蛍光タンパク質の発現において

私たちは、Branchiostomaのlanceolatumの未受精卵母細胞へのmRNA注入後、ここで蛍光タンパク質の堅牢かつ効率的な発現を報告している。この基底脊索動物におけるマイクロインジェクション技術の開発は、in vivoイメージングと遺伝子特異的な操作に含めて、この新たなモデル系で遠大な技術革新のための道を開く。

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

開発中は、単一の細胞は細胞分裂や動きの両方が関与非常に複雑なプロセスで、生物全体を生じさせる。優れた細胞の挙動の力学の基礎となる生物学的原理を理解するために、発生生物学者は、蛍光ベースのインビボイメージング技術を使用し始めている。特定のこのような細胞膜などの細胞の区画のいずれかの蛍光色素での処理により標識することができる、特異性および組織浸透¹の欠如によって妨げられアプローチ、または蛍光タンパク質^2をコードする外因性mRNAの胚に特異的な導入による。別の技術は、mRNAのような外因性化合物の効率的な送達のために用いることができる。これらには、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子、リポフェクションおよび形質導入^3,4との衝撃が、これらに限定されない。これらのアプローチの全ては、外来性化合物を導入するために使用することができるが胚を開発し、唯一のマイクロインジェクションは、各セル³内にあらかじめ定義されたと正確な量の適用を可能にする。マイクロインジェクション技術は、すべての主要な発達のモデル系^4（ 例えば 、ショウジョウバエ、線虫、ゼブラフィッシュ、カエル、マウス）のためだけでなく、発達のメカニズムの進化を理解することを目的とした比較研究のために使用されるものを含むいくつかの代替モデル^4、のために記載されている（ 例えば 、イソギンチャク、環形動物ワーム、ウニ、ホヤホヤ、ナメクジウオのナメクジウオ）。

一緒にホヤと脊椎動物で脊索動物門を確立Cephalochordatesは、特に、脊索動物の進化と無脊椎動物の祖先^5-8から脊椎動物の多様化を研究するために非常に適したモデルです。ナメクジウオ系統は、脊索動物の進化の過程で非常に初期の発散。 3属（ ブランに細分され、現存cephalochordates、chiostoma、AsymmetronとEpigonichthys）、全体的な解剖学とゲノムアーキテクチャ^5-8の両面脊椎動物に似ている。これまでに記載されているcephalochordatesの約30種のうち、5人は発生学的と発達研究の^6,9のために用意されていますAsymmetronのlucayanum（バハマのナメクジウオ）、Branchiostoma floridae（フロリダナメクジウオ）、Branchiostomaのlanceolatum（欧州ナメクジウオ）、 Branchiostoma belcheri（中国語ナメクジウオ）とBranchiostoma吸虫 （日本ナメクジウオ）。これらの種の3（B.のlanceolatum、B. belcheriおよびB. japonicumの ）の熟した大人の繁殖期^10,11の間にオンデマンド産卵するように誘導することができる。さらに、少なくともBのlanceolatum、効率的な産卵も、それによって研究所のために、この特定のナメクジウオ種がアクセスできるように、人工海水¹²に誘導することができる自然海水へのアクセス権を持っていないIES。 Bの組み合わせ、 lanceolatum、そのようなマイクロインジェクションなどの効率的な配信方法で胚に便利で信頼性の高いアクセスのため、これまでに^{13〜15、（B。floridae}およびB. belcheriの両方で）ナメクジウオで開発された唯一の送達技術は、の開発を可能にします系統tracing-と動的な細胞の挙動に基づくアプローチを含む整体技術の新規スイート。

B.蛍光タンパク質を発現するmRNAの効率的なマイクロインジェクションのためのプロトコルlanceolatum胚 、したがって開発されました。さらに、Bのライブイメージングのための基本的なツールキットを提供するためにlanceolatum胚 、ベクター系は、膜結合および蛍光タンパク質の核発現を可能にするように開発された。膜標的化するための、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）はmCherryをとeGFPの人間HRAS CAAXボックスと核局在化したこと融合させたゼブラフィッシュヒストン2B（H2B）エクソン（ 図1、補足ファイル1）への融合によって得られる。また、Bのタンパク質翻訳を最適化することを目標に、構築物のコザック配列及びコドンは改変されていると使用に適応lanceolatum。まとめると、ここで提示注入法および発現ベクターは、特に、最新の蛍光ベースの生体内イメージング技術を用いて分析し、cephalochordatesための新たな実験的アプローチを生成するための基礎として役立つ。

