ביטוי של חלבונים ניאון ב

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

במהלך פיתוח, תא בודד מוליד כל אורגניזם בתהליך מורכב ביותר שיש בו שני חלוקות תא ותנועות. כדי להבין טוב יותר את העקרונות הביולוגיים העומדים בבסיס הדינמיקה של התנהגות תא, ביולוגים התפתחותיים החלו להשתמש בטכניקות ההדמיה vivo הקרינה מבוססת. תאים מסוימים של תאים, כגון קרום תא, יכולים גם להיות שכותרתו על ידי טיפולים עם צבעי ניאון, גישה הקשתה על ידי חוסר הייחוד ושל חדירת רקמת ^1, או על ידי ההקדמה הספציפית לעובר של mRNAs אקסוגניים קידוד חלבוני ניאון ^2. טכניקות שונות יכולות לשמש לאספקה ​​היעילה של תרכובות חיצוניות, כגון mRNAs. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל, microinjection, electroporation, הפצצה עם microparticles, lipofection ותמרת ^3,4. למרות שכל הגישות הללו יכולים לשמש כדי להציג את התרכובות אקסוגניים לפיתוח עובר, רק microinjection מאפשר היישום של כמויות מוגדרות מראש ומדויקות לכל תא ^3. טכניקות Microinjection תוארו עבור כל מערכות המודל ההתפתחותי הגדולות ⁴ (לדוגמא, זבובי פירות, נמטודות, דג הזברה, צפרדעים, עכברים), כמו גם לכמה מודלים חלופיים ^4, כוללים אלה המשמשים למחקרים השוואתיים שמטרתו להבין את האבולוציה של מנגנוני התפתחות (למשל, שושנות ים, תולעי תולעים טבעתיים, קיפודי ים, tunicates ascidian, amphioxus מיתרני הראש).

Cephalochordates, אשר יחד עם tunicates ובעלי חוליות להקים מַעֲרָכָה chordate, במיוחד דגמים מתאימים היטב לחקר האבולוציה של chordates והגיוון של בעלי חוליות מאב קדמון חסר חוליות ^5-8. שושלת מיתרני הראש התפצלה בשלב מוקדם מאוד במהלך האבולוציה chordate; וcephalochordates הקיים, אשר מחולקים לשלושה genera (Branchiostoma, Asymmetron וEpigonichthys), דומה לבעלי חוליות הן מבחינת האנטומיה כוללת ואדריכלות הגנום ^5-8. של המינים על 30 של cephalochordates שתוארו עד כה, חמש זמינים למחקרים עובריים והתפתחותיים ^6,9: lucayanum Asymmetron (אִזְמֵלוֹן בהאמה), מיתרני ראש הדגלונים (amphioxus פלורידה), lanceolatum מיתרני הראש (amphioxus האירופי), מיתרני הראש belcheri (amphioxus הסיני) ומיתרני הראש ג'אפוניכאם (amphioxus היפני). מבוגרים הבשלים של שלושה ממינים אלו (lanceolatum ב ', ב' ו- B. belcheri ג'אפוניכאם) יכולים להיגרם ללהשריץ על פי דרישה בעונת הרבייה ^10,11. בנוסף, לפחות עבור B. lanceolatum, השרצה יעילה יכולה גם להיגרם במי ים מלאכותיים ^12, ובכך הופכת את מיני מיתרני ראש מסוימים הזה נגיש לLaboratories שאין להם גישה למי ים טבעי. שילוב, בB. lanceolatum, של גישה נוחה ואמינה לעוברים עם שיטת אספקה ​​יעילה, כגון microinjection, עד כה טכניקת המשלוח בלבד שפותחה בamphioxus (בשני B. דגלונים וB. belcheri) ^13-15, תאפשר הפיתוח של חבילת רומן של טכניקות מניפולטיביות, כולל tracing- שושלת וגישות המבוססת על התנהגות תא דינמי.

פרוטוקול לmicroinjection יעיל של mRNAs לבטא חלבוני ניאון בB. עובר lanceolatum פותח ומכאן. יתר על כן, כדי לספק ערכת כלים בסיסיות להדמית חיה של B. עוברי lanceolatum, מערכות וקטור פותחו המאפשרות קרום הקשורים וביטוי גרעיני של חלבוני ניאון. למיקוד קרום, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) התמזג לתיבה האנושית HRAS CAAX ולוקליזציה גרעינית של mCherry וeGFP היהמתקבל על ידי היתוך לאקסון 2B היסטון דג הזברה (H2B) (איור 1, קובץ משלים 1). יתר על כן, במטרה לייעל את תרגום חלבון, הרצפים וקודונים קוזאק של המבנים שונו והותאמו לשימוש בB. lanceolatum. יחדיו, וקטורי שיטת ההזרקה וביטוי שהוצגו כאן ישמשו כבסיס לדור של גישות ניסיוניות החדשות לcephalochordates, בעיקר ניתוחים באמצעות מבוססת הקרינה האחרונה בטכניקות ההדמיה vivo.

