التعبير عن البروتينات الفلورية في

نحن التقرير هنا التعبير القوي والفعال للالبروتينات الفلورية بعد حقن مرنا في البويضات غير المخصبة من السهيم. فإن تطوير تقنية حقن مكروي في هذا حبلي القاعدية يمهد الطريق لبعيدة المدى الابتكارات التقنية في هذا النظام النموذجي الناشئة، بما في ذلك في مجال التصوير فيفو والتلاعب الجينات المحددة.

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

خلال التنمية، خلية واحدة يثير كائن حي كامل في عملية معقدة للغاية التي تنطوي على كل من الانقسامات والحركات الخلية. من أجل فهم أفضل للمبادئ البيولوجية الكامنة وراء ديناميات سلوك الخلية، والتي علماء البيولوجيا التطورية، لاستخدامها في تقنيات التصوير المجراة على أساس مضان. مقصورات محددة من الخلايا، مثل أغشية الخلايا، يمكن أن تكون إما وصفت من قبل العلاج مع الأصباغ الفلورية، وهو نهج يعوقها عدم وجود خصوصية واختراق الأنسجة ^1، أو من خلال إدخال محدد في جنين من mRNAs الخارجية ترميز البروتينات الفلورية ^2. تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لإيصال الفعال للمركبات خارجية، مثل من mRNAs. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، حقن مكروي، Electroporation للوالقصف مع المجهرية الدقيقة، lipofection والتنبيغ ^3،4. على الرغم من كل هذه الأساليب يمكن أن تستخدم لإدخال مركبات خارجية إلىوضع الجنين، حقن مكروي فقط يسمح تطبيق كميات محددة سلفا ودقيقة في كل خلية ^3. وقد وصفت تقنيات Microinjection لجميع أنظمة النموذج التنموي الكبرى ⁴ (على سبيل المثال، ذباب الفاكهة والديدان الخيطية، الزرد، والضفادع، والفئران)، وكذلك لبعض نماذج بديلة ^4، بما في ذلك تلك المستخدمة في الدراسات المقارنة التي تهدف إلى فهم تطور آليات التنموية (على سبيل المثال، شقائق البحر والديدان الحلقيات قنافذ البحر، الزقيات ascidian، والحسيكة رأس حبليات).

Cephalochordates، الذي جنبا إلى جنب مع الزقيات والفقاريات إنشاء بعائلة حبلي، بشكل خاص نماذج مناسبة تماما لدراسة تطور الحبليات وتنويع الفقاريات من سلف اللافقاريات ^5-8. نسب رأس حبليات تباينت في وقت مبكر جدا أثناء التطور حبلي. وcephalochordates موجودة، والتي تنقسم إلى ثلاثة أجناس (النخالةchiostoma، Asymmetron وEpigonichthys)، تشبه الفقاريات سواء من حيث التشريح العام والهندسة المعمارية الجينوم ^5-8. من حوالي 30 نوعا من cephalochordates التي تم وصفها حتى الآن، خمسة المتاحة للدراسات الجنينى والتنموية ^6،9: Asymmetron lucayanum (والرميح حيوان باهاما)، الحسيكة floridae (والحسيكة فلوريدا)، السهيم (والحسيكة الأوروبية)، الحسيكة belcheri (والحسيكة الصينية) والحسيكة البلهارسيات اليابانية (للالحسيكة اليابانية). الكبار قد حان لثلاثة من هذه الأنواع (B. السنانية، B. belcheri وB. البلهارسيات اليابانية) يمكن أن يتسبب لتفرخ على الطلب خلال موسم التكاثر ^10،11. وبالإضافة إلى ذلك، على الأقل بالنسبة B. السنانية، وضع البيض كفاءة ويمكن أيضا أن يتسبب في مياه البحر الاصطناعي ^12، مما يجعل هذا النوع رأس حبليات معينة يمكن الوصول إليها عن المختبرالمنشأ التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى مياه البحر الطبيعي. الجمع، في B. السنانية، لسهولة الوصول وموثوق بها إلى الأجنة مع طريقة التسليم كفاءة، مثل حقن مكروي، حتى الآن هذه التقنية تسليم الوحيدة المتقدمة في الحسيكة (في كل B. floridae وB. belcheri) ^13-15، سيمكن من تطوير جناح رواية تقنيات التلاعب، بما في ذلك tracing- النسب والنهج القائم على سلوك الخلية الحيوية.

بروتوكول للحقن مكروي كفاءة من mRNAs للتعبير عن البروتينات الفلورية في B. وبالتالي وضعت السنانية الجنين. وعلاوة على ذلك، لتوفير مجموعة أدوات أساسية للتصوير حي لB. الأجنة السنانية، تم تطوير أنظمة النواقل التي تسمح المرتبط الغشاء والتعبير النووي من البروتينات الفلورية. لاستهداف الغشاء، وتنصهر تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) إلى HRAS مربع CAAX البشري وتوطين النووية من mCherry وEGFP كانالتي حصلت عليها الانصهار إلى الزرد هيستون 2B (H2B) اكسون (الشكل 1، الملف التكميلي 1). وعلاوة على ذلك، وذلك بهدف تحسين الترجمة البروتين، تم تعديل تسلسل كوزاك وكودونات من يبني وتكييفها مع الاستخدام في B. السنانية. أخذت معا، فإن طريقة الحقن والتعبير ناقلات المقدمة هنا بمثابة الأساس لجيل من النهج التجريبية الجديدة للcephalochordates، ولا سيما التحليلات باستخدام المستندة إلى مضان أحدث تقنيات التصوير في الجسم الحي.

