Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit <30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Zuvor beschriebenen mitochondrialen Isolationsverfahren unter Verwendung differentieller Zentrifugation und / oder Ficoll-Gradienten-Zentrifugation erfordert 60 bis 100 min in Anspruch. Wir beschreiben ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugetierbiopsien unter Verwendung eines kommerziellen Gewebe Dissociator und Differentialfiltration. In diesem Protokoll ist eine manuelle Homogenisierung mit standardisierten Zyklus der Homogenisierung des Gewebes Dissociator ersetzt. Dies ermöglicht eine einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. Nach Gewebedissoziation wird das Homogenat durch Nylon-Mesh-Filter, die sich wiederholenden Zentrifugationsschritten beseitigen gefiltert. Als Ergebnis kann die mitochondriale Isolierung in weniger als 30 min durchgeführt werden. Diese Isolation Protokoll ergibt etwa 2 x 10 ¹⁰ lebensfähige und Atmung zuständige Mitochondrien von 0,18 ± 0,04 g (Nassgewicht) Gewebeprobe.

Mitochondrien existieren in jeder Zelle des Körpers mit Ausnahme der roten Blutzellen und in einer Vielzahl von wichtigen zellulären Stoffwechselprozesse und ^1-4 involviert. Aufgrund dieser vielen Funktionen können mitochondriale Schäden schädlichen Wirkungen ³ aufweisen. Um die Funktion der Mitochondrien und mitochondriale Dysfunktion mehrere Isolationsmethoden zu untersuchen, wurden beschrieben. Die frühesten veröffentlichten Konten von mitochondrialen Isolierung Datum auf den 1940er ^5-8. Der erste dokumentierte Versuch demonstriert mitochondrialen Isolierung durch Schleifen Lebergewebe in einem Mörser, gefolgt von Zentrifugation in einer Salzlösung, bei niedriger Geschwindigkeit ^5,8. Später erweiterte anderen Gruppen auf dem ursprünglichen Verfahren und demonstrierte Gewebe Fraktionierung basierend auf differentielle Zentrifugation ^6-8. Diese frühen Methoden bildeten die Grundlage der aktuellen Techniken, die oft zu integrieren Homogenisierung und / oder differenzielle Zentrifugation ^9-15. Die Anzahl der homogenizatiauf und Zentrifugationsschritte variiert zwischen den Protokollen. Diese sich wiederholenden Schritten erhöhen die Zeit für mitochondriale Isolation und letztlich reduzieren Lebensfähigkeit. Darüber hinaus können manuelle Homogenisierung mitochondriale Schäden und inkonsistenten Ergebnissen führen, wenn nicht richtig gesteuert ^10,16.

Kürzlich haben wir Homogenisierung und differentielle Zentrifugation Mitochondrien für die Transplantation in Herzmuskelgewebe ^17,18 isolieren. Dieser langwierige Isolierungsverfahren benötigt ungefähr 90 min, und die klinische Anwendbarkeit dieses Verfahrens war daher begrenzt. Zur therapeutischen Verwendung bei akuten klinischen und chirurgischen Behandlung zu ermöglichen haben wir eine schnelle mitochondrialen Isolierungsverfahren, die in weniger als 30 min durchgeführt werden kann, entwickelt.

Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind, dass standardisierte Gewebedissoziation ermöglicht einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. In additIonen, die Verwendung von Differentialfiltration anstelle der differentielle Zentrifugation eliminiert zeitraubende und wiederholte Zentrifugation Schritte ermöglichen eine schnellere Isolierung von hoch gereinigten, lebensfähige und kompetente Atmung Mitochondrien.

Die Fähigkeit, tragfähige und Atmung zuständige Mitochondrien in weniger als 30 min zu isolieren können für die klinische Anwendbarkeit. Diese Isolation Protokoll hat Potenzial für den Einsatz in koronarer Bypass-Chirurgie (CABG) und andere Therapieverfahren.

