Expresión de proteínas fluorescentes en

Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos.

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Durante el desarrollo, una sola célula da lugar a un organismo entero en un proceso altamente complejo que implica tanto las divisiones celulares y movimientos. Para entender mejor los principios biológicos que subyacen a la dinámica del comportamiento celular, los biólogos del desarrollo han comenzado a utilizar en las técnicas de imagen in vivo basado en la fluorescencia. Compartimentos específicos de células, tales como las membranas celulares, o bien pueden ser etiquetados por los tratamientos con colorantes fluorescentes, un enfoque obstaculizado por la falta de especificidad y de penetración en el tejido ^1, o por la introducción específica en el embrión de mRNAs exógenos que codifican proteínas fluorescentes ^2. Diferentes técnicas pueden ser utilizadas para la prestación eficiente de compuestos exógenos, tales como mRNAs. Estos incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, bombardeo con micropartículas, lipofección y la transducción de ^3,4. Aunque todos estos enfoques se puede utilizar para introducir compuestos exógeno en unaembrión en desarrollo, sólo microinyección permite la aplicación de cantidades predefinidas y precisas en cada celda ^3. Las técnicas de microinyección se han descrito para los principales sistemas modelo de desarrollo ⁴ (por ejemplo, moscas de la fruta, gusanos nematodos, pez cebra, ranas, ratones), así como para algunos modelos alternativos ^4, incluyendo los utilizados para los estudios comparativos destinados a comprender la evolución de los mecanismos de desarrollo (por ejemplo, las anémonas de mar, gusanos anélidos, erizos de mar, tunicados ascidia, la amphioxus cephalochordate).

Cephalochordates, que junto con los tunicados y los vertebrados establecen filo cordados, particularmente modelos muy adecuado para estudiar la evolución de los cordados y la diversificación de los vertebrados de un antepasado de invertebrados ^5-8. El linaje cephalochordate divergieron muy temprano durante la evolución cordado; y cephalochordates existentes, que se subdividen en tres géneros (Branchiostoma, Asymmetron y Epigonichthys), se asemejan a los vertebrados, tanto en términos de anatomía general y la arquitectura del genoma ^5-8. De los aproximadamente 30 especies de cephalochordates que se han descrito hasta el momento, cinco son disponibles para los estudios y de desarrollo embriológico ^6,9: Asymmetron lucayanum (la lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (la amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (la amphioxus Europea), Branchiostoma belcheri (el anfioxo chino) y Branchiostoma japonicum (el anfioxo japonés). Adultos maduros de tres de estas especies (B. lanceolatum, B. belcheri y B. japonicum) pueden ser inducidas a desovar en la demanda durante la temporada de cría ^10,11. Además, al menos por B. lanceolatum, el desove eficiente también puede ser inducida en agua de mar artificial ^12, con lo que esta especie cephalochordate particulares accesible para laborators que no tienen acceso a agua de mar natural. La combinación, en B. lanceolatum, de un acceso conveniente y confiable para los embriones con un método de entrega eficiente, tales como la microinyección, hasta ahora la única técnica de administración desarrollada en anfioxo (tanto en B. floridae y B. belcheri) ^13-15, permitirá el desarrollo de un novela conjunto de técnicas de manipulación, incluyendo tracing- linaje y los enfoques basados ​​en el comportamiento de células dinámico.

Un protocolo para la microinyección eficiente de mRNAs para expresar proteínas fluorescentes en la B. lanceolatum embrión se desarrolla, por lo tanto. Además, para proporcionar un conjunto de herramientas básica para imágenes en vivo de B. embriones lanceolatum, sistemas de vectores se desarrollaron que permiten asociada a la membrana y la expresión nuclear de proteínas fluorescentes. Para la orientación de la membrana, el aumento de la proteína verde fluorescente (EGFP) se fusionó a la caja CAAX HRAS humano y la localización nuclear de mCherry y EGFP seobtenido por fusión a la exón 2B histona pez cebra (H2B) (Figura 1, Archivo 1). Además, con el objetivo de optimizar la traducción de proteínas, las secuencias Kozak y los codones de las construcciones se han modificado y adaptado para el uso en B. lanceolatum. Tomados en conjunto, los vectores de método y de expresión inyección presentados aquí servirán como base para la generación de nuevos enfoques experimentales para cephalochordates, los análisis en particular utilizando la última fluorescencia basada en técnicas de imagen in vivo.