1. הכנה של מכשירים וריאגנטים

1. העבר את טפטפות פסטר
   1. צור סדרה של טפטפות פסטר העברה בקטרים ​​קצה שונים על ידי משיכת pipettes פסטר הארוך 230 מ"מ מעל להבה במהירויות שונות. ודא שלהתחדד ארוך ככל האפשר לשליטה חלקה ויפה של שאיפה.
   2. עם סופר יהלומים, לשרוט את פיפטה לאורך קו ניצבת לאורכו של פיפטה. בשתי הידיים, למשוך מקביל פיפטה לאורכו כדי ליצור חתך בוטה. במהירות להבה-פולני פיפטה ללא הדבקת הקצה.
   3. משתנה הקוטר של הקצה עם השלב של ביציות / עובר להיות pipetted: 300-400 מיקרומטר לביציות מופרה (150 מיקרומטר בקוטר סביב), 600 מיקרומטר לביצים מופרות (כ -500 מיקרומטר קוטר), 200-400 מיקרומטר לneurulae בקע. טפטפות שימוש עם צינור שאיפה-פיקוח פה להעביר ביציות / עובר מצלחת אחתלמשנהו.
2. מחטי הזרקה
   1. מניפולציות נימים עם כפפות כדי להבטיח תנאי RNase ללא. השתמש בזכוכית בורוסיליקט עם נימי להט עם ממדים של 1.20 מ"מ OD, 0.94 מ"מ ID, אורך 10 מ"מ.
   2. אם נימים נמשכות לסוג של חולץ מחט חימום חוט להט שתואר ברשימת חומרים, להשתמש בהגדרות הבאות: חום 600, משוך 50, 80 Velocity, זמן 60, לחץ 200 או 300. אחרת, להבטיח כי את הצורה, שהוא חיוני לזריקות מוצלחות, הוא, כפי שמוצג באיור 2 עם התכונות הבאות: קוטר קצה חיצוני 4-8 מיקרומטר, באורך 2 סנטימטר להתחדד.
      הערה: ניתן למשוך מחטים לפני עונת הרבייה ומשמשות לאורך כל העונה.
3. 5% מניות פתרון פנול אדומים (4x)
   1. הכן טרי לפני כל עונת השרצה.
   2. בתוך צינור מיקרומטר סינון 0.22, שוקל את 25 מ"ג של אבקה אדומה פנול.
   3. הוסף 0.5 מיליליטר של המים DNase- וRNase ללא להצינור המכיל את האבקה.
   4. ספין במשך 3-5 דקות ב18,000 XG בטמפרטורת חדר כדי לסנן-לעקר את הפתרון ולהסיר גבישים שיכולים להדביק את מחט הזריקה.
   5. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או לאחסן 250 aliquots μl ב -20 ° C.
4. 0.25 מ"ג פתרון poly ליזין / ml
   1. הכן טרי לפני כל עונת השרצה.
   2. ממיסים 5 מ"ג poly-L ליזין ב 20 מיליליטר מים מזוקקים. חנות 5 aliquots מיליליטר ב -20 ° C.
   3. השתמש aliquot הפשרה מייד ורק פעם אחת כדי להבטיח הדבקה לשחזור וחזקה של הביציות לצלחת פולי-ליזין מצופה.
5. סינתזת mRNA
   1. הכן טרי לפני כל עונת השרצה.
   2. Linearize 5 מיקרוגרם של ה- DNA של עניין עם האנזים המתאים (בדרך כלל לשעה 2, על 37 מעלות צלזיוס). כדי לבדוק את השלמות של מערכת העיכול, המנוהל על 2% בנפח של תערובת העיכול על 1% ג'ל agarose-TBE במאגר TBE ב 150 W במשך 20 דקות.
   3. חלץ את lineaDNA rized עם 25: 24: פנול 1 (pH 8.0): כלורופורם: אלכוהול isoamyl. וורטקס במשך 20 שניות, צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את המימי שלב (העליון).
   4. לחלץ את השלב המימי שוב עם 24: כלורופורם 1: isoamyl אלכוהול. וורטקס במשך 20 שניות, צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את השלב המימי.
   5. להאיץ את ה- DNA לינארית עם 100: 10: 300 DNA לינארית: 3 M נתרן אצטט (pH 5.2): 100% אתנול הלילה ב -20 ° C.
   6. 20 דקות צנטריפוגה ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף באתנול 70%.
   7. צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בואו ביבש וגלולה במים RNase ללא ריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / μl.
   8. לתמלל 1 מיקרוגרם של ה- DNA לינארית באמצעות ערכת סינתזת mRNA עם פולימראז המתאים, על פי הוראות יצרן.
   9. חלץ את ה- mRNA עם 5: 1 פנול (pH 4.7): להפסיק פתרון כלורופורם ואמוניום אצטט מצורף לערכה.