Vorbereitung

1. Bereiten 1 M K-HEPES-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 7.2).
2. Bereiten 0,5 M K-EGTA-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 8,0).
3. Bereiten 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Lösung.
4. Bereiten 1 M MgCl _{2-Stammlösung.}
5. Vorbereitung Homogenisierungspuffer (pH 7,2) 300 mM Saccharose, 10 mM K-HEPES, 1 mM K-EGTA. Lagerung bei 4 ° C.
6. Vorbereitung Respiration Puffer 250 mM Saccharose, 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM MgCl _2, 20 mM K-HEPES-Puffer (pH 7,2) und 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Lagerung bei 4 ° C.
7. Vorbereitung 10x PBS-Stammlösung hergestellt durch Lösen von 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na ₂ HPO ₄ und 2,4 g KH ₂ PO ₄ in 1 l doppelt destilliertem H ₂ O (pH 7,4).
8. Bereiten 1x PBS pipettiert 100 ml 10x PBS in 1 l doppelt destilliertem H ₂ O.
9. Bereiten Subtilisin A Stock durch Auswiegen 4 mg Subtilisin A inin ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.
10. Vorbereitung BSA Vektor durch Einwaage von 20 mg BSA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.

Mitochondriale Isolation (Abbildung 1)

1. Unmittelbar vor der Isolation, auflösen Subtilisin A in 1 ml Homogenisierungspuffer.
2. Unmittelbar vor der Isolation, auflösen BSA in 1 ml Homogenisierungspuffer.
3. Sammeln Sie zwei frische Gewebeproben mit einem 6 mm Biopsieprobe Punsch und speichern in 1x PBS in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
4. Übertragen Sie die zwei 6 mm Stempeln von Gewebe zu einer Dissoziation C-Rohr mit 5 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer.
5. Homogenisieren des Gewebes durch Anpassen der Dissoziation C-Rohr auf das Gewebe Dissociator und wählen Sie den voreingestellten mitochondrialen Isolierung Zyklus (60 Sekunden Homogenisierung).
6. Entfernen Sie die Dissoziation C-Rohr zu einem Eimer Eis.
7. Fügen Sie 250 ul Subtilisin A Stock Lösung, um dieHomogenat, mischen durch Umdrehen und Inkubation des Homogenats auf Eis für 10 min.
8. Legen Sie ein 40 um-Sieb-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
9. Fügen Sie 250 ul frisch zubereitet BSA-Stammlösung zu dem Filtrat und mischen durch Umdrehen.
   Hinweis: Lassen Sie diesen Schritt, wenn mitochondrialen Proteinbestimmung erforderlich ist.
10. Legen Sie eine 40-um-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
11. Legen Sie eine 10-um-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
12. Das Filtrat zwei vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 9000 × g für 10 min bei4 ° C.
13. Überstand entfernen und wieder aussetzen und kombinieren Pellets in 1 ml eiskaltem Puffer Atmung.

ATP-Assay

Anmerkung: Zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von isolierten Mitochondrien eine ATP-Lumineszenz-Assay kann unter Verwendung eines ATP-Assay-Kits durchgeführt werden. Das Protokoll, wurden Reagenzien und Standards in der Assay-Kit geliefert. Eine Zusammenfassung des Verfahrens wird nachfolgend beschrieben.