1. Elaboración de Instrumentos y Reactivos

1. Traslado pipetas Pasteur
   1. Generar una serie de pipetas Pasteur de transferencia con diferentes diámetros de punta tirando de 230 mm de largo pipetas Pasteur por encima de una llama a diferentes velocidades. Asegúrese de que la conicidad es tan larga como sea posible para un control suave y fino de la aspiración.
   2. Con una punta trazadora de diamante, rayar la pipeta a lo largo de una línea perpendicular a la longitud de la pipeta. Con las dos manos, tire de la pipeta en paralelo a su longitud para generar un corte romo. Rápidamente llama a pulir la pipeta sin sellar la punta.
   3. Variar el diámetro de la punta con la etapa de los ovocitos / embriones que se debe verter: 300-400 micras de ovocitos no fecundados (alrededor de 150 micras de diámetro), a 600 m para los huevos fertilizados (alrededor de 500 micras de diámetro), 200-400 micras para neurulae rayada. Utilizar pipetas con un tubo de aspiración boca supervisado para transferir los ovocitos / embriones de un platoa otro.
2. Agujas de inyección
   1. Manipular los capilares con guantes para garantizar condiciones RNasa libre. Utilice vidrio borosilicato con capilares de filamentos con dimensiones de 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, longitud 10 mm.
   2. Si capilares se tiran en el tipo de calentamiento de filamentos aguja extractor descrito en la Lista de materiales, utilice los siguientes ajustes: Heat 600, Pull 50, Velocidad 80, Hora 60, presión 200 o 300. De lo contrario, asegúrese de que la forma, que es crucial para inyecciones exitosas, es como se muestra en la Figura 2 con las siguientes propiedades: 4-8 m de diámetro exterior de la punta, 2 cm de longitud de forma cónica.
      NOTA: Las agujas se puede tirar antes de la temporada de desove y se utiliza durante toda la temporada.
3. Solución de rojo fenol almacén 5% (4x)
   1. Preparar fresca antes de cada temporada de desove.
   2. En un tubo de micras de filtración de 0,22, pesar 25 mg de polvo rojo fenol.
   3. Añadir 0,5 ml de DNasa y RNasa libre de agua parael tubo que contiene el polvo.
   4. Girando durante 3-5 min a 18.000 xg a temperatura ambiente para filtrar esterilizar la solución y eliminar cristales que puedan obstruir la aguja de inyección.
   5. Almacenar a 4 ° C o almacenar 250 ml de alícuotas a -20 ° C.
4. 0,25 mg solución de poli lisina / ml
   1. Preparar fresca antes de cada temporada de desove.
   2. Disolver 5 mg de poli-L-lisina en 20 ml de agua destilada. Tienda alícuotas de 5 ml a -20 ° C.
   3. Utilice una alícuota descongelada inmediatamente y sólo una vez para asegurar la adhesión reproducible y robusto de los ovocitos a el plato de poli-lisina.
5. la síntesis de ARNm
   1. Preparar fresca antes de cada temporada de desove.
   2. Linealizar 5 g de ADN de interés con la enzima adecuada (por lo general de 2 horas, a 37 ° C). Para verificar la integridad de la digestión, ejecute un 2% en volumen de la mezcla de digestión en un gel de agarosa-TBE 1% en tampón TBE a 150 W durante 20 minutos.
   3. Se extrae la lineaADN AUTORIZADO con 25: 24: 1 de fenol (pH 8,0): cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, se centrifuga 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa (superior).
   4. Se extrae la fase acuosa de nuevo con 24: 1 de cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa.
   5. Precipitar el ADN linealizado con 100: 10: 300 DNA linealizado: acetato de sodio 3 M (pH 5,2): 100% de etanol durante la noche a -20 ° C.
   6. Centrifugar 20 minutos a 18.000 xg a 4 ° C. Enjuague en etanol al 70%.
   7. Centrifugar 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Deje secar y volver a suspender en agua libre de RNasa a una concentración final de 0,5 mg / l.
   8. Transcribir 1 g de ADN linealizado utilizando un kit de síntesis de ARNm con la polimerasa apropiada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   9. Extraer el ARNm con 5: 1 de fenol (pH 4,7): solución de parada cloroformo y acetato de amonio proporcionado con el kit.