   10. וורטקס במשך 20 שניות, centrifuge 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את השלב המימי.
   11. לחלץ את השלב המימי שוב עם 24: כלורופורם 1: isoamyl אלכוהול. וורטקס במשך 20 שניות, צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את השלב המימי.
   12. לזרז את mRNA עם isopropanol 100% הלילה ב -20 ° C.
   13. 20 דקות צנטריפוגה ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף באתנול 80%.
   14. צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בואו היבש גלולה בטמפרטורת חדר למשך לא יותר מ 5-10 דקות כפי שלאחר מכן ניתן יהיה קשה resuspend. Resuspend בDNase- ומים RNase ללא לריכוז סופי של לפחות 2 מיקרוגרם / μl כדי להבטיח ריכוז mRNA סופי הגון בתמהיל ההזרקה.
   15. כדי לבדוק את האיכות וגודל של מוצר השעתוק, לרוץ 0.5 μl של mRNA על 1% ג'ל agarose-TBE RNase ללא במאגר TBE ב 150 W במשך 20 דקות. חנות 2 aliquots μl ב -80 ° C.
6. מנות פולי-ליזין מצופה
   הערה: תעודת מקוריות פולי-ליזיןמנות טד משמשות כדי לשתק את הביציות במהלך הזרקה.
   1. לכל מנה 35 מ"מ תא-תרבות פטרי (5 בסך הכל), לכסות את החלק התחתון של צלחת פטרי עם 1 מיליליטר של 0.25 מ"ג פתרון poly ליזין המופשר / מיליליטר. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
   2. לכל מנה 35 מ"מ תא-תרבות פטרי (5 בסך הכל), להעביר 0.25 מ"ג פתרון poly ליזין מיליליטר / לעוד צלחת פטרי תרבית תאי 35 מ"מ. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
   3. מחק את פתרון poly ליזין 0.25 מ"ג / מיליליטר.
   4. בואו צלחות פטרי הפוכות יבשות, בטמפרטורת חדר למשך שעה 2.
   5. אחסן את הכלים מצופים פולי-ליזין-עטופים בניילון נצמד על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע זיהום למקסימום שבוע אחד.
7. מנות מצופים agarose
   הערה: הם משמשים לעוברי תרבות מוזרקת. Agarose מספק כרית לעוברים המוזרקים ומונע מהם להידבק לתחתית הצלחת.
   1. הפוך מי ים מלאכותי (ASW) באמצעות 37-38 גר '/ comm Lמלחי ercial + 0.25 מ"מ NaHCO ₃ במי אוסמוזה הפוכים.
   2. לפזר agarose לריכוז של 1% ב0.22 ASW מיקרומטר מסונן-ידי חימום במיקרוגל הפתרון.
   3. במהירות לשפוך את פתרון agarose החם מצלחת פטרי אחד 35 מ"מ לעוד אחד כדי להבטיח ציפוי agarose דק מאוד של המנה.
   4. אחסן את הכלים מצופים agarose הוא עטופים בניילון על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע זיהום למקסימום שבוע אחד.
8. תמהיל הזרקה וטעינה של מחטי ההזרקה
   1. כ -2 שעות לפני שמתחיל זריקות, לעשות תערובת 2 μl הזרקה בRNase- וללא מים DNase עם ריכוזים סופיים של 1-1.8 מיקרוגרם / μl של mRNA, גליצרול 15%, 1.25% פנול אדומים.
      הערה: צבעי פנול האדום הפתרון, המאפשר ניטור של יעילות ההזרקה וזיהוי של עוברים הוחדרו בהצלחה. גליצרול מעדיף דיפוזיה mRNA בתוך הביצית.
   2. צנטריפוגה 4 דקות ב 18,000 XG לגבישי גלולה. שמור על קרח עד לשימוש.
   3. עם טפטפת 10 μl, לאסוף 0.5 μl של תמהיל ההזרקה, הימנעות החלק התחתון של הצינור, שבו הגבישים כבר pelleted.
   4. למילוי לפחות שתי מחטי הזרקה (במקרה אחד הפסקות במהלך ההזרקה) על ידי pipetting הירידה של 0.5 μl של תמהיל הזרקה בפתיחה הגדולה של המחט.
   5. התקן את המחטים בצנצנת אחסון עם נוזל בתחתית ב 4 ° C על מנת למנוע אידוי של תמהיל ההזרקה. בואו תמהיל ההזרקה לנסוע לאט לקצה מחט הזריקה לשעה לפחות 1 כדי למזער את היצירה של בועות.
   6. תמהיל הזרקה נוסף חנות ב -80 ° C למקסימום של שלושה שימושים נוספים, לאחר שאיכות mRNA מידרדר (מידע לא מוצג).