1. Ins Gleichgewicht Kit-Reagenzien auf RT.
2. Herstellung von 10 mM ATP-Stammlösung durch Auflösen von gefriergetrockneten ATP Pellet in 1.170 ul doppelt destilliertem Wasser. Speichern ATP-Standardstammlösung und bereit mitochondrialen Proben auf Eis.
3. 5 ml Substratpuffer Lösung für ein Fläschchen lyophilisierte Substrat-Lösung. Vorsichtig mischen und legen in der Dunkelheit.
4. 100 l Puffer Atmung zu allen Vertiefungen einer schwarzen, undurchsichtigen Boden, 96 Well-Platte.
5. Fügen Sie 10 ul der Mitochondrien aus den vorbereiteten Proben in jede Vertiefung ofa schwarz, undurchsichtig unten, 96-Well-Platte. Hinweis: Die Proben werden in dreifacher Ausfertigung überzogen. Fügen Sie eine Zeile für Standards und drei Brunnen für die Negativkontrolle (Atmung Buffer).
6. Fügen Sie 50 ul von Säugetierzell Lyse-Lösung in alle Vertiefungen, einschließlich der Normen und Kontrollen.
7. Die Platte bei 37 ° C für 5 min auf einem Orbitalschüttler bei 125 Umdrehungen pro Minute.
8. Während der Inkubation herzustellen ATP-Standards in Konzentrationen von 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM und 0,0001 mM ATP aus 10 mM ATP-Stammlösung. Shop-Standards auf Eis.
9. Nach der Inkubation werden 10 ul der ATP-Standards mit entsprechenden Vertiefungen wie auf der Platte Karte angezeigt. Anmerkung: Standards werden in doppelter Ausführung durchgeführt.
10. Dann werden 50 ul des rekonstituierten Substratlösung in jede Vertiefung.
11. Inkubieren der Platte bei 37 ° C auf dem Schüttler für 5 Minuten bei 125 Upm.
12. Offene Gen5 1.11-Software auf einem Computer mit dem Spektrophotometer verbunden ist.
13. Unter "Neues Element erstellen ", klicken Sie auf" Experiment ".
14. Klicken Sie auf "Standardprotokoll". Klicken Sie auf "OK".
15. In der linken Spalte, wählen Sie "Protokoll", dann "Vorgehensweise".
16. Wählen Sie "Delay". Eingestellt, 00.10.00. Klicken Sie auf "OK".
17. Wählen Sie "Lesen". Wählen Sie "Lumineszenz" aus der Drop-Down-Menü. Passen Sie andere Einstellungen auf die folgenden: Lesen Typ Endpoint, Integrationszeit 0: 01.00 MM: SS.ss, Filter-Sets 1, Emission Loch, Optik Top Position, Empfindlichkeit 100, Offset Top Probe Vertikal 1,00 mm.
18. Wenn die Platte ist bereit, analysiert werden, klicken Sie auf das Symbol "Lesen Plate" in der oberen Reihe. Klicken Sie auf "Lesen". Wenn das Spektralphotometer öffnet, legen Sie die Platte in das Fach mit gut A1 in der oberen linken Ecke. Eine Box mit der Temperatur wird geöffnet. Klicken Sie auf "Lesen". Hinweis: Höhere Werte korrelieren mit erhöhten ATP-Spiegel und höhere Stoffwechselaktivität.

Eine Figur skizziert die Verfahrensschritte bei der Isolierung von Mitochondrien mit Gewebedissoziation und Differenz Filtration ist in Abbildung 1 dargestellt. Gesamtverfahrensdauer weniger als 30 min.

Gewebeproben wurden mit einem 6 mm-Biopsie Punch erhalten. Gewebegewicht betrug 0,18 ± 0,04 g (Feuchtgewicht). Die Anzahl der Mitochondrien isoliert, wie durch die Teilchengröße Zählung bestimmt war 2,4 x ¹⁰ 10 ± 0,1 x ¹⁰ 10 Mitochondrien für Skelettmuskulatur und 2,75 x ¹⁰ 10 ± 0,1 x ¹⁰ 10 Mitochondrien der Leberpräparationen (Abbildung 2A). Um einen Vergleich der mitochondrialen Zahl wurde auch von Hämozytometers bestimmt. Mitochondrienzahl wurde unterschätzt, wie Hämozytometers als 0,11 x 10 bestimmt ¹⁰ ± 0,04 x ¹⁰ 10 Mitochondrien für die Skelettmuskulatur und 0,34 x ¹⁰ 10 ± 0,09 x ¹⁰ 10 Mitochondrien für Leberpräparaten (FBBILDUNG 2A). Mitochondriale Durchmesser von Größe basierend Partikelzähler bestimmt ist in 2B gezeigt. Der Vertreter Verfolgung zeigt die isolierten Mitochondrien sind unter einem Peak mit mittleren Durchmesser von 0,38 ± 0,17 um in Übereinstimmung mit früheren Berichten ⁷ lokalisiert.