   10. Vortex durante 20 segundos, centrifuge 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa.
   11. Se extrae la fase acuosa de nuevo con 24: 1 de cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa.
   12. Precipitar el ARNm con 100% de isopropanol durante la noche a -20 ° C.
   13. Centrifugar 20 minutos a 18.000 xg a 4 ° C. Enjuague con etanol al 80%.
   14. Centrifugar 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Deje que el sedimento seco a temperatura ambiente durante no más de 5 a 10 minutos, ya que entonces será difícil para volver a suspender. Resuspender en DNasa y RNasa libre de agua a una concentración final de al menos 2 g / l para asegurar una concentración final de mRNA decente en la mezcla de inyección.
   15. Para comprobar la calidad y el tamaño del producto de transcripción, ejecute 0,5 l de la ARNm en un 1% de gel de agarosa-TBE RNasa libre en tampón TBE a 150 W durante 20 min. Tienda 2 alícuotas a -80 ° C.
6. Platos poli-lisina
   NOTA: Poli-lisina coaplatos TED se utilizan para inmovilizar los ovocitos durante la inyección.
   1. Para cada 35 mm de cultivo celular placa de Petri (5 en total), cubrir la parte inferior de la placa de Petri con 1 ml de la solución de poli-lisina descongelado 0,25 mg / ml. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   2. Por cada 35 mm de cultivo celular placa de Petri (5 en total), transferir la solución de poli-lisina 0,25 mg / ml en otro 35 mm de cultivo celular placa de Petri. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   3. Deseche la solución de poli-lisina 0,25 mg / ml.
   4. Deje que los platos de Petri seca, boca abajo a temperatura ambiente durante 2 hr.
   5. Guarde los platos poli-lisina recubierto envueltas en una envoltura de plástico a 4 ° C para evitar la contaminación durante una semana como máximo.
7. Platos de agarosa recubiertas de
   NOTA: Se utilizan para la cultura inyectado embriones. La agarosa proporciona un cojín para los embriones inyectados y evita que se pegue al fondo del plato.
   1. Hacer agua de mar artificial (ASW), utilizando 37 a 38 g / L commsales erciales + 0,25 mM _NaHCO3 en agua de ósmosis inversa.
   2. Disolver agarosa a una concentración del 1% en 0,22 micras ASW filtrada por calentamiento de la solución en un microondas.
   3. Rápidamente se vierte la solución de agarosa caliente de una placa de Petri de 35 mm en otro a fin de garantizar un recubrimiento de agarosa muy delgada del plato.
   4. Almacenar los platos de agarosa recubiertas de envueltos en Saran Wrap a 4 ° C para evitar la contaminación durante una semana como máximo.
8. Mezcla de inyección y la carga de las agujas de inyección
   1. Acerca de 2 hr antes de comenzar las inyecciones, hacer una mezcla de inyección de 2 l en RNasa y agua libre de DNasa con concentraciones finales de 1-1,8 g / l de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de rojo fenol.
      NOTA: Los colores rojo fenol La solución, que permite el seguimiento de la eficacia de la inyección y la identificación de los embriones inyectados con éxito. El glicerol favorece la difusión de ARNm dentro del ovocito.
   2. Centrifugar 4 min a 18.000 xg acristales de pellets. Mantener en hielo hasta su uso.
   3. Con una pipeta de 10 l, recoger 0,5 l de la mezcla de inyección, evitando la parte inferior del tubo, donde se han sedimentado los cristales.
   4. Rellene al menos dos agujas de inyección (en caso de que se rompe durante la inyección) pipeteando la caída de 0.5 l de la mezcla de inyección en la abertura grande de la aguja.
   5. Instalar las agujas en un frasco de almacenamiento de líquido en la parte inferior a 4 ° C para evitar la evaporación de la mezcla de inyección. Deje que la mezcla de inyección lentamente viajar a la punta de la aguja de inyección durante al menos 1 hr para reducir al mínimo la creación de burbujas.
   6. Tienda mezcla adicional de inyección a -80 ° C para un máximo de tres usos adicionales, después de lo cual se deteriora la calidad de ARNm (datos no mostrados).