2. איסוף החומר ביולוגי, Microinjection ותרבות העובר

1. אוסף ביצית וזרע
   הערה: ראה Theodosiouאל et. ¹² לפרוטוקול מפורט לגרימת השרצה ולאוסף תאים-מין.
   1. זכרים ונקבות בהלם ASW ב 23 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   2. שעה עד שעות לפני השקיעה, להעביר את המבוגרים לכוסות בודדות בASW בגיל 19 ° C משום שרוב המבוגרים שרצים 1-2 שעות לאחר שקיעה.
   3. יש לשטוף 35 מ"מ צלחות פטרי בASW המסונן ולתת להם הפוך יבשה כדי למנוע את הביציות מלהידבק לתחתית הצלחת.
   4. על ההשרצה, לאסוף מייד זרע וביציות עם טפטפת 1,000 μl.
      1. שמור זרע וביציות נפרדות מamphioxus המבוגר בגלל המגע הוא מזיק לבריאות תא מין (מידע לא מוצג).
      2. יתר על כן, להימנע מהבהיל המבוגרים, מה שמוביל לתנועות שתתפוגגנה, ולכן לדלל, שניהם זרע וביציות. כדי לשמור על הזרע פעיל זמן רב ככל האפשר וכדי לייעל את שיעור הפריה, לאסוף את הזרע כמרוכז ככל האפשר.
   5. שמורזרע על קרח בצינור 1.5 מיליליטר.
   6. העבר את הביציות בASW המסונן לתוך 35 מ"מ צלחות פטרי-שטף מראש.
   7. העברת 100-500 ביציות עם פיפטה פסטר העברה בעבר משך 300-400 מיקרומטר לעוד 35 מ"מ צלחת פטרי לבצע את הזריקות.
   8. להפרות את שארית המצמד כביקורת על זרע וביצית באיכות או לניסויים אחרים.
2. הזרקת ביצית
   1. התקן את מחט הזריקה על micromanipulator בזווית 50 מעלות ביחס למישור האופקי.
      הערה: זוויות של פחות מ -50 מעלות ידחוף את הביציות סביב על הצלחת, ואילו זוויות של יותר מ -50 מעלות לא תאפשר ניטור מתאים של מיקום מחט ביחס לביצית.
   2. תחת בהיקף ניתוחים ניאון עם 25x oculars, להעביר 30 ביציות עם פיפטה פסטר העברת 300-400 מיקרומטר על צלחת פולי-ליזין מצופה המכילה ASW המסונן.
   3. להפקיד את הביציות לאורך קו לבצעזריקות בדרך מסודרת ולהבחין שהוחדרו מביציות מוזרקות אינן. הזרק מספרים קטנים (30 ביציות) כדי לצמצם את זמן החשיפה של ביציות לפולי-ליזין, אשר נוטה לעוות עוברים מתפתחים (מידע לא מוצג).
   4. השתמש בתאורת השדה הכהה כדי להבהיר את הביציות כשקופות ככל האפשר.
   5. עם ידית התנועה הגסה של micromanipulator, להביא את מחט הזריקה קרובה לביצית.
   6. עם מלקחיים עדינים, לחתוך לפתוח את המחט ברמה שבה הקצה מתחיל להיות עקום. על ידי פועם עם המזרק, לוודא שתערובת ההזרקה האדומה היא למעשה זורמת החוצה של המחט.
   7. בהגדלה 200X ועם ידית תנועת הקנס של micromanipulator, בעדינות להזיז את מחט הזריקה בתוך הליבה של הביצית.
      הערה: אם הוכנס גם באופן שטחי, הפתרון המוזרק לא יישאר בתוך הביצית. אם הוכנס רחוק מדי, הביצית תושמד.
   8. הזרק עם 1-3 פולסים של 120 durat msecיון ולחץ psi 1-10. אם המחט היא בסדר מספיק, להזריק עם זרימה רציפה בלחץ קבוע. ודא שעוצמת הזריקה מתאימה ל1/5 ל1/3 מהיקף ביצית אחת.
   9. לאחר הזרקה, למשוך את המחט החוצה במהירות כדי למנוע דליפה של הביצית.
   10. ודא שהפתרון המוזרק נשאר בתוך הביצית ושאחרי כמה שניות, הפתרון המוזרק מתפשט בכל הביצית.
   11. על מנת להעביר את הביצית הבאה בתור.
   12. לשמור על כמה עוברי uninjected של כל סדרה כביקורת שלילית להעריך את הקרינה הרקע בעת הסריקה לעוברים מוזרקים.
3. בחירת הפריה, של עוברים מוזרקים ותרבות עובר
   1. להפרות את הביציות בהקדם סדרה כבר הזריק. כאיכות ביצית יורדת עם זמן, להזריק ולהפרות ביציות בתוך שעה 1 אחרי ההשרצה ^12.
   2. תלוי בריכוז הזרע, להוסיף 1-5 טיפות של זרע לביציות ולערבל את הצלחת.
      הערה: מעטפת ההפריה צריכה להיות ברורה בעוברים לאחר דקות על 1.
   3. לאפשר לעוברים ללהתנתק המנה פולי-ליזין מצופה, תוך הזרקת סדרה נוספת של ביציות.
   4. מעביר את העוברים עם פיפטה פסטר מיקרומטר ההעברה 600 לצלחת פטרי מצופה agarose. הסר את העוברים מהצלחת פולי-ליזין מצופה בהקדם האפשרי, אם זה בכלל אפשרי לפני שלב 2-התא.
      הערה: במקרה של חשיפה ממושכת לפולי-ליזין, העוברים נוטים להיות blastulae צפוף וגדוש, שטוח בצד נוגע בתחתית הצלחת.
   5. בשלב 2 תאים ל4 תאים, בחר בהיקף ניתוחים ניאון עם מסנן DSR העוברים בהצלחה המוזרק, כלומר, אלה עם מורפולוגיה נורמלית כי תערוכת אות ניאון אדומה נגזרת פנול האדום.
   6. שמרו את העוברים בתרבות בASW המסונן בצלחות פטרי מצופה agarose ב 19 ° C עד השלב הרצוי לבהדמיה vivo.

הפרוטוקול המפורט לעיל מספק את הבסיס לmicroinjection של B. ביציות lanceolatum ומכאן למבוא לפיתוח ב ' עוברי lanceolatum של mRNA קידוד חלבוני ניאון להדמית in vivo. למרות שהטכניקה היא בהחלט חזקה ואמינה, שיעור הזריקות מוצלחות תוך שימוש בפרוטוקול זה נשאר משתנה (טבלה 1). ההסבר סביר מאוד לעובדה מסקרנת זה הוא ההשתנות הקיצונית של ציפורני ביצית: קבוצות ביצה שונות אכן מתנהגות בצורה שונה מאוד, כאשר נתון ללחץ ההזרקה. ביציות חלקם ולא אלסטי ונוטות לשטח בתחתית הצלחת, ואילו אחרים הם די נוקשה ויישארו עגול על זריקה. יתר על כן, חלק מקבוצות הביצית נוטות לנפח הקרומים סיסית שלהם על זריקה, בעוד שאחרים פשוט lyse (מידע לא מוצגים). לא נמצא קשר ברור ניתן להקים בין ביצית התנהגות על זריקה ועובריתפיתוח לאחר הפריה. לכן קשה לחזות לאיזו קטגוריה של ביציות הוא מתאים ביותר עבור microinjection. עם זאת לאחר הפריה, ניתן לזהות עוברים עוברים התפתחות נורמלית כבר בשלבי מחשוף: 2 תאים לעוברי שלב 4 תאים יכולים להיחשב נורמלים כאשר שטח המגע בין לסטומרים הוא קטן, ואילו עובר מחשוף שלב-דחוס, שבו תאים בודדים קשה להבחין, הוא בהחלט לא נורמלי.