1. إعداد أدوات والكواشف

1. نقل الماصات باستور
   1. توليد سلسلة من الماصات نقل باستور بأقطار مختلفة غيض من خلال سحب 230 ملم الماصات باستور طويلة فوق لهب بسرعات مختلفة. تأكد من أن تفتق طويل ممكن، من أجل السيطرة على نحو سلس وغرامة من الطموح.
   2. مع الكاتب الماس، وخدش ماصة على طول خط عمودي على طول ماصة. بكلتا يديه، وسحب بالتوازي ماصة لطوله لتوليد قطع حادة. بسرعة اللهب البولندية ماصة دون ختم الحافة.
   3. تختلف القطر من طرف مع مرحلة البويضات / الأجنة إلى أن pipetted: 300-400 ميكرون لالبويضات غير المخصبة (حوالي 150 ميكرون في القطر)، 600 ميكرون لالبويضات المخصبة (حوالي 500 ميكرون في القطر)، 200-400 ميكرون لneurulae تحاك. استخدام ماصات مع أنبوب الطموح الذي يرصده الفم لنقل البويضات / الأجنة من طبق واحدإلى آخر.
2. الإبر حقن
   1. التلاعب في الشعيرات الدموية مع قفازات لضمان ظروف خالية من ريبونوكلياز. استخدام الزجاج البورسليكات مع خيوط الشعيرات الدموية مع أبعاد OD 1.20 ملم، ID 0.94 ملم، وطول 10 مم.
   2. إذا تم سحب الشعيرات الدموية على نوع من التدفئة خيوط إبرة مجتذب موضح في قائمة المواد، استخدام الإعدادات التالية: حرارة 600، سحب 50، سرعة 80، الوقت 60، الضغط 200 أو 300. وإلا، تأكد من أن الشكل، الذي هو حاسمة لحقن ناجحة، كما هو مبين في الشكل رقم 2 مع الخصائص التالية: 4-8 ميكرون قطر الحافة الخارجي، 2 سم طول تفتق.
      ملاحظة: يمكن سحب الإبر قبل موسم وضع البيض وتستخدم طوال الموسم.
3. 5٪ محلول المخزون الفينول الأحمر (4X)
   1. إعداد جديدة قبل كل موسم وضع البيض.
   2. في أنبوب 0.22 ميكرون الترشيح، وتزن من 25 ملغ من الفينول مسحوق أحمر.
   3. إضافة 0.5 مل من DNase- وريبونوكلياز خالية من المياه لالأنبوب الذي يحتوي على مسحوق.
   4. تدور لمدة 3-5 دقائق عند 18،000 x ج في درجة حرارة الغرفة لتصفية تعقيم الحل وإزالة البلورات التي يمكن أن تسد إبرة الحقن.
   5. تخزينها في 4 ° C أو تخزين 250 مكل في -20 ° C.
4. 0.25 ملغ حل بولي يسين / مل
   1. إعداد جديدة قبل كل موسم وضع البيض.
   2. حل 5 ملغ من بولي-L-يسين في 20 مل من الماء المقطر. مخزن 5 مل aliquots في -20 ° C.
   3. استخدام قسامة مطلق فورا ومرة ​​واحدة فقط لضمان التصاق استنساخه وقوية من البويضات إلى الطبق المغلفة بولي يسين.
5. التوليف مرنا
   1. إعداد جديدة قبل كل موسم وضع البيض.
   2. خطي 5 ميكروغرام من الحمض النووي في المصالح مع انزيم الكافي (عادة لمدة 2 ساعة، عند 37 درجة مئوية). للتحقق من اكتمال عملية الهضم، تشغيل 2٪ في حجم المزيج الهضم على 1٪ الاغاروز-TBE هلام العازلة في TBE في 150 W لمدة 20 دقيقة.
   3. استخراج الخطDNA rized بين 25: 24: 1 الفينول (درجة الحموضة 8.0): الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي. دوامة لمدة 20 ثانية، الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع (العليا) المرحلة المائية.
   4. استخراج المرحلة المائية ثانية مع 24: 1 الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي. دوامة لمدة 20 ثانية، الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع المرحلة المائية.
   5. ترسيب الحمض النووي خطي مع 100: 10: 300 DNA خطي: ​​3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2): الإيثانول بنسبة 100٪ بين عشية وضحاها في -20 ° C.
   6. الطرد المركزي 20 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. شطف في 70٪ من الإيثانول.
   7. الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. اسمحوا الجافة وresuspend في ريبونوكلياز خالية من المياه في تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
   8. نسخ 1 ميكروغرام من الحمض النووي خطي باستخدام عدة التوليف مرنا مع البلمرة المناسب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   9. استخراج مرنا مع 5: 1 الفينول (درجة الحموضة 4.7): الكلوروفورم وخلات الأمونيوم الحل محطة وقدمت مع عدة.