2. Recolección de material biológico, microinyección y cultivo de embriones

1. Ovocitos y espermatozoides colección
   NOTA: Ver Theodosiouet al., ¹² para un protocolo detallado para inducir el desove, y de recogida de gametos.
   1. Machos y hembras de Choque en ASW a 23 ° C durante 24 horas.
   2. De una a dos horas antes de la puesta del sol, transferir los adultos en copas individuales en ASW a 19 ° C, ya que la mayoría de los adultos desovan 1-2 horas después de la puesta del sol.
   3. Enjuague 35 mm placas de Petri en ASW se filtró y dejar secar al revés para evitar que los ovocitos se pegue a la parte inferior del plato.
   4. Tras el desove, recoger inmediatamente los espermatozoides y ovocitos con una pipeta 1.000 l.
      1. Mantener esperma y ovocitos separada de amphioxus adulto porque el contacto es perjudicial para la salud de gametos (datos no mostrados).
      2. Además, evitar asustar a los adultos, lo que conduce a movimientos que disipan, y por lo tanto diluir, tanto esperma y ovocitos. Para mantener el esperma activo el mayor tiempo posible y para optimizar la tasa de fertilización, recoger el esperma lo más concentrada posible.
   5. Manteneresperma en hielo en un tubo de 1,5 ml.
   6. Traslado ovocitos en filtrada ASW en los 35 mm platos pre-enjuagado Petri.
   7. Transferencia 100-500 ovocitos con una anterioridad tirado 300-400 micras transferencia pipeta Pasteur a otro de 35 mm placa de Petri para realizar las inyecciones.
   8. Fertilizar el resto del embrague como un control para el esperma y calidad de los ovocitos o para otros experimentos.
2. Inyección de ovocitos
   1. Instalar la aguja de inyección en el micromanipulador en un 50 ° ángulo con respecto al plano horizontal.
      NOTA: Los ángulos de menos de 50 ° empujarán los ovocitos alrededor en el plato, mientras que los ángulos de más de 50 ° no permitirán un adecuado seguimiento de la posición de la aguja en relación con el ovocito.
   2. Bajo un microscopio de disección fluorescente con 25X oculares, transferir 30 ovocitos con el 300-400 micras transferencia pipeta Pasteur en un plato de poli-lisina que contiene filtrada ASW.
   3. Deposite los ovocitos largo de una línea para llevarinyecciones a cabo de manera ordenada y distinguir inyectados de oocitos no inyectados. Inyectar pequeños números (30 oocitos) para minimizar el tiempo de exposición de ovocitos a la poli-lisina, que tiende a deformar los embriones en desarrollo (datos no mostrados).
   4. Use la iluminación de campo oscuro para hacer que los ovocitos como translúcido posible.
   5. Con el mando de movimiento grosero del micromanipulador, llevar la aguja de inyección de cerca de un ovocito.
   6. Con unas pinzas finas, cortar y abrir la aguja en el nivel donde la punta comienza a ser curvado. Por pulsante con el inyector, compruebe que la mezcla de inyección de tinta está fluyendo en realidad fuera de la aguja.
   7. En una ampliación de 200X y con el mando de movimiento fino del micromanipulador, mover suavemente la aguja de inyección dentro del núcleo del ovocito.
      NOTA: Si se inserta demasiado superficial, la solución inyectada no va a permanecer en el interior del ovocito. Si se inserta demasiado lejos, se destruirá el ovocito.
   8. Inyectar con 1-3 pulsos de 120 ms Durationes y 1-10 psi de presión. Si la aguja está lo suficientemente fina, inyectar con flujo continuo a presión constante. Asegúrese de que el volumen de inyección corresponde a 1/5 a 1/3 del volumen de un solo ovocito.
   9. Después de la inyección, retire la aguja con rapidez para evitar la fuga de los ovocitos.
   10. Verifique que la solución inyectada permanece dentro del ovocito y que después de unos pocos segundos, la solución inyectada se extiende por todo el ovocito.
   11. Pasar a la siguiente ovocitos en línea.
   12. Mantenga algunos embriones no inyectados de cada serie como control negativo para estimar la fluorescencia de fondo durante la búsqueda de los embriones inyectados.
3. La fertilización, selección de embriones inyectados y cultivo de embriones
   1. Fecundar los ovocitos tan pronto como se ha inyectado una serie. Dado que la calidad de los ovocitos disminuye con el tiempo, inyectar y fecundar los ovocitos dentro de 1 hora después del desove ^12.
   2. Dependiendo de la concentración de espermatozoides, añadir 1-5 gotas de esperma de los ovocitos ygirar el plato.
      NOTA: El sobre fertilización debe ser evidentes en los embriones después de 1 min.
   3. Permitir a los embriones desprenden de la placa de poli-lisina, mientras se inyecta otra serie de ovocitos.
   4. La transferencia de los embriones con la transferencia de 600 micras pipeta Pasteur en un plato de Petri de agarosa-revestido. Eliminar los embriones desde el plato de poli-lisina tan pronto como sea posible, si es posible antes de la etapa de 2 células.
      NOTA: En caso de exposición prolongada a la poli-lisina, los embriones tienden a convertirse en blastulae densamente poblado-aplanada en el lado tocar el fondo del plato.
   5. En la etapa de 2 células de 4 celdas, seleccione con un microscopio de disección fluorescente con filtro DSR los embriones inyectados con éxito, es decir, los que tienen una morfología normal que exhiben una señal fluorescente de color rojo derivado de rojo fenol.
   6. Mantener los embriones en cultivo in filtrada ASW en platos de agarosa recubiertas de Petri a 19 ° C hasta que la fase deseada paraimágenes in vivo.

El protocolo se detalla más arriba proporciona la base para la microinyección de B. ovocitos lanceolatum y por lo tanto para la introducción en el desarrollo de B. embriones lanceolatum de ARNm que codifica proteínas fluorescentes para formación de imágenes in vivo. Aunque la técnica es ciertamente robusto y fiable, la tasa de inyecciones exitosas que utilizan este protocolo sigue siendo variable (Tabla 1). La explicación muy probable para este hecho intrigante es la extrema variabilidad de los embragues de ovocitos: los diferentes lotes de huevo de hecho se comportan de manera muy diferente, cuando se somete a la presión de inyección. Algunos ovocitos son más bien elástica y tienden a aplanarse en la parte inferior del plato, mientras que otros son bastante rígidas y permanecen ronda después de la inyección. Además, algunos lotes de ovocitos tienden a inflar sus membranas corion Tras la inyección, mientras que otros simplemente lisan (datos no mostrados). No hay correlación obvia podría establecerse entre el comportamiento de los ovocitos tras la inyección y embrionariadesarrollo después de la fecundación. Por tanto, es difícil anticipar qué categoría de ovocitos es el más adecuado para la microinyección. Sin embargo después de la fecundación, los embriones sometidos desarrollo normal se pueden identificar tan pronto como etapas de escisión: 2-célula a embriones en estadio de 4 células puede considerarse normal cuando la superficie de contacto entre blastómeros es pequeño, mientras que un embrión de escisión etapa compactado, donde las células individuales son difíciles de discernir, es claramente anormal.

