung von Morpholino-Oligonukleotid Injektionen ^23,24. Die Anzahl von B. lanceolatum Embryonen, die jeden Tag erfolgreich injiziert können mit dem hier vorgestellten Protokoll werden sicherlich kompatibel mit dieser Art von Studie. Darüber hinaus dieser Methoden und den neuen Konstrukten zur Hand, kann man jetzt auch entwerfen und durchzuführen Überexpression und Zuschlags Studien durch Injektion von mRNAs von Interesse (nativ oder dominant-negtive Formen) oder andere Strategien für die Störung der Genexpression (zB microRNA- oder shRNA basierte Strategien). Bisher kann amphioxus Injektionen nur an der Eizelle Stufe durchgeführt werden, weil dies die einzige Stufe, die effizient immobilisiert werden kann. Nach Injektion in die Eizelle Stufe wird das Molekül von Interesse ubiquitär im Embryo exprimiert. Wenn somit die Genexpression geändert werden muss, oder nur in einer Untergruppe von Zellen beobachtet werden, müssen DNA-Konstrukte, die injiziert werden, diese sind mosaikartig in den Entwicklungs amphioxus Embryo ^15,25-27 ausgedrückt. DNA-Konstrukt Injektionen können auch verwendet werden, um die Aktivität der Regulationsregionen während amphioxus Entwicklung in transienten transgenen Assays testen, mit der zuvor erwähnten Nachteil mosaic Expression ^15,25-27.

Letztlich wird das Amphioxus Mikroinjektionstechnik auch die Tür für eine stabile Transgenese, einschließlich der gezielten Knock-out oder Knock-in spezifischer genetischer Loci. Systems für eine stabile Insertion von exogenen DNA vorhanden ist, beispielsweise mit dem Fisch Transposon-beruhenden Tol2 System, das in beiden Insekten und Vertebraten Amniotewirbeltiere ²⁸ funktionieren scheint. Darüber hinaus Ansätze für modifizierte Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) oder Transkriptionsaktivator artigen Effektormolekülen Nukleasen (Talens) oder RNA-Genom geführte Bearbeitungswerkzeuge auf Basis (CRISPR / Cas-System) verwendet werden, um Punktmutationen zu generieren und Schlag-Änderungen in bestimmten Genomregionen ^29. Diese Bemühungen werden das ganze Jahr über die Zucht von Amphioxus in Gefangenschaft, die bereits für B eingestellt ist erforderlich belcheri ^11,30 und B. japonicum ^30,31 und wird derzeit für A. entwickelt lucayanum, B. floridae und die Amphioxus Arten hier vorgestellten, B. lanceolatum ^32.

The authors have nothing to disclose.

Die Autoren danken, die Unterstützung durch die "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" für die Tierhaltung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 und ANR-11-JSV2-002-01) zu Michael Schubert, die von der Europäischen Union RP6 grant "Embryomics" und von der ANR grant "ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-Process ", um Jean-François Nicolas und Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wird von einem FCT Stipendium finanziert (SFRH / BD / 86878/2012).

Anträge für die hier beschriebenen Vektoren können direkt an die Autoren angesprochen werden.