בידיים שלנו, כמחצית מהביציות לא לשרוד את הטראומה שנגרמה על ידי ההזרקה וכמחצית מהעוברים ששורדים תערוכת הזרקת תווית ניאון ספציפית. לפיכך, אנו מעריכים כי עם פרוטוקול הזרקה זה, בין 50 ל 120 עוברים ניתן להזריק בהצלחה ביום השרצה ניתנה מניב בין 15 ו -60 עוברים שכותרת.

הקרינה האדומה של פנול האדום ב2-תא לעוברי שלב 4 תאים מאוד אמינה מסמנת עוברים שיש ליהוזרק כהלכה, כשל עוברים שנבחרו באופן זה 100% לאחר מכן לייצר חלבוני ניאון המקודדים על ידי mRNA המוזרק. בנוסף, קיים מתאם חיובי ברור מאוד בין עוצמת הקרינה פנול אדומה בשלב 2 תאים ל4 תאים וזמן תחילה של הקרינה המיוצרת על ידי החלבונים המקודדים על ידי mRNA המוזרק. קשר זה כך מאפשר זיהוי של אלו עוברים שקיבלו את הכמות הגבוהה ביותר של mRNA במהלך תהליך ההזרקה.

אם האות של חלבון פלואורסצנטי המקודד על ידי mRNA המוזרק לא זוהה לאחר הבחירה עובר אדומה-חיובי פנול, אנו ממליצים להפעיל את תערובת ההזרקה על ג'ל נטול RNAse כדי לבדוק השפלה mRNA או השמנה (איור 3) . במסלול 1, להקת mRNA שלמה מזוהה. הזרקה של תערובת זו הובילה לאות ניאון חזקה בעובר. להיפך, במסלול 2 אשר תואמת את experimen אחר, MRNA נראה t בי פנול האדום הוחלף בצבע Dextran בתמהיל (ראה דיון לפרטים נוספים) שנלכד על ידי צבע Dextran והזרקה של תערובת זו לא הובילה לאות ניאון בעובר.

שימוש בטכניקה זו microinjection והמבנים שלנו (לוחות 2 ו -3, קובץ משלים 1) (ראה דיון), ובכך אנו יכולים לייצר reproducibly תיוג ניאון הומוגנית לאורך כל העובר עם mCherry או eGFP בגרעין ועם eGFP בקרום (איור 4) . פרוטוקול ההדמיה משמש ליצירת איור 4 יתואר במקום אחר (פור et al., כיום בהכנה). בהתאם לכמות של mRNA מוזרק, ביטוי חלבון פלואורסצנטי בדרך כלל הופך לזיהוי בין 16 תאים (איור 4 א) ושלבי 64 תא ונשאר לגילוי לפחות עד השלב מאוחר neurula (מידע לא מוצג). מאוחר יותר שלבים לא נבדקו. אות גרעיניתמופיע בדרך כלל מוקדם יותר מאשר אות קרום, שעלול להיות בגלל אופי מיסוד המפוזר של הקרום בהשוואה לטבע הקומפקטי של הגרעין (מידע לא מוצג). למרות שזה לא היה במעקב שיטתי, עובר מוזרק עם גרעיני ותווית קרום שניהם מופיעים להיות פחות בריא מאשר עוברים מוזרקים באופן בלעדי עם תווית eGFP גרעינית. מעניין לציין, שנראה את האפקט הזה להיות עצמאי מהסכום הכולל של mRNA מוזרק כסכום הכולל של mRNA המוזרק הוא זהה, בין אם מיני mRNA אחד או שניים כלולים לתערובת (מידע לא מוצג).

איור 1: לבנות פרטים. סקיצות של (A) ממוקד-קרום eGFP (eGFP: תיבת CAAX), ממוקד-הגרעיני eGFP (H2B: eGFP) (ב) וממוקד הגרעיני mCherry (C) (H2B: mCherry) בונה arדואר מוצג.

איור 2: צורה של מחט זריקת נציג. () להתחדד הוא כ 2 סנטימטר אורך ועקומות מחט בקצה. בר סולם = 2 מ"מ. הגדלה (ב) לאזור התאגרף בא העמדה לגזיר המחט (החץ) היא בעקומה של מחט. קצה המחט הוא הצביע על ידי ראש החץ. סרגל = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. תוצאת אינטראקציות של mRNA וצבעים ניאון שנבחרו (א) להגירה של תערובת המכילה mRNA ופנול אדום במסלול 1 ושל mRNA וdextran טקסס האדום (בריכוז סופי של 3.3 מ"ג / מיליליטר) ב2. (ב) תוצאת נתיב של ההגירה של תערובת המכילה dextran mRNA ואורגון הירוק (בריכוז סופי של 3.3 מ"ג / מיליליטר) בנתיב 3, של mRNA וdextran FITC (בריכוז סופי של 3.3 מ"ג / מיליליטר) במסלול 4 ושל dextran mRNA וRhodamine (בריכוז סופי של 3.3 מ"ג / מיליליטר) בנתיב זמן הגירה 5. ג'ל בA ו- B היה שונה. למען הבהירות, המלבן השחור במסכות השתקפות אור וקווים מקווקווים להתוות נתיבי ההגירה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: טיוח 3D (תוכנת עמירה) של עוברי amphioxus מוזרקת עם mRNAs קידוד לחלבוני ניאון תמונות.חולץ מעת-מעידות 3D נרכשו על מיקרוסקופ לייזר סריקה מותאם SP5 Leica 2-פוטון עובר שלב () 16 תאים המבטא H2B הגרעיני:.. eGFP עובר שלב (ב) gastrula להביע H2B הגרעיני: mCherry וממוקד קרום- eGFP:. תיבת CAAX (C) gastrula עובר שלב להביע H2B הגרעיני: mCherry וeGFP-ממוקד קרום: תיבת CAAX. הסעיף האופטי תערוכות תאים פנימיים עם mCherry הגרעיני ואותות eGFP קרום הקשורים. בר סולם = 50 מיקרומטר.