En nuestras manos, alrededor de la mitad de los ovocitos no sobreviven el trauma causado por la inyección y aproximadamente la mitad de los embriones que sobreviven la exposición de la inyección de un marcador fluorescente específico. Por lo tanto, se estima que con este protocolo de inyección, entre 50 y 120 embriones se pueden inyectar con éxito en un día determinado de desove y que oscilan entre 15 y 60 embriones etiquetados.

La fluorescencia roja del rojo de fenol en 2-célula a embriones en estadio de 4 células marca muy fiable embriones que tienensido debidamente inyectado, como 100% de los embriones seleccionados de esta manera, posteriormente, producir las proteínas fluorescentes codificadas por el ARNm inyectado. Además, hay una correlación positiva muy clara entre la intensidad de la fluorescencia de rojo de fenol en la etapa de 2 células para 4-célula y el tiempo de aparición de la fluorescencia producida por las proteínas codificadas por el ARNm inyectado. Esta correlación permite así la identificación de aquellos embriones que han recibido la mayor cantidad de ARNm durante el proceso de inyección.

Si la señal de la proteína fluorescente codificada por el ARNm inyectado no se detecta después de la selección de embriones Red-positivos fenol, se recomienda para ejecutar la inyección de la mezcla en un gel de RNasa libre con el fin de comprobar la degradación del ARNm o la captura (Figura 3) . En el carril 1, se detecta una banda de mRNA intacto. La inyección de esta mezcla dio lugar a una fuerte señal fluorescente en el embrión. Por el contrario, en el carril 2 que corresponde a otros experimendonde t rojo fenol fue sustituido con el tinte de dextrano en la mezcla (véase la discusión para más detalles), el ARNm parece haber sido atrapado por el tinte de dextrano y la inyección de esta mezcla nunca llevado a la señal fluorescente en el embrión.

Usando esta técnica de microinyección y nuestras construcciones (Cuadros 2 y 3, Archivo 1) (véase el debate), que por lo tanto podemos producir reproducible etiquetado fluorescente homogéneo en todo el embrión con mCherry o eGFP en el núcleo y con eGFP en la membrana (Figura 4) . El protocolo de formación de imágenes usado para generar la Figura 4 se describe en otro lugar (Faure et al., En preparación). Dependiendo de la cantidad de ARNm se inyecta, expresión de la proteína fluorescente normalmente se vuelve detectable entre 16 células (Figura 4A) y 64 etapas de células y permanece detectable por lo menos hasta la etapa tardía neurula (datos no mostrados). Las etapas posteriores no han sido probados. Señal Nuclearaparece típicamente antes de la señal de membrana, potencialmente debido a la naturaleza intrínsecamente difuso de la membrana en comparación con la naturaleza compacta del núcleo (datos no mostrados). Aunque no ha sido supervisado sistemáticamente, los embriones inyectados con tanto una nuclear y una etiqueta de membrana parecen ser menos saludables que los embriones inyectados exclusivamente con una etiqueta eGFP nuclear. Curiosamente, este efecto parece ser independiente de la cantidad total de ARNm inyectado como la cantidad total de ARNm inyectado es el mismo, ya sea una o dos especies de ARNm se incluyen a la mezcla (datos no mostrados).

Figura 1: Construir detalles. Bocetos de (A) de la membrana orientada eGFP (eGFP: caja CAAX), (B) el dirigido al núcleo eGFP (H2B: EGFP) y (C) el dirigido al núcleo mCherry (H2B: mCherry) construye are muestra.

Figura 2: Forma de una aguja de inyección representante. (A) La puesta a punto es de unos 2 cm de longitud y las curvas de aguja en la punta. Barra de escala = 2 mm. (B) Ampliación de la zona de caja en A. La posición de recorte para la aguja (flecha) se encuentra en la curva de la aguja. La punta de la aguja está indicado por la punta de flecha. Barra de escala = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Las interacciones de ARNm y tintes fluorescentes seleccionados (A) Resultado de la migración de una mezcla que contiene ARNm y rojo fenol en el carril 1 yde mRNA y dextrano Texas Red (a una concentración final de 3,3 mg / ml) en el carril 2. (B) Resultado de la migración de una mezcla que contiene dextrano ARNm y Oregon Green (a una concentración final de 3,3 mg / ml) en el carril 3, de ARNm y FITC dextrano (a una concentración final de 3,3 mg / ml) en el carril 4 y del mRNA y rodamina dextrano (a una concentración final de 3,3 mg / ml) en 5. Gel carril de tiempo de migración en A y B era diferente. En aras de la claridad, el rectángulo negro en una oculta una reflexión de la luz y las líneas discontinuas delimitan los carriles de migración. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representación 3D (software Amira) de embriones amphioxus inyectados con ARNm que codifica para proteínas fluorescentes Las imágenes son.extraído de-lapsos de tiempo 3D adquiridos en una Leica SP5 2 fotones microscopio de escaneo láser optimizado etapa (A) de 16 células de embriones expresar H2B nuclear:.. eGFP (B) Gástrula etapa embrionaria expresar H2B nuclear: mCherry y la membrana de orientación eGFP:. CAAX caja (C) Gástrula etapa embrionaria expresar H2B nuclear: mCherry y la eGFP membrana orientada: caja CAAX. La sección óptica muestra células internas con EGFP señales asociadas a la membrana nuclear y mCherry. La barra de escala = 50 micras.