   10. دوامة لمدة 20 ثانية، ومntrifuge 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع المرحلة المائية.
   11. استخراج المرحلة المائية ثانية مع 24: 1 الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي. دوامة لمدة 20 ثانية، الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع المرحلة المائية.
   12. ترسيب مرنا مع 100٪ الأيزوبروبانول بين عشية وضحاها في -20 ° C.
   13. الطرد المركزي 20 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. شطف في 80٪ من الإيثانول.
   14. الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. السماح للبيليه الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد 5-10 دقيقة لأنها سوف تكون بعد ذلك من الصعب ل resuspend. resuspend في DNase- وريبونوكلياز خالية من المياه إلى التركيز النهائي لا يقل عن 2 ميكروغرام / ميكرولتر لضمان تركيز مرنا النهائي لائق في مزيج الحقن.
   15. للتحقق من الجودة وحجم المنتج النسخ، وتشغيل 0.5 ميكرولتر من مرنا على 1٪ الاغاروز-TBE هلام خالية من ريبونوكلياز العازلة في TBE في 150 W لمدة 20 دقيقة. متجر 2 مكل في -80 ° C.
6. أطباق المغلفة بولي يسين-
   ملاحظة: بولي يسين الصوتستخدم أطباق تيد لشل حركة البويضات أثناء الحقن.
   1. لكل 35 مم خلية ثقافة طبق بتري (5 في المجموع)، وتغطي الجزء السفلي من طبق بيتري مع 1 مل من 0.25 ملغ / مل حل بولي يسين إذابة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   2. لكل 35 مم خلية ثقافة طبق بتري (5 في المجموع)، ونقل 0.25 ملغ / مل حل بولي يسين إلى 35 مم خلية ثقافة طبق بتري آخر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. تجاهل 0.25 ملغ / مل حل بولي يسين.
   4. السماح للأطباق بتري الجاف، رأسا على عقب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
   5. تخزين الأطباق المغلفة بولي يسين ملفوفة في غلاف بلاستيكي في 4 درجات مئوية لتجنب التلوث لأقصى مدة أسبوع واحد.
7. أطباق المغلفة الاغاروز
   ملاحظة: يتم استخدامها لثقافة حقن الأجنة. يوفر الاغاروز وسادة للأجنة حقن ويمنعها من الالتصاق إلى أسفل الطبق.
   1. جعل مياه البحر الاصطناعي (ASW) باستخدام 37-38 ز / L بالاتصالاتالأملاح ercial + 0.25 ملي NaHCO ₃ في المياه بالتناضح العكسي.
   2. حل الاغاروز إلى تركيز 1٪ في 0.22 ASW تصفيتها ميكرون عن طريق تسخين الحل في الميكروويف.
   3. صب بسرعة الحل الاغاروز حارا من واحد 35 مم طبق بتري إلى واحد آخر من أجل ضمان طلاء الاغاروز رقيقة جدا من الطبق.
   4. تخزين الأطباق المغلفة الاغاروز ملفوفة في التفاف ساران في 4 درجات مئوية لتجنب التلوث لأقصى مدة أسبوع واحد.
8. مزيج الحقن وتحميل الإبر حقن
   1. حوالي 2 ساعة قبل بدء الحقن، وجعل مزيج حقن 2 ميكرولتر في RNase- والمياه خالية من الدناز مع تركيزات النهائي من 1-1،8 ميكروغرام / ميكرولتر من مرنا، و 15٪ الجلسرين، 1.25٪ الفينول الأحمر.
      ملاحظة: الألوان الفينول الأحمر الحل، والذي يسمح رصد كفاءة الحقن وتحديد الأجنة المحقونة بنجاح. الجلسرين تفضل مرنا نشر داخل البويضة.
   2. الطرد المركزي 4 دقائق عند 18،000 x ج لبلورات بيليه. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
   3. مع ماصة 10 ميكرولتر، وجمع 0.5 ميكرولتر من مزيج الحقن، وتجنب أسفل الأنبوب، حيث تم مكعبات البلورات.
   4. الردم اثنين على الاقل من الإبر حقن (في حالة فواصل واحدة خلال حقن) من قبل pipetting انخفاض 0.5 ميكرولتر من حقن مزيج في افتتاح كبير من الإبرة.
   5. تثبيت الإبر في وعاء تخزين مع السائل في الجزء السفلي في 4 درجات مئوية لمنع التبخر من مزيج الحقن. السماح للمزيج حقن السفر ببطء إلى غيض من إبرة الحقن لا يقل عن 1 ساعة لتقليل خلق فقاعات.
   6. متجر مزيج حقن إضافية في -80 درجة مئوية لمدة أقصاها ثلاثة استخدامات إضافية، وبعد ذلك تدهور نوعية مرنا (لا تظهر البيانات).