טבלה 1:. שיעורי הצלחת הזרקת המבנים המוזרקים, מספר העוברים המוזרקים ששרדו את הזריקה ואת מספר העוברים שכותרתו (או בהצלחה המוזרקת) מצוינות, וכך גם האחוז הכולל של זריקות מוצלחות.

טבלה 2:. אופטימיזציה לא סופית של רצפי קוזאק מקורית ורצפי קוזאק מוטציה מצוינים עבור כל מבנה. המוטציות הציגו לשחזר את רצף קוזאק של B. גן אקטין lanceolatum, שדומה מאוד מאוד לזו של הרצף מוסק התיאורטי העדיף קוזאק של amphioxus (/ CGA / CG / TTC / ATG GAC TG / CT).

לוח 3: אופטימיזציה לא סופית של שימוש קודון. קודונים מקוריים ומוטציה מצוינים עבור כל מבנה. אמנם זה לא נבדק בניסוי, הציג mutatiתוספות נועדו לייעל את תרגום mRNA בamphioxus.

קובץ משלים 1: לבנות רצפי רצפי נוקליאוטידים של ממוקד הקרום eGFP (). (EGFP: תיבת CAAX), ממוקד-הגרעיני eGFP (H2B: eGFP) (ב) ו- (ג) mCherry-ממוקד הגרעיני (H2B מקבלים מבני mCherry) בהקשר של עמוד השדרה pCS2 + וקטור:. תחומים העיקריים המקודדים על ידי כל אחד מהמבנים מצוינים בצבע: eGFP (ציאן הכחול), mCherry (אדום) (ירוק), אות לוקליזציה קרום מHRAS (תיבת CAAX) אדם, אקסון 2B היסטון דג הזברה (H2B) (צהובה).

במאמר זה, אנו מציגים, בפעם הראשונה, פרוטוקול מפורט ושחזור להזרקה של B. ביציות lanceolatum, אשר, לאחר B. הדגלונים ^13,14 ו- B. ¹⁵ belcheri, לכן מיני amphioxus שלישיים, שלטכניקה כזו שתוארה. חשוב לציין, הפרוטוקול מתואר כאן כולל גם את התיאור של מערכות וקטור המתאים לייצור חלבוני ניאון בB. lanceolatum מmRNA המוזרק מיוצר במבחנה (שיפורט להלן). יחד, כלים החדשים אלה מאפשרים הדמיה vivo של ההתפתחות המוקדמת של amphioxus והניתוח של התנהגויות דינמיות תא העומדות בבסיס אירועי המוךפו"גנטי המוקדמים בעובר, כגון מחשוף וgastrulation.

באופן כללי, טכניקת microinjection יש את היתרון של מתן אפשרות למשלוח, לתא מטרה, בהיקף מוגדר מראש של מתחם ספציפי. עם של להיות זהסיוע, מגבלה העיקרית אחד של שיטה זו היא במספר המצומצם של תאים שיכולים להיות מוזרק במהלך ניסוי נתון. לדוגמא, הפרוטוקול מתואר כאן לB. lanceolatum מאפשר ההזרקה של 100 עד 120 ביצים בכל הפעלת הזרקה, אשר כמחצית תהיה כותרת (לוח 3). לB. דגלונים, המספרים דומים מאוד עם 500 או יותר ביצים שניתן להזריק ליום, מתוכם יותר מ -50% ישרדו הזריקה ^13,14. בעוד הפרוטוקולים להזרקת B. lanceolatum ו- B. ביצי דגלונים דומות מאוד אחד לשני, ב ' טכניקת belcheri היא מעט שונה: הביצים מונחות על ליזין המצופה פולי coverslips וזריקות מבוצעות תחת מיקרוסקופ הפוכה באמצעות microinjector של מותג שונה. גישה זו, ככל הנראה, מאפשרת ההזרקה של בין 200 ל -300 B. ביצי belcheri בכל הפעלת הזרקה עם שיעור הישרדות, לאחר הבקיעה בשלב neurula, of 89.39% 95.83% ¹⁵ ל. בהתחשב בהבדלים בפרוטוקולים, שקשה לדעת אם ההבדלים בשיעורי הצלחה הם תוצאה של הבדלים הקשורים למין או הקשורות לפרוטוקול. אחד יצטרך לבדוק את המינים השונים במקביל לפרוטוקולים השונים כדי לענות על שאלה זו. עם זאת, כדי להגדיל את מספר הביציות הממוקדות עבור המשלוח של תרכובות אקסוגניים נוסף, פרוטוקולים אחרים יצטרכו להיות מפותחים לamphioxus. טכניקות מועמד כוללות electroporation, הפצצה עם microparticles, lipofection, ותמרת ^4. ראוי לציין, electroporation כבר הוקם כטכניקה סטנדרטית לכניסתה של חומר אקסוגני לביציות מופרות מיתרני זנב ascidian, מודל אחר chordate חסר חוליות המשמש ללימוד האבולוציה של מנגנוני התפתחות ^8.