Tabla 1:. Las tasas de éxito de inyección Las construcciones inyectados, el número de embriones inyectados que sobrevivieron a la inyección y el número de embriones etiquetados (o inyectados con éxito) se indican, como es el porcentaje total de inyecciones exitosas.

Tabla 2:. Optimización provisional de secuencias Kozak Original y secuencias Kozak mutados se indican para cada construcción. Las mutaciones introducidas recuperan la secuencia de Kozak de la B. gen actina lanceolatum, que se parece mucho a la del teórico secuencia Kozak preferido inferido de anfioxo (A / CGA / CG / TTC A / GAC atg TG / TC).

Tabla 3: optimización provisional de uso de codones. Codones originales y mutados se indican para cada construcción. Si bien esto no ha sido probado experimentalmente, la Mutati introducidoons están destinados a optimizar la traducción del ARNm en anfioxo.

Archivo 1: construir secuencias Las secuencias de nucleótidos de (A) la membrana orientada eGFP. (EGFP: caja CAAX), (B) el dirigido al núcleo eGFP (H2B: eGFP) y (C) la mCherry dirigido al núcleo (H2B : mCherry) constructos se dan en el contexto de la pCS2 + vector columna vertebral. Los principales dominios codificados por cada uno de los constructos se indican en el color: eGFP (verde), mCherry (rojo), señal de localización de membrana (caja CAAX) HRAS humano (cian azul), el pez cebra exón 2B de la histona (H2B) (amarillo).

En este artículo, presentamos, por primera vez, un protocolo detallado y reproducible para la inyección de B. ovocitos lanceolatum, que, después de B. floridae ^13,14 y B. belcheri ^15, es, pues, la tercera especie amphioxus, para los que tal técnica se ha descrito. Es importante destacar que el protocolo descrito aquí también incluye la descripción de sistemas de vectores adecuados para la producción de proteínas fluorescentes en B. lanceolatum a partir de ARNm inyectados producidos in vitro (descrito a continuación). En conjunto, estas nuevas herramientas permiten imágenes in vivo del desarrollo temprano de anfioxo y el análisis de los comportamientos celulares dinámicas que subyacen a los eventos morfogenéticos primeros en el embrión, como la escisión y la gastrulación.

En general, la técnica de microinyección tiene la ventaja de permitir la entrega, en una célula diana, de un volumen predefinido de un compuesto específico. Con esta siendo sayuda, una importante limitación de esta técnica es el número limitado de células que pueden ser inyectados durante un experimento dado. Por ejemplo, el protocolo descrito aquí por B. lanceolatum permite la inyección de 100 a 120 huevos por sesión de inyección, de los cuales cerca de la mitad será etiquetado (Tabla 3). Para B. floridae, los números son muy similares con 500 o más huevos que pueden ser inyectados por día, de los cuales más del 50% sobrevivirá a la inyección de ^13,14. Si bien los protocolos para la inyección B. lanceolatum y B. huevos floridae se parecen mucho entre sí, el B. belcheri técnica es ligeramente diferente: los huevos se colocan en poli-lisina cubreobjetos y las inyecciones se realizan bajo un microscopio invertido usando un microinyector de una marca diferente. Este enfoque aparentemente permite la inyección de entre 200 y 300 B. huevos belcheri por sesión de inyección con una tasa de supervivencia, después de la eclosión en la etapa neurula, of 89,39% a 95,83% ^15. Teniendo en cuenta las diferencias en los protocolos, es difícil saber si las diferencias en las tasas de éxito se deben a diferencias relacionados con especies o relacionados con el protocolo. Habría que probar las diferentes especies en paralelo con los diferentes protocolos para responder a esta pregunta. Sin embargo, para aumentar aún más el número de ovocitos específicas para la administración de compuestos exógenos, otros protocolos tendrán que ser desarrollado para amphioxus. Técnicas de candidatos incluyen electroporación, bombardeo con micropartículas, lipofección, y la transducción de ^4. De la nota, la electroporación ya ha sido establecida como una técnica estándar para la introducción de material exógeno en los huevos fertilizados tunicado ascidia, otro modelo cordados invertebrados utiliza para estudiar la evolución de los mecanismos de desarrollo ^8.