機器·試薬の調製

1. 転送パスツールピペット
   1. 異なる速度で炎の上に230ミリメートル長いパスツールピペットを引いて、異なる先端径の転送パスツールピペットのシリーズを生成します。テーパーは、吸引の円滑かつ微調整のために、できるだけ長くであることを確認してください。
   2. ダイヤモンドスクライブでは、ピペットの長さに垂直な線に沿ってピペットを傷つける。両手で、ブラントカットを生成するために、その長さにピペット平行に引く。迅速に難ポリッシュ先端を密封することなく、ピペット。
   3. ピペットでする卵母細胞/胚の段階で先端の直径が異なります（直径150μmの周りに）未受精卵のために300〜400ミクロン、受精卵（直径500ミクロン程度）のために600ミクロン、200〜400ミクロンハッチングneurulaeため。 1皿から卵母細胞/胚を転送するための口に監視吸引管で使用するピペット別。
2. 注射針
   1. RNaseフリーの条件を確実にするために手袋で毛細血管を操作する。 OD 1.20ミリメートル、ID 0.94ミリメートル、長さ10ミリメートルの寸法のフィラメント毛細血管にホウケイ酸ガラスを使用してください。
   2. 毛細血管が物質一覧に記載の加熱フィラメント針プラーの種類に引っ張られた場合は、次の設定を使用します：熱600は、ある形状を、確実に、それ以外の場合は50、速度80、時間60、圧力200または300を引いて成功した注射用の重要な、以下の特性を図2に示すように、4-8ミクロンの外側先端の直径、2cmのテーパー長を。
      注：針は産卵期の前に引き出され、シーズンを通して使用することができます。
3. 5％フェノールレッド原液（4X）
   1. 各産卵期の前に新鮮な準備をします。
   2. 0.22μmの濾過チューブでは、フェノールレッド粉末25mgを秤量。
   3. DNase-とRNaseフリー水0.5mlを追加粉末を含有するチューブ。
   4. 溶液を濾過滅菌し、注射針を詰まらせる可能性の結晶を除去し、室温で18000×gで3-5分間スピン。
   5. 4℃で保存または-20℃で250μlのアリコートを保存する。
4. 0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューション
   1. 各産卵期の前に新鮮な準備をします。
   2. 蒸留水20ml中のポリ-L-リジン5mgを溶解する。店舗-20℃で5ミリリットルのアリコート。
   3. ポリ - リジンコートディッシュに卵母細胞の再現可能と強固な密着性を確保するために、すぐに一度だけ解凍アリコートを使用してください。
5. mRNA合成
   1. 各産卵期の前に新鮮な準備をします。
   2. （37℃で、通常は2時間、）適切な酵素で目的のDNA5μgのを線形化。消化の完全性をチェックするには、20分間150 WでTBE緩衝液中の1％アガロース - TBEゲル上で消化ミックスの容量で2％を実行します。
   3. LINEAを抽出24：1フェノール（pHは8.0）：クロロホルム：イソアミルアルコール25と、有DNA。 20秒、遠心18000×gで10分間、そして水（上）相を集めるための渦。
   4. 1：クロロホルム：イソアミルアルコール24に再び水相を抽出します。 20秒間ボルテックス、18000×gで遠心分離10分、水相を収集します。
   5. 10：300線状化DNA：3 M酢酸ナトリウム（pH5.2）：-20℃で一晩、100％エタノール100と線状化DNAを沈殿させる。
   6. 4℃、18000×gで20分間遠心分離。 70％エタノールですすぎます。
   7. 4℃で18000×gで遠心し、10分。 RNaseフリー水ドライで再懸濁0.5μgの/μlの最終濃度でみましょう。
   8. 製造業者の説明書に従って、適切なポリメラーゼによるmRNA合成キットを用いて線状化DNAを1μgを転写する。
   9. 1フェノール（pHは4.7）：5でmRNAを抽出しキットで提供さクロロホルム及び酢酸アンモニウム停止液。
