Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla <30 dk.

Diferansiyel santrifüjleme ve / veya, Ficoll gradyan santrifüj kullanılarak daha önce anlatıldığı mitokondriyal izolasyon yöntemleri tamamlamak için 60-100 dakika gerektirir. Bir ticari doku Dissociator ve ayırıcı filtrasyon kullanılarak memeli biyopsilerinden mitokondri hızlı izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, el homojenleştirme doku ayrıştırıcı, en standart homojenizasyon döngüsü ile değiştirilir. Bu düzgün ve kolay bir manuel homojenizasyon ile elde edilemez doku tutarlı bir homojenizasyon işleminin uygulanmasına izin verir. Doku ayrışma sonra, homojenat tekrarlanan santrifüj adımları ortadan naylon örgü filtreler aracılığıyla filtre edilir. Bunun bir sonucu olarak, yalıtım mitokondriyal az 30 dk içinde gerçekleştirilebilir. Bu izolasyon protokol 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık) ya da doku numunesinden yaklaşık 2 ¹⁰ x 10 uygulanabilir ve solunum yetkili mitokondri verir.

Mitokondri kırmızı kan hücreleri hariç, vücuttaki her hücrede mevcuttur ve önemli hücresel ve metabolik süreçleri ^1-4 arasında bir sayıda katılmaktadırlar. Çünkü bu birçok fonksiyonun, mitokondriyal hasar zararlı etkileri ³ olabilir. Mitokondriyal fonksiyon ve disfonksiyonu birkaç mitokondriyal izolasyon yöntemleri araştırmak amacıyla tarif edilmiştir. 1940'larda ^5-8 mitokondriyal izolasyon tarihten erken yayınlanmış hesaplar. Ilk belgelenmiş girişim düşük hızda ^5,8 bir tuz çözeltisi içinde ve ardından merkezkaçlama uygulanarak, bir havan içinde karaciğer doku öğüterek mitokondriyal izolasyonu gösterdi. Daha sonra, diğer gruplar orijinal prosedürü üzerine genişletilmiş ve diferansiyel santrifüj ^6-8 dayalı doku ayrımlaştığını gösterdi. Bu ilk yöntemlerin sık sık homojenizasyon ve / veya diferansiyel santrifüj ^9-15 dahil güncel tekniklerin temelini oluşturmuştur. Homogenizati sayısıadımlar ve santrifüj protokolleri arasında değişir. Bu tekrarlı adımlar mitokondriyal izolasyon süresini artırmak ve sonuçta canlılığını azaltır. Düzgün ^10,16 kontrollü değilse Ayrıca, manuel homojenizasyon mitokondriyal hasar ve tutarsız sonuçlara neden olabilir.

Son zamanlarda, biz miyokard dokusu ^17,18 içine nakli için mitokondri izole etmek için homojenizasyon ve diferansiyel santrifüj kullanılır. Bu izolasyon prosedürü, uzun, yaklaşık 90 dakika gerekli ve bu yöntemin klinik uygulanabilirliği dolayısıyla sınırlı kalmıştır. Klinik ve cerrahi tedavi akut terapötik kullanım için izin vermek için daha az bir süre, 30 dakika içinde yapılabilir hızlı bir mitokondriyal izolasyon işlemi geliştirdik.

Bu protokolün büyük faydalar standart doku ayrışma üniforma ve kolayca manuel homojenizasyon ile elde edilmez doku tutarlı homojenizasyon için izin verdiğini vardır. Additiyon, diferansiyel santrifüj yerine diferansiyel filtrasyon kullanımı zaman alıcı ve son derece saflaştırılmış yaşayabilir ve solunum yetkili mitokondri daha hızlı izolasyonu için izin tekrarlayan santrifüj adımları ortadan kaldırır.

30 dakikadan az yaşayabilen ve solunum yetkili mitokondri izole yeteneği klinik uygulanabilirlik sağlar. Bu izolasyon protokol koroner arter bypass cerrahisi (KABG) ve diğer tedavi işlemlerinde kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.