Para la microinyección éxito y la posterior formación de imágenes in vivo de proteínas fluorescentes, adecuadovectores de expresión son un requisito previo obligatorio. Hacia este fin, tres plásmidos se han desarrollado y validado experimentalmente (Figura 1, complementario Archivo 1): para la orientación de la membrana, el gen eGFP se fusionó en su extremo 3 'a la caja CAAX HRAS humano (que resulta en un eGFP: cuadro de constructo CAAX ) ¹⁶ y, para la focalización nuclear, tanto el eGFP y los genes mCherry se fusionaron en su extremos 5 'y al exón 2B histona pez cebra (H2B) (resultante, respectivamente, en un H2B: eGFP y un H2B: constructo mCherry) ^17. Cada una de estas construcciones se ha clonado en el plásmido pCS2 + que contiene un sitio de poliadenilación tardía de SV40 y un promotor SP6 permitiendo in vitro la síntesis de mRNA capsulado ^18,19. Además, con el objetivo de optimizar la traducción de las construcciones en B. lanceolatum, tanto las secuencias Kozak y los codones se han adaptado mediante mutagénesis de nucleótidos (tablas 2 y 3, Archivo 1). Based en el enfoque por Nakagawa ^20, un pequeño grupo de B. lanceolatum genes se analizaron para identificar una secuencia Kozak preferido en esta especie. La secuencia conocida más cercana de origen natural a esta secuencia teórica preferida es la de la B. lanceolatum gen de la actina. Las secuencias de Kozak de las tres construcciones fueron por lo tanto, modificarse para que coincida con esta secuencia de gen de la actina. Además, el uso de codones de B. lanceolatum se analizó utilizando la base de datos de uso de codones ²¹ y codones en las construcciones con una probabilidad baja utilización en B. lanceolatum (<10%) fueron reemplazados, siempre que sea posible, por los codones equivalentes con una mayor probabilidad de uso.

Los resultados de las inyecciones muestran que el nivel de expresión de la proteína a partir de estos vectores es adecuado para análisis de formación de imágenes in vivo. Teniendo en cuenta que la salida de expresión de los vectores modificados no se ha comparado con la de las construcciones no modificados, no podemos estafarincluir en la eficiencia de las modificaciones que se introdujeron en el consenso Kozak y las secuencias de codificación. Sin duda, sería interesante comprobar si estas modificaciones de hecho tienen un impacto en los niveles de expresión de proteínas. En este sentido, un reciente análisis basado en microinyecciones en B. belcheri sugiere que otros vectores no modificados, también se pueden utilizar para la síntesis de ARNm para la producción de la proteína fluorescente en amphioxus ^15.

Amphioxus contiene proteínas fluorescentes verdes endógenos ^22. Por tanto, los embriones exhiben bajos niveles de verde, así como fluorescencia roja (nuestras observaciones no publicadas). Sin embargo, estos niveles endógenos son insignificantes con respecto a los niveles de fluorescencia resultantes de la inyección de nuestras construcciones de mRNA. Por lo tanto, la fluorescencia endógena de embriones amphioxus no perturba observaciones experimentales utilizando binoculares fluorescentes o microscopios de escaneo multi-láser. Adicionalmente, Los experimentos de inyección revelan que la intensidad de la fluorescencia exógena generada por la inyección de ARNm depende de la cantidad real de material inyectado, que se correlaciona directamente con la concentración final de mRNA utilizado en la mezcla de inyección. B. embriones lanceolatum tienden a tolerar una concentración de hasta 1,8 g / l de ARNm, aunque, independiente de la concentración de ARNm real, algunas combinaciones de mRNA parecen ser menos tolerado por B. lanceolatum embriones que otros. Por lo tanto, la combinación de mCherry nuclear y de membrana eGFP mRNAs parecía ser más tóxico que la inyección de eGFP nuclear por sí sola.