   10. 20秒間ボルテックス、CEntrifuge 18000×gで10分間、水相を収集します。
   11. 1：クロロホルム：イソアミルアルコール24に再び水相を抽出します。 20秒間ボルテックス、18000×gで遠心分離10分、水相を収集します。
   12. -20℃で一晩、100％イソプロパノールでmRNAを沈殿させる。
   13. 4℃、18000×gで20分間遠心分離。 80％エタノールですすぎます。
   14. 4℃で18000×gで遠心し、10分。それはその後再懸濁することは困難であるように、もはやより5〜10分間室温でペレットを乾燥してみましょう。少なくともを2μg/μlの最終濃度にDNase- RNaseフリー水に再懸濁し、注入混合物中のまともな最終のmRNA濃度を確保する。
   15. 転写産物の品質とサイズを確認するには、20分間150 WでのTBE緩衝液中のRNaseフリーの1％アガロース - TBEゲル上のmRNAの0.5μLを実行します。ストア-80℃で2μlを。
6. ポリリシン被覆ディッシュ
   注：ポリ - リジンCOAテッド皿を注入中に卵母細胞を固定化するために使用される。
   1. 各35ミリメートル細胞培養シャーレ（合計5）については、解凍した0.25 mg / mlのポリL-リジン溶液1mlをペトリ皿の底を覆う。 5分間室温でインキュベートする。
   2. 各35ミリメートル細胞培養シャーレ（合計5）については、別の35ミリメートル細胞培養シャーレに0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューションを転送する。 5分間室温でインキュベートする。
   3. 0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューションを捨てる。
   4. 2時間室温でペトリ皿を乾燥、逆さまましょう。
   5. 1週間の最大のための汚染を回避するために、4℃でプラスチックラップに包まれたポリ - リジンでコーティングされた料理を保管してください。
7. アガロース被覆ディッシュ
   注：彼らは文化注入した胚に使用されている。アガロースを注入した胚のためのクッションを提供し、皿の底に付着するからそれらを防ぐことができます。
   1. 人工海水（ASW）37〜38グラム/ LのCOMMを使用してください逆浸透水でercial塩+ 0.25mMのNaHCO _3で 。
   2. 電子レンジで溶液を加熱することにより、0.22μmの濾過されたASWアガロース1％の濃度に溶解させる。
   3. 迅速皿の非常に薄いアガロースコーティングを確実にするために、別の1つに35ミリメートルのペトリ皿からの温かいアガロース溶液を注ぐ。
   4. サランラップに包まれたアガロースでコーティングされた料理は1週間の最大のための汚染を回避するために、4℃でラップ保管してください。
8. 注射針の注入ミックスとロード
   1. 注射を開始する前に約2時間、mRNAの1から1.8μgの/μlの最終濃度のRNaseおよびDNaseフリー水で2μL注入ミックスを作る、15％グリセロール、1.25％フェノールレッド。
      注：フェノールレッドの色注入効率と成功して注入された胚の識別の監視を可能にするソリューション、。グリセロールは卵母細胞内のmRNAの拡散に有利に働く。
   2. 18,000×gで遠心分離し4分ペレットの結晶。使用するまで氷上に保管してください。
   3. 10μlのピペットを用いて、結晶がペレット化されたチューブの底を避け、注入ミックス0.5μlのを集める。
   4. 針の大開口の噴射ミックス0.5μlの低下をピペッティングして（注入中の場合で1休憩）は、少なくとも2つの注射針のバックフィル。
   5. 注射ミックスの蒸発を防ぐために4℃で底部に液体と保存瓶に針を取り付ける。注入混合物はゆっくりと気泡の発生を最小限にするために、少なくとも1時間、注射針の先端に移動してみましょう。
   6. mRNAの品質が劣化した後、3つの追加の用途は最大-80℃で保存追加噴射ミックス（データは示さず）。