2. جمع المواد البيولوجية، حقن مكروي والثقافة الأجنة

1. البويضة والحيوانات المنوية جمع
   ملاحظة: انظر Theodosiouوآخرون. ⁽¹²⁾ لبروتوكول مفصلة لإحداث التبويض وجمع الأمشاج.
   1. الذكور والإناث في صدمة مضادة للغواصات في 23 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   2. واحدة إلى ساعتين قبل غروب الشمس، ونقل البالغين في أكواب فردية في ASW في 19 ° C لأن معظم البالغين سوف تفرخ 1-2 ساعة بعد غروب الشمس.
   3. شطف 35 مم أطباق بتري في ASW تصفيتها والسماح لهم الجافة رأسا على عقب لمنع البويضات من الالتصاق إلى أسفل الطبق.
   4. على وضع البيض، وجمع الحيوانات المنوية والبويضات على الفور مع ماصة 1،000 ميكرولتر.
      1. إبقاء الحيوانات المنوية والبويضات منفصلة عن الحسيكة الكبار لأن الاتصال هو ضار للصحة الأمشاج (لا تظهر البيانات).
      2. وعلاوة على ذلك، وتجنب مذهلة من البالغين و الذي يؤدي إلى الحركات التي تبدد، وبالتالي تمييع، سواء الحيوانات المنوية والبويضات. للحفاظ على الحيوانات المنوية النشطة لأطول فترة ممكنة وتحسين معدل الإخصاب، وجمع الحيوانات المنوية كما تتركز ممكن.
   5. احتفظالحيوانات المنوية على الجليد في أنبوب 1.5 مل.
   6. نقل البويضات في تصفيتها ASW إلى 35 مم أطباق تشطف قبل بيتري.
   7. نقل 100-500 البويضات مع سبق سحبت 300-400 ميكرون نقل ماصة باستير إلى 35 مم طبق بتري آخر لإجراء الحقن.
   8. تسميد تبقى من مخلب كعنصر تحكم عن الحيوانات المنوية ونوعية بويضة أو لتجارب أخرى.
2. حقن بويضة
   1. تثبيت إبرة الحقن على مياداة مجهرية عند 50 درجة زاوية قريب إلى المستوى الأفقي.
      ملاحظة: سوف الزوايا أقل من 50 درجة تدفع البويضات حول على طبق، في حين أن زوايا أكثر من 50 درجة لا تسمح للرصد الملائم للموقف إبرة نسبة إلى البويضة.
   2. تحت نطاق الفلورسنت تشريح مع 25X oculars، ونقل 30 البويضات مع 300-400 ميكرون نقل ماصة باستير على طبق المغلفة بولي يسين التي تحتوي على تصفيتها ASW.
   3. إيداع البويضات على طول خط لنقلالحقن خارج بطريقة مرتبة وللتمييز حقن البويضات من غير حقنه. ضخ أعداد صغيرة (30 البويضات) لتقليل الوقت تعرض البويضات لبولي، ليسين، والتي تميل إلى تشوه الأجنة النامية (لا تظهر البيانات).
   4. استخدام الإضاءة الحقل المظلمة لتقديم البويضات كما شفافة قدر الإمكان.
   5. مع مقبض حركة الخشنة من مياداة مجهرية، وجلب إبرة الحقن قريبة من بويضة.
   6. مع ملقط غرامة، وقطع فتح إبرة على مستوى حيث يبدأ تلميح إلى أن منحني. بواسطة النبض مع حاقن، تحقق من مزيج حقن الأحمر يتدفق في الواقع للخروج من الإبرة.
   7. في 200X التكبير ومع مقبض حركة غرامة من مياداة مجهرية، نقل بلطف إبرة الحقن داخل نواة البويضة.
      ملاحظة: في حالة إدخالها بشكل سطحي جدا، لن يبقى الحل حقنه داخل البويضة. في حالة إدخالها بعيدا جدا، وسيتم تدمير البويضة.
   8. حقن مع 1-3 نبضات من 120 درة ميللي ثانيةأيون والضغط 1-10 رطل. إذا كانت إبرة على ما يرام بما فيه الكفاية، حقن مع التدفق المستمر في الضغط المستمر. تأكد من أن حجم الحقن يتوافق مع 1/5 إلى 1/3 من حجم بويضة واحدة.
   9. بعد الحقن، وسحب الإبرة خارج بسرعة لتجنب تسرب البويضة.
   10. تحقق من أن حل حقن يبقى داخل البويضة وذلك بعد قليل من ثانية، فإن الحل حقن ينتشر في جميع أنحاء بويضة.
   11. الانتقال إلى البويضة في الخط القادم.
   12. الابقاء على بعض الأجنة uninjected كل سلسلة كما سيطرة سلبية لتقدير مضان الخلفية عند مسح لحقن الأجنة.
3. الإخصاب، واختيار الأجنة المحقونة والثقافة الجنين
   1. إخصاب البويضات في أقرب وقت تم حقن سلسلة. حيث تنخفض جودة البويضة مع مرور الوقت، وحقن تخصيب البويضات في حدود 1 ساعة بعد وضع البيض ^12.
   2. اعتمادا على تركيز الحيوانات المنوية، إضافة 1-5 قطرات من الحيوانات المنوية إلى البويضات ودوامة الطبق.
      ملاحظة: يجب أن تصبح المغلف الإخصاب واضح على الأجنة بعد حوالي 1 دقيقة.
   3. السماح للأجنة لفصل من الطبق المغلفة بولي، ليسين، في حين حقن سلسلة أخرى من البويضات.
   4. نقل الأجنة مع ميكرون نقل ماصة باستير 600 إلى طبق بتري المغلفة الاغاروز. إزالة الأجنة من الطبق المغلفة بولي يسين في أقرب وقت ممكن، إذا كان ذلك ممكنا قبل مرحلة 2-الخلية.
      ملاحظة: في حالة التعرض لفترات طويلة للبولي يسين، الأجنة تميل الى ان تصبح الأريمات المزدحمة بالسكان، بالارض على الجانب لمس قاع الطبق.
   5. في 2-الخلية إلى 4 خلايا المرحلة، حدد مع نطاق الفلورسنت تشريح مع فلتر DSR الأجنة حقن بنجاح، أي تلك مع التشكل الطبيعي أن تظهر حمراء إشارة الفلورسنت الفينول الأحمر مشتقة.
   6. الحفاظ على الأجنة في الثقافة في تصفيتها ASW في أطباق بتري المغلفة الاغاروز في 19 ° C حتى المرحلة المرغوبة لفي مجال التصوير فيفو.

بروتوكول المفصلة أعلاه يوفر الأساس لMicroinjection من B. البويضات السنانية، وبالتالي لإدخال في تطوير B. الأجنة السنانية مرنا ترميز البروتينات الفلورية للتصوير في الجسم الحي. على الرغم من أن الأسلوب هو قوية وموثوق بها بالتأكيد، فإن معدل الحقن ناجحة باستخدام هذا البروتوكول يبقى متغير (الجدول 1). التفسير المحتمل جدا لهذه الحقيقة مثيرة للاهتمام هو التباين الشديد من براثن بويضة: البيضة دفعات مختلفة لا بل تتصرف بشكل مختلف جدا، عندما تتعرض لضغط الحقن. بعض البويضات هي مرنة نوعا ما، وتميل إلى تتسطح في الجزء السفلي من الطبق، والبعض الآخر قاسية جدا، ويبقى الدور على الحقن. وعلاوة على ذلك، فإن بعض دفعات بويضة تميل إلى تضخيم الأغشية المشيمه سفرهم لدى وحقن، والبعض الآخر ببساطة ليز (لا تظهر البيانات). ويمكن إنشاء أي ارتباط واضح بين السلوك بويضة على الحقن والجنينيةالتنمية بعد الإخصاب. وبالتالي فمن الصعب توقع أي فئة من البويضات هو الانسب ل microinjection. ولكن بعد الإخصاب والأجنة تمر التطور الطبيعي يمكن التعرف في وقت مبكر من مراحل الانقسام: 2-الخلية إلى 4 خلايا الأجنة المرحلة يمكن اعتبار الطبيعة عندما سطح التماس بين عن Blastomeres صغير، في حين أن المضغوط الجنين مرحلة الانقسام، حيث الخلايا الفردية يصعب تمييز، هو بالتأكيد غير طبيعي.