Hazırlık

1. 1 M K-HEPES stok çözeltisi (KOH ile pH 7.2 ayarlayın) hazırlayın.
2. , 0.5 M EGTA K stok çözeltisi (KOH ile 8.0 pH ayarlayın) hazırlayın.
3. 1 M KH ₂ PO ₄ stok çözelti hazırlayın.
4. , 1 M _MgCl2 stok çözelti hazırlayın.
5. Homojenizasyon tampon maddesi (pH 7.2), 300 mM sakaroz, 10 mM K-Hepes ve 1 mM EGTA K hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
6. Solunum Tampon 250 mM sakaroz, hazırlama 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM _MgCI2, 20 mM K-HEPES tamponu (pH 7.2) ve 0.5 mM K-EGTA (pH 8.0). 4 ° C'de saklayın.
7. NaCl 80 g, KCl 2 g Na ₂ HPO _4, 14.4 g ve 1 L'lik iki kez damıtılmış _H2O (pH 7.4), KH ₂ PO ₄ 2.4 g eritilmesi ile 10x, PBS stok çözelti hazırlayın.
8. 1 L çift distile H ₂ O içine 100 ml 10x PBS pipetleyerek 1x PBS hazırlayın
9. Subtilisin A 4 mg dışarı ağırlığında tarafından Subtilisin bir Stok hazırlayın1.5 ml mikrofüj tüpüne. Kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.
10. 1.5 ml mikrofüj tüpüne BSA 20 mg tartılarak BSA Stok hazırlayın. Kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.

Mitokondriyal İzolasyon (Şekil 1)

1. Izolasyon hemen önce, homojenizasyon tampon maddesi içinde 1 ml subtilisin A çözülür.
2. Izolasyon hemen önce, homojenizasyon tampon maddesi içinde 1 ml BSA çözülür.
3. Buz üzerinde bir 50 ml konik santrifüj tüpüne 1x PBS içinde 6 mm biyopsi örneği yumruk ve mağaza kullanarak iki taze doku örneklerini toplar.
4. Homojenleştirme tamponu buz gibi soğuk 5 ml ihtiva eden bir ayırma tüpüne C dokusunun iki adet 6 mm delikler aktarın.
5. Doku dissociator üzerindeki ayrışma C tüpü takarak doku homojenize ve önceden ayarlanmış mitokondriyal izolasyon döngüsü (60 sn homojenizasyon) seçin.
6. Bir buz kovası ayrışma C tüpü çıkarın.
7. Subtilisin için bir stok çözeltisi 250 ulHomojenat, çevirerek karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe Homojenat.
8. Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde bir 50 mL konik santrifüj tüpü üzerine 40 mikron gözenekli bir filtre yerleştirilmesi ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre.
9. Filtrata taze hazırlanmış BSA Stok Çözüm 250 ul ekleyin ve çevirerek karıştırın.
   Not: mitokondriyal protein tayini gerekli ise, bu adımı atlayın.
10. Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü üzerine bir 40 mikron filtre yerleştirin ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre.
11. Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü üzerine bir 10 mikron filtre yerleştirin ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre.
12. 10 dk boyunca 9000 x g'de iki önceden soğutulmuş 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve santrifüj filtrat aktarın4 ºC.
13. Süpernatantı ve yeniden askıya ve buz soğuk Solunum Tampon 1 ml pelet birleştirir.

ATP Deneyi

Not: bir ATP parlaklık deney ATP deney kiti kullanılarak gerçekleştirilebilir izole mitokondri metabolik aktivitesini belirlemek. Protokol, reaktifler ve standartlar deney kiti içinde temin edilmiştir. Yöntemin özeti, aşağıda tarif edilmiştir.