2.生物材料、マイクロインジェクションの収集と胚培養

1. 卵母細胞と精子コレクション
   注：·セオドショーを参照してくださいら産卵を誘導するため、および配偶子の収集のための詳細なプロトコール^12。
   1. 24時間23℃でASWで衝撃オスとメス。
   2. ほとんどの大人は日没後1〜2時間を起動しますので、日没前に1〜2時間は、19℃でASW内の個々のカップに大人を転送する。
   3. フィルタリングASWに35ミリメートルペトリ皿をすすぎ、それらに皿の底に付着するの卵母細胞を防止するために、ドライ逆さまにしましょう​​。
   4. 産卵時には、すぐに千μlのピペットを用いて精子と卵母細胞を収集する。
      1. 精子を維持し、接点が配偶子の健康に有害であるため、卵母細胞は、成体ナメクジウオから分離した（データは示さず）。
      2. 更に、精子及び卵母細胞の両方を消散動きにつながる、成人驚くべき避けるため、希釈する。可能な限り、アクティブな精子を維持すると、受精率の最適化をできるだけ濃縮精子を収集する。
   5. キープ1.5ミリリットルチューブ内の氷の上で精子。
   6. 前すすぎ、35ミリメートルペトリ皿に濾過ASWに卵母細胞を転送します。
   7. 転送前に注射を実行するための別の35ミリメートルのペトリ皿に300〜400μmの転送パスツールピペットを引っ張った。と100〜500卵母細胞
   8. 精子と卵母細胞の質のために、または他の実験のための対照としてのクラッチの残りを肥やす。
2. 卵母細胞注入
   1. 水平面に対して50°の角度でマイクロマニピュレーターに注射針を取り付けます。
      注：以上の50度の角度は卵母細胞に比べて針位置の適切な監視を許可しませんしながら、50°未満の角度は、皿の上の周りの卵母細胞をプッシュします。
   2. 25X接眼レンズを有する蛍光解剖スコープの下では、フィルタリングさASWを含むポリリジンコートディッシュに300〜400μmの転送パスツールピペットを用いて30卵母細胞を移す。
   3. 運ぶためにラインに沿って卵母細胞を付着させる注文した方法で、注射外と非注入した卵母細胞から注入区別するために。発生中の胚を変形する傾向があるポリ - リジン、卵母細胞の曝露時間を最小限にするために少数（30卵母細胞）を注入した（データは示さず）。
   4. 可能な限り半透明の卵母細胞をレンダリングする暗視野照明を使用してください。
   5. マイクロマニピュレータの粗動ノブで、卵母細胞に近い注射針をもたらす。
   6. 細かい鉗子で、先端が湾曲し始めるレベルで針を切り開く。インジェクターでパルスすることにより、赤注入ミックスは、実際に針から流出していることを確認。
   7. 200Xの倍率でとマイクロマニピュレータの微動ノブで、優しく卵母細胞の核内部に注射針を動かす。
      注：あまりにも表面的に挿入した場合、注入されたソリューションは、卵母細胞内部に残ることはありません。あまりにも遠く挿入した場合、卵母細胞が破壊されます。
   8. 120ミリ秒duratの1-3パルスで注入イオンと1-10 PSI圧力。針が十分に微細であれば、一定の圧力で連続流で注入する。注入量は、単一の卵母細胞の容積の1/3に1/5に対応していることを確認してください。
   9. 注入後、卵母細胞の漏れを回避するために迅速に針を抜く。
   10. 注入されたソリューションは、卵母細胞内で、数秒後に、注入されたソリューションは、卵母細胞全体に広がることに変わりはないことを確認します。
   11. 行の次の卵母細胞へと移動します。
   12. 注入した胚のためにスキャンするときにバックグラウンド蛍光を推定するために、陰性対照として各シリーズのいくつかの非注入胚を保管してください。
3. 注入した胚及び胚培養の受精、選択
   1. とすぐに一連の注入されたように卵母細胞を受精。卵母細胞の品質が時間とともに低下したように^、12を産卵した後1時間以内に卵母細胞を注入して受精さ。
   2. 精子濃度に応じて、卵母細胞への精子の1-5滴を追加し、料理を旋回。
      注：受精エンベロープは、約1分後の胚で明らかになる必要があります。
   3. 卵母細胞の別の一連を注入しながら、胚はポリリジンでコーティングされた皿から切り離しできるようにする。
   4. アガロースでコーティングされたペトリ皿に600μmの転送パスツールピペットで胚を転送します。可能な限り2細胞期の前にあれば、できるだけ早くポリ - リジンコートディッシュから胚を削除します。
      NOTE：ポリリジンへの長期曝露の場合、胚は皿の底に触れる側に平坦化稠密胞胚、​​になる傾向がある。
   5. 4細胞期に、2セルでは、DSRフィルター付き蛍光解剖スコープで正常に注入胚、 すなわち、フェノールレッド由来の赤色蛍光シグナルを示す正常な形態を有するものを選択する。
   6. 所望の段階のためになるまで19℃でアガロースでコーティングされたペトリ皿中で濾過ASW中で培養中の胚を保つin vivoイメージングで。

上記の詳細なプロトコールは、Bのマイクロインジェクションのための基礎を提供するlanceolatum卵母細胞、したがって、Bの開発に導入するためin vivoイメージングのための蛍光タンパク質をコードするmRNAのlanceolatum胚 。技術は、確かに堅牢で信頼性があるが、このプロトコルを使用して成功した注射の速度は可変（ 表1）のままである。この魅力的な事実のために非常に可能性のある説明は、卵母細胞のクラッチの極端な変動性である：射出圧力を受けたときに別の卵のバッチは、確かに、非常に異なる挙動を示すん。いくつかの卵母細胞ではなく、弾性であり、他はかなり堅いであり、注入時にラウンドをしたまま、皿の底に平らにする傾向がある。さらに、いくつかの卵母細胞のバッチは、他の人が簡単に溶解する（データは示さず）が、注射の際、絨毛膜を膨張させる傾向がある。明らかな相関関係は、注入および胚の際卵母細胞の挙動との間に確立することができなかった受精後開発。これは、マイクロインジェクションのために最も適した卵母細胞のカテゴリ予測することは困難である。しかし受精後、正常な発達を受けた胚は、切断段階早けれ同定することができる。割球との接触面が小さい場合に、4細胞期胚の2細胞は、正常とみなすことができる圧縮された開裂段階の胚、個々の細胞、一方識別することは困難である、間違いなく異常である。