في أيدينا، ما يقرب من نصف البويضات لا تنجو من الصدمة الناتجة عن الحقن وحوالي نصف الأجنة التي لا تنجو من المعرض حقن تسمية الفلورسنت محددة. وبالتالي، فإننا نقدر أن مع هذا البروتوكول الحقن، ما بين 50 و 120 الأجنة يمكن حقن بنجاح على إعطاء يوم التبويض الغلة بين 15 و 60 الأجنة المسمى.

مضان أحمر من الفينول الأحمر في 2-الخلية إلى 4 خلايا الأجنة المرحلة موثوق جدا يصادف الأجنة التي لديهاتم حقنها بشكل صحيح، إلى 100٪ من الأجنة المختارة في هذه الطريقة تنتج لاحقا البروتينات الفلورية المشفرة بواسطة حقن مرنا. بالإضافة إلى ذلك، هناك علاقة إيجابية واضحة جدا بين شدة مضان أحمر الفينول في 2-الخلية إلى 4 خلايا مرحلة ووقت بداية مضان التي تنتجها البروتينات المشفرة بواسطة حقن مرنا. وبالتالي هذه العلاقة يسمح بتحديد تلك الأجنة التي حصلت على أعلى كمية من مرنا أثناء عملية الحقن.

إذا لم يتم الكشف عن إشارة من البروتين الفلوري المشفرة بواسطة حقن مرنا بعد اختيار الأجنة الفينول الأحمر إيجابية، ونحن نوصي لتشغيل مزيج الحقن على هلام خالية من ريبونوكلياز من أجل التحقق من وجود تدهور مرنا أو محاصرة (الشكل 3) . في حارة 1، تم الكشف عن عصابة مرنا سليمة. حقن هذا المزيج أدى إلى إشارة الفلورسنت قوية في الجنين. على العكس من ذلك، في حارة 2 والتي تتطابق مع تجربة اخرىر حيث تم استبدال الفينول الأحمر مع ديكستران صبغ في مزيج (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل)، ويبدو مرنا قد حوصروا بسبب الصبغة ديكستران وحقن هذا المزيج بقيادة أبدا إلى إشارة الفلورسنت في الجنين.

باستخدام هذه التقنية حقن مكروي ويبني لدينا (الجداول 2 و 3، ملف التكميلي 1) (انظر المناقشة)، يمكننا بالتالي تنتج بتكاثر وضع العلامات الفلورية متجانسة في جميع أنحاء الجنين مع mCherry أو EGFP في النواة ومع EGFP في الغشاء (الشكل 4) . بروتوكول التصوير استخدامها لتوليد سيتم وصفها الشكل 4 في مكان آخر (فور وآخرون، حاليا قيد الإعداد). اعتمادا على كمية من مرنا حقن، فلوري التعبير البروتين عادة ما يصبح اكتشافها بين 16 خلية (الشكل 4A) ومراحل 64 خلية ويبقى للكشف على الأقل حتى المرحلة العصيبة الراحل (لا تظهر البيانات). لم يتم اختبارها مراحل لاحقة. إشارة النوويةوعادة ما يظهر في وقت سابق من إشارة الغشاء، ويحتمل بسبب طبيعة منتشر في جوهرها للغشاء بالمقارنة مع طبيعة المدمجة للنواة (لا تظهر البيانات). على الرغم من عدم رصدها بشكل منهجي والأجنة حقن مع كل من الطاقة النووية وتسمية غشاء يبدو أن أقل صحية من الأجنة حقن حصريا مع تسمية EGFP النووية. يثير الاهتمام والفضول، ويبدو هذا التأثير أن تكون مستقلة عن المبلغ الإجمالي للمرنا حقن باعتباره المبلغ الإجمالي للحقن مرنا هو نفسه، سواء كان يتم تضمين واحد أو اثنين من الأنواع مرنا إلى مزيج (لا تظهر البيانات).

الشكل 1: بناء مزيد من التفاصيل. اسكتشات من (A) للغشاء استهدفت EGFP (EGFP: مربع CAAX)، (B) الحائزة للاستهداف EGFP (H2B: EGFP) و (C) الحائزة للاستهداف mCherry (H2B: mCherry) يبني عالبريد أظهرت.

الشكل 2: شكل حقن إبرة التمثيلية. (A) وتفتق حوالي 2 سم في الطول ومنحنيات إبرة في طرف. شريط مقياس = 2 مم. (ب) التكبير من المنطقة محاصر في A. موقف لقطة الإبرة (السهم) في منحنى الإبرة. يشار إلى رأس الإبرة من قبل رأس السهم. مقياس شريط = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: تفاعلات مرنا والأصباغ الفلورية المختارة (A) نتيجة للهجرة من مزيج يحتوي على مرنا والفينول الأحمر في حارة 1 ومن مرنا وتكساس الأحمر ديكستران (في تركيز النهائي من 3.3 ملغ / مل) في حارة 2. (B) نتيجة للهجرة من مزيج يحتوي على مرنا وأوريغون الخضراء ديكستران (في تركيز النهائي من 3.3 ملغ / مل) في حارة 3 من مرنا وFITC ديكستران (في تركيز النهائي من 3.3 ملغ / مل) في حارة 4 ومرنا ورودامين ديكستران (في تركيز النهائي من 3.3 ملغ / مل) في حارة 5. جل الوقت الهجرة في ألف وباء كان مختلفة. من أجل الوضوح، المستطيل الأسود في أقنعة لانعكاس الضوء والخطوط المتقطعة ترسم ممرات الهجرة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تقديم 3D (أميرة البرمجيات) من الأجنة الحسيكة حقنوا من mRNAs لشيفرة البروتينات الفلورية الصور هي.المستخرجة من 3D-إنقضاء زمن المكتسبة على الأمثل لايكا SP5 2 الفوتون الليزر المسح الضوئي المجهر مرحلة (A) 16 خلايا الجنين يعبرون عن H2B النووي:.. EGFP (B) المعيدة مرحلة الجنين معربا عن H2B النووي: mCherry واستهدفت غشاء- EGFP: مربع CAAX (C) المعيدة مرحلة الجنين معربا عن H2B النووي: mCherry وEGFP المستهدفة للغشاء: مربع CAAX. ويبين القسم البصرية الخلايا الداخلية مع mCherry النووي وإشارات EGFP المرتبط الغشاء. = شريط نطاق 50 ميكرون.