1. Oda sıcaklığına kiti reaktifler dengelenmesi.
2. Çifte damıtılmış su, 1.170 ul ATP liyofilize pelet eritilmesi ile, 10 mM ATP stok çözelti hazırlayın. ATP buz üzerinde standart Stok Çözüm ve hazırlanan mitokondriyal örnekleri saklamak.
3. Liyofilize edilmiş alt-tabaka çözeltisinin bir şişeye Yüzey Tampon çözelti 5 ml. İyice karıştırın ve karanlıkta yerleştirin.
4. Siyah, ışık geçirmeyen alt, 96 gözlü bir levhanın tüm oyuklara Solunum tampon 100 ul ilave edin.
5. Her hazırlanmış örneklerinden o iyi mitokondri 10 ul eklefa Siyah, ışık geçirmeyen alt, 96 çukurlu levha. Not: Numuneler üç kopya halinde plakalanır. Standartları ve negatif kontrol (Solunum Tampon) için üç kuyu için bir satır içerir.
6. Standartlar ve kontroller de dahil olmak üzere, tüm oyuklara memeli hücre lizis çözeltisinin 50 ul ekle.
7. 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. İnkübasyon sırasında, 10 mM ATP stok çözeltisinden 0.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM, 0.001 mM ve 0.0001 mM ATP konsantrasyonlarda ATP standartlar hazırlandı. Buz üzerinde saklayın standartları.
9. İnkübasyondan sonra, plaka haritada gösterildiği gibi karşılık gelen kuyu ATP standartların 10 ul ekle. Not: standartlar iki kopya halinde gerçekleştirilir.
10. Her bir oyuğa substrat çözeltisinin sulandırılmış 50 ul ekle.
11. 125 rpm'de 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde 37 ° C'de inkübe edin.
12. Spektrofotometre ile bağlantılı bir bilgisayarda açık Gen5 1.11 yazılımı.
13. "AltındaYeni Öğe Oluştur Experiment "", "tıklayın.
14. "Varsayılan Protokolü" üzerine tıklayın. "Tamam" ı tıklayın.
15. Sol sütunda, daha sonra, "Prosedür" "Protocol" seçeneğini seçin.
16. "Gecikme" seçeneğini seçin. 00:10:00 ayarlayın. "Tamam" ı tıklayın.
17. Seç "Oku". Açılan menüden gelen "Lüminesans" seçeneğini seçin. Aşağıdaki diğer ayarları yapın: tipi Endpoint, Entegrasyon Zaman 0 okuyun: 01.00 MM: SS.ss, Filtre 1 Takımları, Emisyon Hole, Optik Pozisyonu Top, Hassasiyet 100, En Sonda Dikey 1.00 mm Ofset.
18. Plaka analiz hazır olduğunda, üst satırda "Plakasını oku" simgesini tıklatın. "Oku" tıklayın. Spektrofotometre açıldığında, sol üst köşede de A1 ile tepsiye tabak yerleştirin. Sıcaklığına sahip bir kutu açılacaktır. "Oku" tıklayın. Not: Daha yüksek değerler artmış ATP seviyeleri ve daha yüksek metabolik aktivite ile ilişkilidir.

Doku Ayrışma ve diferansiyel filtrasyon kullanılarak mitokondri izolasyonu ile işlem adımları özetleyen bir şekil, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Toplam işlem süresi 30 dakikadan daha azdır.

Doku örnekleri 6 mm biyopsi zımbası kullanılarak elde edilmiştir. Doku ağırlığı 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık). Parçacık boyutu sayımı ile belirlenmiştir olarak izole mitokondri sayısı 2.4 oldu ¹⁰ x 10 x 10 ± 0.1, iskelet kası boyunca ¹⁰ mitokondri ve karaciğer preparasyonlar için 2.75 x 10 ¹⁰ ± 0.1 x 10 mitokondri ¹⁰ (Şekil 2A). Mitokondriyal karşılaştırma sayısı da hemasitometre ile tespit edildi olanak sağlamak için. 0.11 hemositomer gibi mitokondriyal sayısı hafife alınmıştır ¹⁰ x 10 ± 0.04 x ¹⁰ 10 iskelet kası için mitokondri ve 0,34 x karaciğer hazırlıkları için ¹⁰ x 10 mitokondri 10 ¹⁰ ± 0.09 (FŞEKIL 2A). Tabanlı parçacık boyutu sayacı tarafından belirlenen Mitokondriyal çapı Şekil 2B'de de gösterilmiştir. Temsilcisi izleme izole mitokondri önceki raporlarda ⁷ ile anlaşarak 0.38 ± 0.17 mikron ortalama çaplı bir zirve altında lokalize gösterir.

Mitokondriyal protein / g olmuştur (ıslak ağırlık) Bikinkoninik asit (BCA) deneyi ile belirlendiği gibi başlangıç ​​dokusu olarak 4.8 ± 2.9 mg / g olmuştur (ıslak ağırlık) ve sırasıyla, karaciğer, iskelet kası ve örnekler için 7.3 ± 3.5 mg / g olmuştur (ıslak ağırlık) (Şekil 2C).

Mitokondriyal saflık transmisyon elektron mikroskobu ile tespit edilmiş ve Şekil 2B olarak gösterilir. Mitokondri az% 0.01 kırık veya hasar ile yoğun elektron edilmesi gösterilmiştir. Olmayan mitokondriyal parçacıklar kirletmesi 0,001% olarak daha azdır.

Daha önce de mitokondriyal canlılığı MitoTracker Kırmızı ile saptanmıştır^17,18 kayıtsız kalamayız. Sonuçlarımız izole mitokondri zar potansiyeli (- K Şekil 3A) muhafaza ettiğini göstermektedir.