私たちの手では、卵母細胞の約半分は、注射、注入展示特定の蛍光標識を生き残るない胚の約半分に起因する外傷を生存しない。このように、我々はこの注入プロトコルで、50​​〜120の胚が正常に15と60ラベルの胚の間降伏与えられた産卵の日に注入することができると推定している。

4細胞期胚に2セルにおけるフェノールレッドの赤色蛍光は、非常に信頼性がある胚をマークこのようにして選択された胚の100％が、その後、注入されたmRNAによってコードされる蛍光タンパク質を産生するように適切に注入された。さらに、4細胞期まで2セルにおけるフェノールレッドの蛍光強度と注入されたmRNAによりコードされるタンパク質によって生じる蛍光の開始時間との間に非常に明確な正の相関がある。この相関関係は、このように、注入プロセス中のmRNAの最高量を受けたそれらの胚の同定を可能にする。

注入されたmRNAによりコードされる蛍光タンパク質のシグナルがフェノールレッド陽性胚の選択の後に検出されない場合、我々はmRNA分解又は捕捉を確認するために、RNアーゼを含まないゲル上の注入ミックスを実行することをお勧めします（ 図3） 。レーン1では、無傷のmRNAバンドが検出される。このミックスの注入は、胚の強い蛍光シグナルにつながった。逆に、レーン2の別experimenに対応するフェノールレッドをミックスにデキストラン染料と交換したT（詳細については説明を参照）、mRNAは胚に蛍光シグナルにつながったことはありません。このミックスのデキストラン染料と注入によって捕捉されているようだ。

（説明を参照してください）このマイクロインジェクション技術と、当社の構造（ 表2、表3、補足ファイル1）を使用して、我々はこのように、再現性膜に核内に及びEGFPでmCherryをまたはEGFPで胚全体に均質な蛍光標識を生成することができます（ 図4） 。イメージングプロトコルは、（フォーレら、現在準備中）他の場所に記載される。図4を生成するために使用される。 mRNAの量に依存した蛍光タンパク質の発現は、典型的には16細胞（ 図4A）および64細胞期の間に検出可能になると、少なくとも後期神経胚の段階まで検出可能なままで、注入された（データは示さず）。後の段階ではテストされていません。原子力信号典型的には、潜在的にあるため、核のコンパクトな性質と比較して、膜の本質的に拡散性質のため、メンブレン信号よりも早く現れた（データは示さず）。それが体系的に監視されていないが、核および膜ラベルの両方を注入した胚は、核のeGFP標識と排他的に注入した胚よりは健康であるように思われる。注入されたmRNAの総量は、1つまたは2つのmRNA種がミックスに含まれているかどうか、同じであるように興味深いことに、この効果は、注入されたmRNAの総量に依存しないように思われる（データは示さず）。

図1：詳細を構築します 。 （A）のスケッチ膜を標的とするeGFPの（EGFP：CAAXボックス）、（B）核標的のeGFP（H2B：EGFP）と（C）核標的mCherryを（H2B：mCherryを）は、ARを構築eが示す。

図2：代表的な注射針の形状。 （A）は、テーパー長さが約2センチ、先端の針の曲線である。スケールバー= 2ミリメートル。Aの箱入りの領域の（B）倍率針（矢印）をクリッピングするための位置は、針のカーブである。針の先端は、矢印で示されている。スケールバー=500μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：レーン1中のmRNAとフェノールレッドを含むミックスの移行のmRNAの相互作用と、選択した蛍光色素（A）の結果とmRNAおよびレーン（3.3 mg / mlの最終濃度）のmRNAおよびオレゴングリーンデキストランを含有する混合物の移動のレーン2（B）の結果で（3.3 mg / mlの最終濃度）、テキサスレッドデキストランA及びBにおけるレーン5ゲル移動時間レーン4（3.3 mg / mlの最終濃度）のmRNAおよびFITCデキストラン及び（3.3 mg / mlの最終濃度）のmRNAおよびローダミンデキストランの3、た異なる。明確にするために、光の反射と破線は、移行レーンを描くマスクに黒い長方形が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：蛍光タンパク質をコードするmRNAを注入したナメクジウオ胚の3Dレンダリング（アミラソフト）画像である。最適化されたライカSP5 2光子レーザ走査顕微鏡で取得した3次元の時間経過から抽出された核H2Bを発現する（A）16細胞期胚：eGFPの核H2Bを発現する（B）原腸胚段階の胚：mCherryを、膜標的化をのeGFP：CAAXボックス核H2Bを表す（C）原腸段階の胚：。mCherryを、膜を標的とするeGFPを：CAAXボックス。光学部は、核mCherryをし、膜関連eGFPの信号と内部細胞を示す。 =50μmのスケールバー。