يشار إلى معدلات نجاح الحقن ويبني حقن، وعدد من الأجنة المحقونة التي نجت من الحقن وعدد المسمى (أو بنجاح حقن) الأجنة، كما هو النسبة الإجمالية للحقن ناجحة: الجدول 1.

يشار الأمثل المؤقت للتسلسل كوزاك الأصلي وتسلسل كوزاك تحور لكل بناء: الجدول 2. الطفرات أدخلت على التعافي تسلسل كوزاك من B. السنانية الأكتين الجين، الذي يشبه بشكل وثيق جدا أن من الاستدلال النظري فضل تسلسل كوزاك من الحسيكة (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).

الجدول 3: الأمثل المؤقت من استخدام كودون. يشار إلى كودونات الأصلية ومتحولة لكل بناء. في حين أن هذا لم يتم اختباره تجريبيا، وmutati قدموتهدف إضافات لتحسين الترجمة مرنا في الحسيكة.

الملف التكميلي 1: بناء تسلسل تسلسل النوكليوتيدات من (A) للغشاء استهدفت EGFP. (EGFP: مربع CAAX)، (B) الحائزة للاستهداف EGFP (H2B: EGFP) و (C) في mCherry المستهدفة النووي (H2B يتم إعطاء mCherry) يبني في سياق pCS2 + ناقلات العمود الفقري:. يشار إلى المجالات الرئيسية المشفرة بواسطة كل من يبني في اللون: EGFP (الأخضر)، mCherry (أحمر)، غشاء إشارة التعريب من HRAS (مربع CAAX) البشري (السماوي الأزرق)، الزرد اكسون هيستون 2B (H2B) (أصفر).

في هذه المقالة، نقدم، لأول مرة، بروتوكول مفصلة وقابلة للتكرار لحقن B. البويضات السنانية، والتي، بعد B. floridae ^13،14 وB. belcheri ^15، وبالتالي الأنواع الحسيكة الثالثة، والتي وصفت هذه التقنية. الأهم من ذلك، وصف بروتوكول هنا يشمل أيضا وصفا للأنظمة ناقلات مناسبة لإنتاج البروتينات الفلورية في B. السنانية من مرنا حقن المنتجة في المختبر (موضح أدناه). معا، وهذه الأدوات الجديدة تسمح في التصوير المجراة من التنمية في وقت مبكر من الحسيكة وتحليل سلوكيات الخلية الحيوية التي تكمن وراء أقرب أحداث التخلق في الجنين، مثل الانقسام وتكون المعيدة.

بشكل عام، تقنية حقن مكروي لديها مصلحة السماح للتسليم، في خلية الهدف، وحدة تخزين محددة مسبقا من مركب معين. مع هذا يجري الصورةالمساعدات والحد رئيسي واحد من هذه التقنية هو عدد محدود من الخلايا التي يمكن حقنها خلال تجربة معينة. على سبيل المثال، وصفت بروتوكول هنا لB. السنانية يسمح للحقن 100 إلى 120 بيضة في كل دورة الحقن، والتي سوف يكون المسمى حوالي نصف (الجدول 3). لB. floridae، أرقام متشابهة جدا مع 500 أو أكثر من البيض التي يمكن حقنها يوميا، منها أكثر من 50٪ سوف البقاء على قيد الحياة حقن ^13،14. بينما البروتوكولات لحقن B. السنانية وB. البيض floridae تشبه بعضها البعض، وB. تقنية belcheri مختلفة قليلا: يتم وضع البيض على المغلفة بولي يسين coverslips ويتم تنفيذ الحقن تحت مجهر مقلوب باستخدام microinjector من علامة تجارية مختلفة. يبدو أن هذا النهج يتيح ضخ ما بين 200 و 300 B. البيض belcheri في كل دورة حقن مع معدل البقاء على قيد الحياة، بعد الفقس في المرحلة العصيبة، سو 89.39٪ إلى 95.83٪ ^15. وبالنظر إلى الاختلافات في البروتوكولات، فمن الصعب معرفة ما إذا كانت الفروق في معدلات النجاح ومن المقرر ان الخلافات المتعلقة الأنواع أو المتعلقة البروتوكول. فلا يملك المرء إلا لاختبار أنواع مختلفة بالتوازي مع بروتوكولات مختلفة للإجابة على هذا السؤال. ومع ذلك، من أجل زيادة عدد البويضات المستهدفة لإيصال مركبات خارجية، وغيرها من البروتوكولات لا بد من تطويرها لالحسيكة. وتشمل تقنيات مرشح Electroporation للوالقصف مع المجهرية الدقيقة، lipofection، والتنبيغ ^4. من المذكرة، وقد تم بالفعل إنشاء Electroporation للكأسلوب القياسية لإدخال المواد الخارجية إلى المخصبة البيض ascidian الغلالة، نموذج حبلي اللافقاريات أخرى تستخدم لدراسة تطور آليات تنموية ^8.