Dextrano Texas Red se ha utilizado anteriormente como un trazador para inyecciones exitosas en oocitos amphioxus ^13-15. Curiosamente, una señal fluorescente derivado del mRNA inyectado nunca se obtuvo después de la inyección de soluciones que contienen dextrano Texas Red y esto en ambos ovocitos amphioxus (n = 4 experimentos) y zebrafiembriones de peces (n = 3 experimentos). Cuando una mezcla que contiene la inyección in vitro ARNm transcrito y Texas Red dextrano se carga en un gel de RNasa libre de agarosa (Figura 3, carril 2), la banda correspondiente al ARNm está ausente. Por el contrario, in vitro ARNm transcrito es detectable en un gel de agarosa RNasa libre en presencia de rojo de fenol (Figura 3, carril 1). Dado que no hay evidencia para la degradación de mRNA en el gel, estos resultados sugieren que el dextrano Texas Red tiende a atrapar mRNA. Cuando se utiliza en una solución de inyección, dextrano Texas Red podría evitar así la traducción del ARNm inyectado. Después de esta observación, las interacciones de otros colorantes (dextrano FITC, rodamina y dextrano Oregon Green dextrano) con mRNA fueron probados, tanto en geles de agarosa libre de RNasa y por inyección en B. lanceolatum o el pez cebra (Figura 3). Los análisis indican que FITC dextrano no hace trampa de mRNA en gel (Figura 3, lane 4) y conduce a la expresión de la proteína fluorescente en el pez cebra (n = 1 experimento), pero no en los embriones de B. lanceolatum (n = 1 experimento) (datos no mostrados). Dextrano Rodamina no atrapa mRNA en gel (Figura 3, carril 5) y conduce a la expresión de la proteína fluorescente en embriones de pez cebra (n = 1 experimento) (datos no presentados), pero su actividad no podía ser probado en desgracia B. embriones lanceolatum. Finalmente, como el dextrano Oregon Green migra al mismo nivel que el mRNA, mRNA para atrapar podría no ser evaluada por gel de agarosa (Figura 3, carril 3). Este último colorante impedido expresión de la proteína fluorescente en amphioxus (n = 1 experimento), pero los embriones de pez cebra no (n = 1 experimento) (datos no mostrados). En resumen, estos datos sugieren que algunos dextranos pueden inhibir eficazmente la traducción de ARNm inyectado. Dado que los experimentos de dosis-respuesta no se llevaron a cabo, estos datos son cualitativos. Curiosamente, este efecto inhibitorio parece ser dependiente delas especies animales (peces cebra frente amphioxus), que pone de relieve la necesidad de realizar más estudios para comprender los mecanismos subyacentes a este efecto. Además, estos resultados requieren análisis preliminares, si los dextranos son para ser utilizados como trazadores de color para inyecciones.

El desarrollo de la técnica de microinyección para un determinado modelo abre la puerta a la manipulación de genes específicos. En amphioxus, por ejemplo, la primera descripción de microinyecciones (en B. floridae) fue seguido por la caída exitosa de un gen, Hox1, usando inyecciones de oligonucleótidos morfolino ^23,24. El número de B. embriones lanceolatum que con éxito se pueden inyectar todos los días usando el protocolo que se presenta aquí es ciertamente compatible con este tipo de estudios. Además, con estos métodos y las nuevas construcciones en la mano, se puede ahora también diseñar y llevar a cabo estudios de sobreexpresión y desmontables por la inyección de ARNm de interés (nativo o dominante-negformas ativa) o utilizar otras estrategias para alterar la expresión de genes (por ejemplo microRNA- o estrategias basadas en shRNA). Hasta el momento, las inyecciones amphioxus sólo se pueden realizar en la etapa de ovocitos, simplemente porque esta es la única etapa en la que se puede inmovilizar de manera eficiente. Después de la inyección en la etapa de ovocitos, la molécula de interés se expresa de forma ubicua en el embrión. Por lo tanto, si la expresión del gen necesita ser alterado o supervisado sólo en un subconjunto de células, construcciones de ADN deben ser inyectado, ya que estos se expresan mosaically en el embrión en desarrollo amphioxus ^15,25-27. Inyecciones construcción de ADN también se pueden utilizar para probar la actividad de las regiones reguladoras durante el desarrollo amphioxus en ensayos transitorios transgénicos, con el inconveniente mencionado anteriormente de expresión mosaico ^15,25-27.

En última instancia, la técnica de microinyección anfioxo también abre la puerta para la transgénesis estable, incluyendo el golpe de gracia específica o knock-in de loci genéticos específicos. Sistemas para la inserción estable de ADN exógeno ya existe, por ejemplo, con el sistema basado en transposón Tol2 peces que parece funcionar en ambos insectos y vertebrados amniotas ^28. Además, los enfoques basados ​​en las nucleasas de dedos de zinc modificados (ZFNs) o de transcripción nucleasas efectoras del tipo activador de (Talens) o herramientas de edición genoma de ARN-guiada (CRISPR / sistema de Cas) podría ser utilizado para generar mutaciones puntuales y knock-in modificaciones en específica regiones del genoma ^29. Estos esfuerzos requerirán la cría durante todo el año de anfioxo en cautiverio, que ya ha sido creado para B. belcheri ^11,30 y B. japonicum ^30,31 y está siendo desarrollado actualmente por A. lucayanum, B. floridae y la especie amphioxus ofrecen aquí, B. lanceolatum ^32.

The authors have nothing to disclose.

Los autores desean agradecer el apoyo por el "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" para la cría de animales. Este trabajo fue apoyado por fondos de la ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 y ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, por la subvención de la Unión Europea 6PM "Embryomics" y por la subvención ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Proceso "de Jean-François Nicolas y Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho es financiado por una beca de doctorado FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Las solicitudes de los vectores descritos aquí pueden dirigirse directamente a los autores.