表1：成功した注射の全体的な割合であるのでインジェクションの成功率に注射構築物、注射し、標識（または成功して注入された）胚の数を生き延び注入された胚の数は、示されている。

表2：コザック配列を暫定最適化オリジナルとコザック配列は各構築のために示されている変異した。導入された突然変異は、Bのコザック配列を回復非常に密接に似ているlanceolatumアクチン遺伝子、そのナメクジウオの推論された理論上の優先コザック配列の（A / CGA / CG / TTC A / GACのATG TG / CT）。

表3：コドン使用の暫定最適化 。オリジナルと変異したコドンが各構築のために示されている。これは実験的に試験されていないが、mutatiを導入しましたアドオンはナメクジウオでmRNAの翻訳を最適化することを意味する。

補足ファイル1：配列を構築 （A）膜を標的とするeGFPの（EGFP：CAAXボックス）の塩基配列。、（B）核標的のeGFP（H2B：EGFP）と（C）核標的mCherryを（H2B ：mCherryを）構築物はPCS2 +ベクターバックボーンの文脈に記載されている。構築物のそれぞれによってコードメインのドメインはカラーで表示されています。eGFPの（緑）、mCherryを（赤）、ヒトHRAS（CAAXボックス）からの膜局在化シグナル（ブルーシアン）、ゼブラフィッシュヒストン2Bエクソン（H2B）（黄色）。

この記事では、Bの注入のために、初めて、詳細かつ再現可能なプロトコルを提示lanceolatum卵母細胞、その、後にB. floridae ^13,14及びB. belcheri ^15は 、このようにしてそのような技術が記載されている第3ナメクジウオ種である。重要なことに、ここで説明するプロトコルは、Bの蛍光タンパク質の生産に適したベクター系の記述を含むインビトロで生成注射されたmRNAからlanceolatum（後述）。一緒に、これらの新しいツールは、ナメクジウオの早期開発とそのような切断や腸形成などの胚における最も初期の形態形成のイベントの根底にある動的な細胞の挙動の分析のin vivoイメージングで許可。

一般的には、マイクロインジェクション技術は、特定の化合物の予め定義された容積の標的細胞への送達を可能にするという利点を有する。このさsの助剤は、この技術の一つの主要な制限は、与えられた実験中に注入することができる限られた数の細胞である。例えば、プロトコルは、Bについて、ここで説明lanceolatumは約半分が、標識される、射出セッションごとに100から120卵、（ 表3）の注入を可能にする。 Bについてfloridae、数字は50％以上が注入^13,14生き残るそのうちの一日あたりに噴射することができる500以上の卵と非常に類似している。 Bを注入するためのプロトコルながらlanceolatumとB. floridae卵密接B.、互いに類似しているbelcheri技術は若干異なります。異なるブランドのマイクロインジェクターを用いて、倒立顕微鏡下で卵はポリリジンでコーティングされたカバースリップ上に配置され、注射が行われている。このアプローチは、明らかに、200〜300 Bの注入を可能に生存率は、神経胚段階で孵化後の噴射セッションごとbelcheri卵、OF 95.83パーセント^から15 89.39パーセント。プロトコルの違いを考慮すると、成功率の差は、種関連またはプロトコル関連の違いによるものであるかどうかを知ることは困難である。一つは、この質問に答えるために、異なるプロトコルと並列に異なる種をテストしなければならない。それにもかかわらず、さらに、外因性化合物の送達のために標的卵母細胞の数を増加させるために、他のプロトコルは、ナメクジウオのために開発されなければならない。候補技術はエレクトロポレーション、マイクロ粒子との衝撃、リポフェクション、および形質導入^4が含まれ^ています。注目すべきは、エレクトロポレーションは、すでに受精ホヤホヤの卵への外因性物質の導入のための標準的な技術、発達のメカニズム⁸の進化を研究するために使用される別の無脊椎動物脊索動物モデルとして確立されている。