ل microinjection ناجحة واللاحق التصوير في الجسم الحي من البروتينات الفلورية، ومناسبةناقلات التعبير هي شرط أساسي إلزامي. تحقيقا لهذه الغاية، تم وضع ثلاثة البلازميدات والتحقق من صحة تجريبيا (الشكل 1، التكميلي ملف 1): لاستهداف الغشاء، وتنصهر الجين EGFP في دورته "نهاية 3 إلى مربع HRAS CAAX البشري (مما أدى إلى EGFP: مربع بناء CAAX ) ^16، وبالنسبة لاستهداف النووي، وتنصهر كل من EGFP والجينات mCherry في اجتماعهم 5 "ينتهي إلى الزرد هيستون 2B (H2B) اكسون (الناتجة عن ذلك، على التوالي، في H2B: EGFP وH2B: بناء mCherry) ^17. كل واحد من هذه التركيبات تم المستنسخة في pCS2 + بلازميد يحتوي على SV40 الموقع أواخر تذييل بعديد الأدينيلات والمروج SP6 السماح في المختبر توج توليف مرنا ^18،19. وعلاوة على ذلك، وذلك بهدف تحسين الترجمة من البناءات في B. السنانية، وقد تم تكييف كل من متواليات كوزاك وكودونات باستخدام النوكليوتيدات الطفرات واحدة (الجداول 2 و 3، ملف التكميلي 1). بسإد على النهج ناكاجاوا ^20، مجموعة صغيرة من B. تم تحليل الجينات السنانية لتحديد تسلسل كوزاك يفضل في هذا النوع. أقرب المعروفة التي تحدث بشكل طبيعي تسلسل لهذا التسلسل فضل النظري هو ان من B. السنانية الأكتين الجين. تسلسل كوزاك من ثوابت الثلاثة ومن ثم تعديلها لتتناسب مع هذا التسلسل الجيني الأكتين. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام كودون من B. تم تحليل السنانية باستخدام قاعدة بيانات الاستخدام كودون ²¹ و كودونات في البنى مع وجود احتمال استخدام منخفضة في B. تم استبدال السنانية (<10٪)، حيثما كان ذلك ممكنا، من خلال كودونات تعادل مع احتمال استخدام أعلى.

نتائج الحقن تبين أن مستوى البروتين التعبير عن هذه النواقل هو مناسبة لفي الجسم الحي يحلل التصوير. وبالنظر إلى أن الناتج التعبير عن ناقلات المعدلة لم يتم مقارنة مع أن من يبني معدلة، ونحن لا يمكن أن يخدعواستعمل على كفاءة التعديلات التي أدخلت في توافق الآراء كوزاك وتسلسل الترميز. وسيكون من المثير للاهتمام بالتأكيد لاختبار ما إذا كانت هذه التعديلات ديها بالفعل لها تأثير على مستويات البروتين التعبير. على طول هذه الخطوط، تحليل حديث يقوم على إبر دقيقة جدا في B. يقترح أن belcheri أخرى، ناقلات معدلة يمكن أن تستخدم أيضا لتوليف مرنا لإنتاج البروتين الفلوري في الحسيكة ^15.

الحسيكة تحتوي الذاتية البروتينات الفلورية الخضراء ^22. وبالتالي فإن الأجنة تظهر مستويات منخفضة من اللون الأخضر وكذلك مضان أحمر (الملاحظات غير منشورة لدينا). ومع ذلك، هذه المستويات المحلية تكاد لا تذكر بالنسبة لمستويات مضان الناتجة عن حقن يبني مرنا لدينا. ولذلك، فإن مضان الذاتية للأجنة الحسيكة لا تزعج الملاحظات التجريبية باستخدام مناظير الفلورسنت أو المجاهر المسح متعدد الليزر. بالإضافة، تكشف عن تجارب الحقن أن كثافة مضان خارجي الناتجة عن حقن مرنا يعتمد على المبلغ الفعلي من المواد المحقونة، والذي يرتبط مباشرة مع تركيز النهائي من مرنا المستخدمة في مزيج الحقن. B. الأجنة السنانية تميل للتسامح مع تركيز تصل إلى 1.8 ميكروغرام / ميكرولتر مرنا، على الرغم من، بغض النظر عن تركيز مرنا الفعلي، بعض تركيبات مرنا ويبدو أن أقل السكوت من قبل B. السنانية الأجنة من غيرها. وهكذا، فإن الجمع بين mCherry النووي والغشاء EGFP من mRNAs يبدو أن أكثر سمية من حقن EGFP النووي وحده.