ATP lüminesan deney kiti ile belirlenmiştir. ATP deneyi için bir plaka haritası Şekil 4 'de gösterilmiştir. ATP standartlar iki kopya halinde plakalanmıştır. Mitokondriyal örnekleri ve negatif kontrol, üç kopya halinde plakalanmıştır. ATP içeriği 10.67 ± 4.38 nmol / mg protein, mitokondriyal 14.83 ± 4.36 nmol / mg protein, mitokondriyal iskelet kası, karaciğer ve örnekler için ise (Şekil 3D) idi.

Mitokondriyal solunum, daha önce tarif edildiği gibi ^17,18 Clark tipi elektrot kullanılarak değerlendirildi. Mitokondriyal oksijen tüketim hızı karaciğer preparasyonlar için 178 iskelet kası için ± 17 nM _O2 / dak / mg protein, mitokondriyal 176 ± 23 nM _O2 / dak / mg protein olmuştur mitokondriyal. Solunum kontrol indeksi (RCI) değerleri 2.45 ± 0.34 idi biriskelet kası, karaciğer ve numune hazırlama tespit edilmiştir (Şekil 3E) d 2.67 ± 0.17. Bu sonuçlar mitokondri ^17-18 izole manuel homojenizasyon ve diferansiyel santrifüj kullanarak bizim daha önceki çalışmalarda bildirilen benzerdir.

Doku Ayrışma ve diferansiyel filtrasyon kullanılarak mitokondri izolasyonu için Şekil 1. Şema. (A), Aktarım biri 6 mm biyopsi numunesi punçu ayrışma C tüp içinde homojenizasyon tampon maddesinin 5 ml ve doku ayrıştırıcı, en 1 dakika homojenleştirme programı kullanılarak örnekleri homojenize edilmiştir. (B), 250 ul ayrışması olarak homojenata bir stok solüsyonu subtilisin ekleyin C boru ve 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın. (C), bir ön filtre üzerinden Homojenat Buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü içinde 40 mikron gözenekli bir filtre -wetted ve daha sonra süzüntünün BSA stok çözeltisi 250 ul ilave edin. 50 ml (D) yeniden filtresi yeni bir önceden ıslatılmış 40 um gözenekli filtre ile süzülen Buz üzerinde konik santrifüj. (E) Yeniden filtre buz üzerinde bir 50 mL konik santrifüj tüpü içinde yeni bir önceden ıslatılmış 10 um gözenekli filtre aracılığıyla filtre ürünü. (F) 9000 x g 'de 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve santrifüj filtrat aktarın 4 ° C'de 10 dakika. (G) süpernatantı ve yeniden askıya ve 1 mi Solunum Tamponu içinde mitokondriyal pelet birleştirir. Toplam işlem süresi az 30 dk. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

d / 51682 / 51682fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
2. Mitokondriyal verim ve saflık Şekil. (A), hemositometre ve parçacık büyüklüğü numarası sayaç mitokondri, iskelet kası ve karaciğer için 0.18 ± 0.04 g doku (ıslak ağırlık) izole edilir. (B) 'Mitokondriyal büyüklüğü (mg / g), partikül ebadı sayacı ile tespit edildiği üzere dağılımı. (C) Protein Mitokondrial iskelet kaslarında ve karaciğerde için mg / g doku ıslak ağırlık. izole mitokondri (D) Transmisyon elektron mikroskopi görüntüsü. Ölçek çubuğu 100 nm'dir. Oklar olmayan mitokondriyal parçacıklar ve bozuk mitokondri tarafından olası kirlenmeyi gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

< br /> Şekil 3. Mitokondriyal canlılığı. MitoTracker kırmızı CMXRos ile etiketlenmiş mitokondri ile floresan ışıklandırma altında, faz kontrast ve (B ve C) altında izole edilmiş mitokondri (A) Örnek fotomikrograflarıdır. Ölçek çubukları 25 um (A, B) ve 5 um (° C). Bu görüntüler mitokondri membran potansiyelini koruduğunu göstermektedir.   ATP tahlil ve (E) RCI tarafından belirlenen Oklar zar potansiyeli ya da enkaz (D) ATP içeriği nmol / mg mitokondriyal protein eksik mitokondri göstermektedir (devlet 3 / devlet 4) Clark elektrodu ile belirlenmiştir. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.

yük / 51682 / 51682fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. ATP tayini için Şekil 4. Levha haritası Bu plaka haritası (A1 - A12) standartlarını nasıl ayarlanacağını gösterir, mitokondri örnekleri ATP deneyi için - - (C9 C7) (B1 C6) ve negatif kontroller. Deney sırasında Solunum tampon 100 ul, memeli hücre lizis çözeltisinin 50 ul substrat çözeltisi ile sulandırılmış, 50 ul tüm oyuklara ilave edilir (A1 - C9).