成功したマイクロインジェクションおよび蛍光タンパク質のその後のin vivoイメージング、適切なのために発現ベクターは、必須の前提条件である。この目的に向けて、3種類のプラスミド（ 図1、補足ファイル1）が検証され、実験的に開発されており：CAAXボックス構造物：膜ターゲティングのために、eGFP遺伝子がヒトHRAS CAAXボックスにその3 '末端に融合させた（EGFP結果^）16と、核ターゲティングのため、EGFPおよびmCherryを遺伝子の両方が彼らの5で融合させた「H2Bでは、それぞれ、結果としてゼブラフィッシュヒストン2B（H2B）エクソン（に終わる：EGFPおよびH2B：mCherryを構築物^）17。これらの構築物の各々は、SV40後期ポリアデニル化部位およびインビトロキャップ化mRNA合成^18,19 に可能SP6プロモーターを含むPCS2 +プラスミド中にクローニングされている。さらに、Bに構築体の翻訳を最適化することを目標とlanceolatum、コザック配列及びコドンの両方は、単一ヌクレオチド突然変異誘発（ 表2および3、補足ファイル1）を使用して適応されている。 BAS中川^20、Bの小さなプールでアプローチ編lanceolatum遺伝子は、この種の好ましいKozak配列を同定するために分析した。この理論的な好ましい配列に最も近い既知の天然に存在する配列は、Bのものであるアクチン遺伝子をlanceolatum。 3種の構築物コザック配列は、従って、このアクチン遺伝子配列と一致するように改変した。また、Bのコドン使用頻度lanceolatumはBの使用率の低い確率で構築物におけるコドン使用頻度データベース²¹とコドンを用いて分析したlanceolatum（<10％）が高いの利用確率と同等のコドンにより、可能な限り、交換された。

注射の結果は、これらのベクターからのタンパク質発現のレベルは、 インビボ画像解析に適していることを示している。修飾されたベクターの発現出力は、未修飾のコンストラクトと比較していないことを考えると、我々は、CONができないコザックコンセンサスとコード配列に導入された修正の効率にclude。それは確かに、これらの変更が実際にタンパク質発現レベルに影響を与えるかどうかをテストするために興味深いものになるだろう。この線に沿って、最近の分析では、Bにマイクロインジェクションに基づくbelcheri、他の、非修飾ベクターはまたナメクジウオ¹⁵における蛍光タンパク質の産生のためのmRNAの合成に使用することができることを示唆している。

ナメクジウオは、内因性の緑色蛍光タンパク質^22が含まれています。胚は、そのための緑の低レベルだけでなく、赤色蛍光（私たちの未発表の観察）を示す。しかしながら、これらの内因性レベルは、当社のmRNA構築物の注入に起因する蛍光レベルに関して無視できる。したがって、ナメクジウオ胚の内因性蛍光、蛍光双眼鏡またはマルチレーザ走査型顕微鏡を用いて実験的観察を妨げない。加えて、注入実験は、mRNAの注射によって生成された外因性の蛍光の強度を直接噴射ミックスで使用されたmRNAの最終濃度と相関している注入物質の実際の量に依存することを明らかにした。B.実際のmRNAの濃度の独立した、いくつかのmRNAの組み合わせが少ないB.によって許容されるようであるがlanceolatum胚は、最高1.8μgの/μlのmRNAの濃度を許容する傾向がある他よりも胚をlanceolatum。したがって、核mCherryを、膜のeGFP mRNAの組合せは、単独で、核eGFPの注入よりも毒性があるように思われた。