قد سبق استخدامها تكساس الأحمر ديكستران كما التتبع لحقن ناجحة في البويضات الحسيكة ^13-15. يثير الاهتمام والفضول، إشارة الفلورسنت المستمدة من مرنا حقن تم الحصول أبدا بعد حقن المحاليل المحتوية على تكساس الأحمر ديكستران وهذا في كل من البويضات الحسيكة (ن = 4 تجارب) وzebrafiالأجنة ش (ن = 3 تجارب). عند تحميل مزيج الحقن التي تحتوي على كتب في المختبر مرنا وتكساس الأحمر ديكستران على هلام خالية من ريبونوكلياز الاغاروز (الشكل 3، 2 لين)، والفرقة المقابلة لمرنا تغيب. في المقابل، كتب في المختبر مرنا هو ظاهرة على هلام خالية من ريبونوكلياز الاغاروز في وجود الفينول الأحمر (الشكل 3، حارة 1). وبالنظر إلى أن ليس هناك أي دليل على تدهور مرنا على هلام، وتشير هذه النتائج إلى أن ولاية تكساس الأحمر ديكستران يميل إلى فخ مرنا. عندما تستخدم في محلول الحقن، قد تكساس الأحمر ديكستران بالتالي منع ترجمة مرنا حقن. وبعد هذه الملاحظة، تم اختبار التفاعلات الأصباغ الأخرى (FITC ديكستران، رودامين ديكستران وأوريغون الخضراء ديكستران) مع مرنا، سواء على ريبونوكلياز خالية من المواد الهلامية الاغاروز وعن طريق الحقن في B. السنانية أو الزرد (الشكل 3). التحليلات تشير إلى أن FITC ديكستران لا فخ مرنا على هلام (الشكل 3، والشبكة المحليةه 4) ويؤدي إلى فلوري التعبير البروتين في الزرد (ن = 1 التجربة)، ولكن ليس في الأجنة من B. السنانية (ن = 1 التجربة) (لا تظهر البيانات). رودامين ديكستران لا فخ مرنا على هلام (الشكل 3، حارة 5) ويؤدي إلى فلوري التعبير البروتين في الأجنة الزرد (ن = 1 التجربة) (لا تظهر البيانات)، ولكن للأسف لا يمكن أن يتم اختبار نشاطها في B. الأجنة السنانية. أخيرا، وكما يهاجر ديكستران ولاية أوريغون الخضراء في نفس مستوى مرنا، مرنا محاصرة لا يمكن تقييمها من قبل agarose هلام (الشكل 3، حارة 3). هذه الصبغة الأخير منع الفلورسنت التعبير البروتين في الحسيكة (ن = 1 التجربة)، ولكن لا الأجنة الزرد (ن = 1 التجربة) (لا تظهر البيانات). وباختصار، تشير هذه البيانات إلى أن بعض dextrans يمكن أن تمنع بشكل فعال في ترجمة حقن مرنا. وبالنظر إلى أن التجارب الجرعة والاستجابة لم تنفذ، وهذه البيانات هي النوعية. يثير الاهتمام والفضول، ويبدو هذا التأثير المثبط أن تعتمد علىالأنواع الحيوانية (الزرد مقابل الحسيكة)، الذي يسلط الضوء على الحاجة لمزيد من الدراسات لفهم الآليات الكامنة وراء هذا التأثير. وعلاوة على ذلك، فإن هذه النتائج تتطلب التحليلات التحضيرية، إذا dextrans هي لاستخدامها كأثر اللون لحقن.

تطوير تقنية Microinjection لنموذج معين يفتح الباب أمام التلاعب الجينات المحددة. في الحسيكة، على سبيل المثال، وأعقب وصف الأول من إبر دقيقة جدا (في B. floridae) من قبل ضربة قاضية ناجحة من الجينات، hox1، وذلك باستخدام الحقن morpholino قليل النوكليوتيد ^23،24. عدد B. الأجنة السنانية التي يمكن بنجاح يتم حقنه كل يوم باستخدام بروتوكول المقدمة هنا هي متوافقة بالتأكيد مع هذا النوع من الدراسة. وعلاوة على ذلك، مع هذه الأساليب والتراكيب الجديدة في متناول اليد، يمكن للمرء الآن أيضا تصميم وتنفيذ overexpression وضربة قاضية الدراسات عن طريق الحقن من من mRNAs الفائدة (الأصلي أو المهيمنة على NEGأشكال سالبة) أو استخدام استراتيجيات أخرى لتعطيل التعبير الجيني (على سبيل المثال microRNA- أو الاستراتيجيات القائمة على shRNA). وحتى الآن، لا يمكن إلا أن حقن الحسيكة أن يؤديها في مرحلة البويضة، وذلك ببساطة لأن هذه هي المرحلة الوحيدة التي يمكن أن يجمد بكفاءة. بعد الحقن في مرحلة البويضة، يعبر عن جزيء من الاهتمام بتواجد مطلق في الجنين. وهكذا، إذا احتاج التعبير الجيني يجب أن تتغير أو مراقبتها إلا في مجموعة فرعية من الخلايا، تحتاج يبني DNA ليتم حقنه، ويتم التعبير عن هذه mosaically في الحسيكة تطوير الجنين ^15،25-27. ويمكن أيضا حقن بناء الحمض النووي أن تستخدم لاختبار النشاط من المناطق التنظيمية خلال تطوير الحسيكة في المقايسات المعدلة وراثيا عابرة، مع أن العيب المذكور التعبير الفسيفساء ^15،25-27.

في نهاية المطاف، تقنية حقن مكروي الحسيكة أيضا يفتح الباب لtransgenesis مستقرة، بما في ذلك استهداف تدق التدريجي أو خبط في لمواضع الجيني المحدد. نظامالصورة عن الإدراج مستقر من الحمض النووي الخارجية موجودة بالفعل، على سبيل المثال مع الأسماك القائمة على ينقول نظام Tol2 يبدو أن تعمل في كل من الحشرات والفقاريات حيوان سلوي ^28. وعلاوة على ذلك، نهج يقوم على تعديل nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) أو النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs) أو أدوات التحرير الجينوم الموجهة RNA (كريسبر / كاس النظام) يمكن استخدامها لتوليد الطفرات نقطة واضعا في التعديلات بشكل خاص مناطق الجينوم ^29. هذه الجهود سوف تتطلب تربية على مدار العام من الحسيكة في الأسر، والتي تم بالفعل إعداد لB. belcheri ^11،30 وB. البلهارسيات اليابانية ^30،31 ويجري حاليا تطويرها لA. lucayanum، B. floridae والأنواع الحسيكة المميز هنا، B. السنانية ^32.

The authors have nothing to disclose.

فإن الكتاب أود أن أنوه بالدعم من قبل "Animalerie المركزية دي الصورة المتحركة سور ايفيت" لتربية الحيوانات. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من ANR (ANR-09-بلان-0262-02 وANR-11-JSV2-002-01) لمايكل شوبرت، من خلال منحة الاتحاد الأوروبي FP6 "Embryomics" ومنحة ANR "ANR- 10-بلان-121801 ديف عملية "لجان فرانسوا نيكولا ونادين Peyriéras. ويتم تمويل جواو ايمانويل كارفاليو من قبل زمالة الدكتوراه FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

طلبات ناقلات الموصوفة هنا يمكن معالجتها مباشرة إلى المؤلفين.