לmicroinjection המוצלח וההדמיה הבאה in vivo של חלבוני ניאון, מתאיםוקטורי ביטוי הם תנאי מוקדם הכרחי. לצורך זה, שלושה פלסמידים פותחו וניסוי תקף (קובץ איור 1, משלים 1): למיקוד קרום, גן eGFP היה מחובר בקצו 3 'לתיבת HRAS CAAX האנושית (וכתוצאה מכך eGFP: מבנה תיבת CAAX ) ¹⁶ ו, למיקוד גרעיני, שני eGFP וגני mCherry היו התמזגו בשעה 5 'מסתיים לאקסון 2B היסטון דג הזברה (H2B) (וכתוצאה מכך, בהתאמה, בH2B: eGFP וH2B: מבנה mCherry) ^17. כל אחד מהמבנים הללו כבר משובט לתוך פלסמיד pCS2 + מכיל אתר polyadenylation מאוחר SV40 ואמרגן SP6 מאפשר בסינתזת mRNA חוץ גופית כתרים ^18,19. יתר על כן, במטרה לייעל את התרגום של המבנים בB. lanceolatum, שני רצפי קוזאק וקודונים הותאמו באמצעות mutagenesis נוקלאוטיד הבודד (לוחות 2 ו -3, קובץ משלים 1). Basאד על הגישה ב ^-20 Nakagawa, בריכה קטנה של B. גני lanceolatum נותחו לזהות רצף קוזאק העדיף במין זה. הרצף הקרוב ביותר הידוע טבעית המתחוללים לרצף העדיף תיאורטי זה הוא של B. lanceolatum גן אקטין. רצפי קוזאק של שלושה המבנים שונו ולכן כדי להתאים רצף גן אקטין זה. יתר על כן, שימוש קודון של B. lanceolatum נותח באמצעות מסד נתוני שימוש קודון ²¹ וקודונים במבנים בהסתברות נמוך שימוש בB. lanceolatum (<10%) הוחלפו, בכל מקום אפשרי, על ידי קודונים שווי ערך בהסתברות גבוהה יותר לשימוש.

התוצאות של הזריקות מראות כי רמת ביטוי חלבון מהווקטורים האלה היא מתאימה לin vivo הדמיה ניתוחים. בהתחשב בכך שפלט הביטוי של הווקטורים שונה לא בהשוואה לזה של מבנים ללא שינוי, אנחנו לא יכולים להונותclude על היעילות של השינויים שהוכנסו בקונסנסוס קוזאק ורצפי הקידוד. בהחלט יהיה מעניין לבדוק אם שינויים אלה יש השפעה על רמות ביטוי חלבון אכן. לאורך שורות אלה, ניתוח האחרון המבוסס על microinjections לB. belcheri עולה כי וקטורים אחרים, ללא שינוי יכולים לשמש גם לסינתזה של mRNA לייצור חלבון פלואורסצנטי בamphioxus ^15.

Amphioxus מכיל חלבוני ניאון ירוקים אנדוגני ^22. העוברים לכן להפגין רמות נמוכות של ירוק, כמו גם הקרינה אדומה (תצפיות לא פורסמו שלנו). עם זאת, רמות אנדוגני אלה הן זניחות ביחס לרמות הקרינה הנובעות מההזרקה של מבני mRNA שלנו. לכן, הקרינה אנדוגני של עוברי amphioxus לא מפריעה תצפיות ניסיוניות באמצעות משקפת ניאון או מיקרוסקופי סריקה רב-לייזר. בנוסף, ניסויי ההזרקה עולים כי עוצמת הקרינה אקסוגני שנוצרה על ידי הזרקת mRNA תלויה בכמות הממשית של חומר מוזרק, המתואם באופן ישיר עם הריכוז הסופי של mRNA משמש בתמהיל ההזרקה. B. עוברי lanceolatum נוטים לסבול ריכוז של עד 1.8 מיקרוגרם / μl mRNA, אם כי, בלתי תלוי בריכוז mRNA בפועל, כמה שילובי mRNA נראים פחות נסבלת על ידי B. lanceolatum עוברים יותר מאחרים. לפיכך, השילוב של mCherry וקרום גרעין mRNAs eGFP נראה יותר רעיל מאשר ההזרקה של eGFP הגרעיני לבד.