テキサスレッドデキストランは、以前ナメクジウオ卵母^13-15に成功した注射用のトレーサーとして使用されている。興味深いことに、注入されたmRNAに由来する蛍光シグナルはテキサスレッドデキストランを含む溶液を注入し、この両方のナメクジウオ卵母細胞における（N = 4の実験）とzebrafi後に得られたことはなかったSH胚（n = 3の実験）。 mRNAおよびテキサスレッドデキストランインビトロ転写を含む注射ミックスをRNaseフリーアガロースゲル（ 図3、レーン2）にロードされると、mRNAに対応するバンドは存在しない。対照的に、in vitroで転写されたmRNAは、フェノールレッド（ 図3、レーン1）の存在下でのRNaseフリーのアガロースゲル上で検出可能である。ゲル上のmRNAの分解の証拠がないことを考えると、これらの結果は、テキサスレッドデキストラントラップmRNAに傾向があることを示唆している。注射液で使用する場合、テキサスレッドデキストランは、このように注入されたmRNAの翻訳を妨げる可能性があります。この観察に続いて、mRNAと他の染料との相互作用（FITCデキストラン、ローダミンデキストランおよびオレゴングリーンデキストラン）RNaseフリーアガロースゲル上及びB.への注入の両方によって、試験されたlanceolatumまたはゼブラフィッシュ（ 図3）。解析は、FITCデキストランゲル（ 図3、LAN上のトラップmRNAをしないことを示している電子4）および（n = 1の実験）ゼブラフィッシュにおける蛍光タンパク質の発現をもたらすではなく、Bの胚lanceolatum（n = 1の実験）（データは示さず）。ローダミンデキストランゲル（ 図3、レーン5）に基づいていないトラップmRNAを行い、ゼブラフィッシュ胚における蛍光タンパク質の発現を導く（n = 1の実験）（データは示していない）が、その活性は、残念ながらB.において試験することができなかったlanceolatum胚 。オレゴングリーンデキストランは、mRNA、mRNAのと同じレベルで移動する際、最終的に、アガロースゲル（ 図3、レーン3）により評価することができなかったトラッピング。この後者の色素はナメクジウオ（n = 1の実験）における蛍光タンパク質の発現を阻止したが、ゼブラフィッシュではない胚（n = 1の実験）（データは示さず）。要するに、これらのデータは、いくつかのデキストランを効率よく注入されたmRNAの翻訳を阻害することができることを示唆している。用量応答実験を実施しなかったことを考えると、これらのデータは、定性的である。興味深いことに、この阻害効果は、に依存するように思われるこの効果のメカニズムを理解するためのさらなる研究の必要性を強調して動物種（ナメクジウオ対ゼブラフィッシュ）、。デキストランは、注射用のカラートレーサーとして使用される場合にさらに、これらの結果は、予備分析のために呼び出す。

指定されたモデルのためのマイクロインジェクション技術の開発は、遺伝子特異的な操作のための扉を開きます。ナメクジウオでは、例えば、マイクロインジェクションの最初の説明は、（B. floridae中）モルホリノオリゴヌクレオチド注射^23,24を用いて、遺伝子、hox1の成功したノックダウンを行った。 Bの数首尾よくここで紹介するプロトコルを使用して、毎日注射することができるlanceolatum胚は、研究のこのタイプの確かに互換性があります。さらに、これらの方法および手元の小説構築物で、1は今も設計することができ、ネイティブ関心のmRNAの（またはドミナントNEGの注入によって過剰発現とノックダウン研究を行うativeフォーム）または例のマイクロRNAまたはshRNAベースの戦略のための遺伝子発現を破壊するための他の戦略（）を使用します。これまで、ナメクジウオ注射はこれだけ効率的に固定化することができる唯一の​​ステージであるという理由だけで、卵母細胞の段階で実施することができる。卵母細胞段階での注入の後、目的の分子は遍在胚で発現される。遺伝子発現が改変または細胞のサブセットにおいてのみ監視する必要がある場合、これらは現像ナメクジウオ胚^15,25-27にモザイク状に表現されるようにこのように、DNA構築物は、注射される必要がある。 DNA構築物の注射はまたモザイク発現^15,25-27の前述の欠点を、一過性トランスジェニックアッセイにおけるナメクジウオ開発中の調節領域の活性を試験するために使用することができる。

最終的には、ナメクジウオのマイクロインジェクション技術は、特定の遺伝子座を標的ノックアウトまたはノックインを含む安定した遺伝子導入のための扉を開きます。システム外来性DNAを安定に挿入するためのsはすでに昆虫や羊膜脊椎動物²⁸の両方で機能するようで、魚のトランスポゾンTol2のシステムと、たとえば、存在する。さらに、修飾ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）または転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）またはRNA誘導ゲノム編集ツールに基づいて（CRISPR / CASシステム）は、点突然変異を生成し、ノックイン特定における修飾するために使用可能なアプローチゲノム²⁹の地域。これらの努力はすでにBに設定されている飼育下におけるナメクジウオの通年の繁殖を、必要になります^11,30とB. belcheri ^30,31 吸虫 、現在A.のために開発されているlucayanum、B. floridaeと、ここで紹介さナメクジウオ種、B。 lanceolatum ^32。

The authors have nothing to disclose.

著者は、畜産のための「Animalerieサントラルドゥジフ=シュル=イヴェット」による支援を承認したいと思います。この作品は、欧州連合（EU）FP6助成」Embryomics」によってANR助成金」により、マイケル·シューベルトのANR（ANR-09-BLAN-0262から02とANR-11-JSV2-002-01）からの資金によってサポートされていましたANR-ジャン=フランソワ·ニコラとナディーンPeyriérasに10-BLAN-121801のDev-プロセス」。ジョアン·エマニュエルカルバリョは、FCTの博士フェローシップ（SFRH / BD / 2012分の86878）によって賄われている。

ここに記載されたベクターのリクエストは、著者に直接対処することができる。