Başarıyla mitokondriyal canlılığını korumak için buz üzerinde tüm çözümleri ve doku örnekleri tutmak için önemli olan bu protokolü kullanarak mitokondri izole etmek için. Buz üzerinde muhafaza bile, izole mitokondri zaman ¹⁹ vasıtasıyla işlevsel aktivitesinde bir azalma sergiler. Hepimiz çözümleri ve eklemeler önceden hazırlanmış öneririz. Biz önceden tartılır ve 1.5 ml mikrofüj tüpler 4 mg parçalar halinde saklayın ve subtilisin A -20 ° C'de saklayın. Benzer şekilde BSA önceden tartılmış ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir bir 1.5 ml mikrofüj tüplerine, 20 mg parçalar halinde saklanır. Tüpleri kullanılmamalıdır hemen önce -20 ° C'de çıkarılır ve subtilisin A ve BSA mitokondriyal izolasyon prosedürü kullanılmak için homojenizasyon tampon maddesinin 1 ml içinde çözülür.

Iskelet kas dokusunda iki biyopsi yumruklar 6 mm biyopsi yumruk terapötik müdahaleler ¹⁷ klinik ve cerrahi prosedürlerde kullanılmak için yeterli mitokondri sağlamak kullanılarak elde-18. Biz iki yöntem, hemositometre ve partikül boyutu sayma kullanmış mitokondri sayısını tahmin etmek için. Parçacık boyutu sayma kullanılması tavsiye edilir. Parçacık boyutu sayacı Tanımlanmış boyutta bir deliğin içinden geçen parçacıklar hacmini ölçmek için elektrik empedansı kullanır. Parçacık boyutu sayacı pahalı ama doğru ve güvenilir tahminler sağlar ve kullanıcı bağımsızdır. Hemocytometry tarafından tahmin mitokondriyal sayı daha ekonomiktir. Çalışmalarımız, bu yöntem, bir parçacık boyutu sayacı kullanılarak elde edilene kıyasla daha az büyüklükte yaklaşık sırası olan değişken tahminler sağladığını göstermiştir. Biz de hemositometrede elde sayımları kullanıcıya son derece bağımlı olduğunu kaydetti. Biz Hemasitometre kullanarak tüm sayar bir kişi tarafından yapılmalıdır tutarlı tahminler sağlamak öneririz.

Bu mitokondriyal fonksiyon tespit etmek için yararlıdır ATP deney kitleri bulduk. Kiti gerekli tüm r malzemelerieagents ve izole mitokondri metabolik aktivitesini belirlemek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir. ATP deneyi, Clark-tipi elektrot kullanılarak elde edilenlere benzer sonuçlar elde edilir ve bu nedenle önceki veri analizi ^20-21 ile uyumludur.

Bizim mitokondriyal izolasyon protokol önemli bir avantajı, en az 30 dakika içinde kirlenmez uygulanabilir, solunum yetkili mitokondri yüksek bir verimle izole edilmesi için izin vermektedir. Diferansiyel santrifüj yerine Diferansiyel filtrasyon önemli ölçüde işlem süresini azaltır. Diğer protokoller genel izolasyon süresi 60 dakika için 100 dakika ^13-17 olmanın birkaç santrifüj adımları içermektedir. Bu protokolün diğer bir avantajı doku homojenizasyon standardize olmasıdır. Ticari doku ayıracı standart bir döngüsü sağlar ve tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. Bu kullanıcı ve değişkenlik tabidir manuel homojenleştirmeye tersidirtutarsızlık. Doku ayrışmasını ve diferansiyel filtrasyon kullanılarak mitokondri hızlı izolasyonu için bizim yöntem klinik ve cerrahi tedavi müdahale ^17,18 uyumlu bir izolasyon zaman çerçevesi sağlar.

Tüm hayvanlar mevcut kurumsal kurallarına uygun olarak tedavi edildi. Biz ifşa rakip mali çıkarlarını hiçbir var.

Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibe HL 103542, ve CAP için BCH Anestezi Araştırma Vakfı'nın Değerli Malibu Ödülü ile desteklenmiştir.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.