dextran טקסס האדום כבר בעבר שימש כנותב לזריקות מוצלחות לביציות amphioxus ^13-15. מעניין לציין, שאות ניאון נגזרת מmRNA המוזרק מעולם לא מתקבלת לאחר הזרקה של פתרונות המכילים dextran טקסס האדום וזה בשתי ביציות amphioxus (n = 4 ניסויים) וzebrafiעוברי sh (n = 3 ניסויים). כאשר תערובת הזרקה המכילה במבחנה עיבד dextran mRNA וטקסס האדום נטענת על ג'ל RNase ללא agarose (איור 3, מסלול 2), הלהקה המתאימה לmRNA נעדר. בניגוד לכך, במבחנה עיבד mRNA ניתן לזהות על ג'ל agarose RNase ללא בנוכחות פנול האדום (איור 3, מסלול 1). בהתחשב בכך שאין כל ראיה לשפלת mRNA על הג'ל, תוצאות אלו מצביעות על כך שdextran טקסס האדום נוטה mRNA מלכודת. כאשר נעשה שימוש בפתרון הזרקה, dextran טקסס האדום עשוי כך למנוע התרגום של mRNA המוזרק. בעקבות תצפית זו, האינטראקציות של צבעים אחרים (dextran FITC, dextran Rhodamine ואורגון הירוק dextran) עם mRNA נבדקו שתי, על RNase ללא ג'לי agarose ועל ידי הזרקה לתוך B. lanceolatum או דג הזברה (איור 3). הניתוחים מצביעים על כך שdextran FITC לא mRNA מלכודת על ג'ל (איור 3, lanדואר 4) ומוביל לביטוי חלבון פלואורסצנטי בדג זברה (n = ניסוי 1), אך לא בעוברים של B. lanceolatum (n = ניסוי 1) (מידע לא מוצג). dextran Rhodamine לא mRNA מלכודת על ג'ל (איור 3, מסלול 5) ומוביל לביטוי חלבון פלואורסצנטי בעוברי דג הזברה (n = ניסוי 1) (מידע לא מוצג), אך פעילותה יכולה לצערי לא להיבדק בB. עוברי lanceolatum. לבסוף, כdextran אורגון הירוק נודד באותה הרמה כמו mRNA, mRNA השמנה לא יכול להיות מוערך על ידי agarose ג'ל (איור 3, מסלול 3). צבע זו אחרון מנע ביטוי חלבון פלואורסצנטי בamphioxus (n = ניסוי 1), אבל עוברים לא דג הזברה (n = ניסוי 1) (מידע לא מוצגים). לסיכום, נתונים אלה מצביעים על כך שחלק dextrans יעילות יכול לעכב את התרגום של mRNA המוזרק. בהתחשב בכך שניסויי מנה-תגובה לא בוצעו, נתונים אלה הם איכותיים. מעניין לציין, שנראית השפעה מעכבת זה להיות תלוי בהמינים של בעלי החיים (דג הזברה לעומת amphioxus), אשר מדגיש את הצורך במחקרים נוספים כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס תופעה זו. יתר על כן, תוצאות אלו קוראים לניתוחי הכנה, אם dextrans הם לשמש כקליעים נותבים צבע לזריקות.

הפיתוח של טכניקת microinjection למודל נתון פותח את הדלת למניפולציות גן ספציפי. בamphioxus, למשל, התיאור הראשון של microinjections (ב 'דגלונים) בעקבות מציאה המוצלחת של גן, hox1, באמצעות זריקות oligonucleotide morpholino ^23,24. מספר B. עוברי lanceolatum שהצלחה יהיה ניתן להזריק בכל יום באמצעות הפרוטוקול שהוצג כאן הוא בהחלט בקנה אחד עם סוג זה של מחקר. יתר על כן, עם שיטות אלה ובונת הרומן ביד, אפשר עכשיו גם לתכנן ולבצע מחקרי ביטוי יתר ומציאה על ידי הזרקה של mRNAs של עניין (יליד או דומיננטי-negצורות יצירתי) או להשתמש באסטרטגיות אחרות לשיבוש ביטוי גנים (למשל microRNA- או אסטרטגיות המבוססות על shRNA). עד כה, ניתן לבצע זריקות amphioxus רק בשלב הביצית, פשוט כי זה השלב היחיד שיכול ביעילות להיות משותק. לאחר הזרקה בשלב הביצית, המולקולה של העניין באה לידי ביטוי בכל מקום בעובר. לכן, אם ביטוי גנים צריך להיות שונה או במעקב רק בתת-קבוצה של תאים, בונה DNA צריכה להיות מוזרקת, כמו אלה באים לידי ביטוי mosaically בעובר amphioxus פיתוח ^15,25-27. גם זריקות מבנה ה- DNA יכולות לשמש כדי לבחון את הפעילות של אזורי רגולציה בפיתוח amphioxus במבחנים מהונדסים חולפים, עם החסרון הנ"ל ביטוי פסיפס ^15,25-27.

סופו של דבר, את טכניקת microinjection amphioxus גם פותחת את הדלת עבור transgenesis היציב, כולל נוק-אאוט הממוקד או לדפוק בלוקוסים גנטיים ספציפיים. מערכתים להכנסה יציבה של DNA אקסוגני כבר קיים, למשל עם מערכת Tol2 מבוסס transposon דגים שנראה לתפקד בשני חרקים ובעלי שפיר עוברי חוליות ^28. יתר על כן, גישות המבוסס על nucleases שונה אבץ-אצבע (ZFNs) או nucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) או כלי עריכת הגנום מודרך RNA (CRISPR / מערכת CAS) יכול לשמש כדי ליצור מוטציות נקודה ולדפוק בשינויים בספציפיים אזורים בגנום ^29. המאמצים האלה ידרשו הרבייה השנה של amphioxus בשבי, שכבר הקימו לB. belcheri ^11,30 ו- B. ג'אפוניכאם ^30,31 והיא כיום מפותחת עבור א ' lucayanum, ב ' דגלונים ומיני amphioxus השתתפות כאן, ב ' lanceolatum ^32.

The authors have nothing to disclose.

המחברים רוצים להכיר את התמיכה על ידי "Animalerie Centrale de Gif-sur-איווט" לגידול בעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מANR (ANR-09-BLAN-0262-02 וANR-11-JSV2-002-01) למייקל שוברט, על ידי המענק של האיחוד האירופי FP6 "Embryomics" ועל ידי מענק ANR "ANR- 10-BLAN-121,801 Dev-תהליך "לז'אן-פרנסואה ניקולא ונדין Peyriéras. João עמנואל Carvalho ממומן על ידי מענק דוקטורט FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

בקשות לווקטורים שתוארו כאן ניתן לפנות ישירות למחברים.