Mitochondriale Protein / g (Feuchtgewicht) Ausgangsgewebe wie von Bicinchoninsäure (BCA)-Test bestimmt betrug 4,8 ± 2,9 mg / g (Feuchtgewicht) und 7,3 ± 3,5 mg / g (Feuchtgewicht) für die Skelettmuskulatur und in der Leber bzw. Proben (Abbildung 2C).

Mitochondriale Reinheit wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt und ist in 2D gezeigt. Mitochondrien sind gezeigt, um dicht mit weniger als 0,01% ist gebrochen oder beschädigt Elektron. Verunreinigungen durch nicht-mitochondriale Teilchen weniger als 0,001%.

Mitochondriale Lebensfähigkeit wurde durch MitoTracker Red bestimmt wie zuvor debeschrieben ^17,18. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die isolierten Mitochondrien halten Membranpotential (3A - C).

ATP wurde unter Verwendung eines lumineszierenden Assay-Kit bestimmt. Eine Platte der Karte für die ATP-Assay wird in 4 gezeigt. ATP-Standards wurden doppelt plattiert. Mitochondrialen Proben und Negativkontrollen wurden dreifach beschichtet. ATP-Gehalt war 10,67 ± 4,38 nmol / mg Protein und mitochondrialen 14,83 ± 4,36 nmol / mg Protein für mitochondriale Skelettmuskulatur und Leberproben bzw. (3D).

Mitochondriale Atmung wurde mit einer Clark-Elektrode Typ wie zuvor beschrieben ^17,18 bewertet. Mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate betrug 178 ± 17 nM O ₂ / min / mg Protein für mitochondriale Skelettmuskel und 176 ± 23 nm O ₂ / min / mg Protein für mitochondriale Leberpräparationen. Atemkontrolle Indexwerte (RCI) waren 2,45 ± 0,34 eind 2,67 ± 0,17 für die Skelettmuskulatur und in der Leber bzw. Probenvorbereitungen (3E). Diese Ergebnisse sind ähnlich denen in unseren früheren Studien mit manuellen Homogenisierung und differentielle Zentrifugation isoliert Mitochondrien ^17-18 berichtet.

Abbildung 1. Schema für die Isolierung von Mitochondrien mit Gewebedissoziation und Differentialfiltration. (A) Transfer zwei 6 mm Biopsieprobe Schläge auf 5 ml Homogenisierungspuffer in einer Dissoziation C-Rohr und homogenisieren die Proben mit 1 min Homogenisierung Programm der Gewebe Dissociator ist. (B) In 250 ul Subtilisin A-Stammlösung zum Homogenat bei der Spaltung C Röhre und Inkubieren auf Eis für 10 min. (C) Filtern des Homogenats durch ein vorge -wetted 40 um-Sieb-Filter in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und fügen Sie dann 250 ul BSA-Stammlösung zu dem Filtrat. (D) Re-Filter das Filtrat durch eine neue vorbenetzten 40 um-Sieb-Filter in einem 50 ml konischen Zentrifugen auf Eis. (E) Re-Filter das Filtrat durch eine neue vorbenetzt 10 um Maschenfilter in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis. (F) Das Filtrat in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 9.000 × g für 10 min bei 4 ° C. (G) Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren und kombinieren Sie die mitochondriale Pellets in 1 ml-Atmung Buffer. Gesamtverfahrensdauer von weniger als 30 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Mitochondriale Ausbeute und Reinheit. (A) und der Partikelgröße Hämozytometers Gegen Mitochondrien Zahl von 0,18 ± 0,04 g Gewebe (Nassgewicht) für die Skelettmuskulatur und in der Leber isoliert. (B) Mitochondriale Größe (mg / g) Verteilung von Partikelgrößenzähler erfasst. (C) Mitochondriale Protein mg / g Frischgewicht für Gewebe der Skelettmuskulatur und in der Leber. (D) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von isolierten Mitochondrien. Maßstab ist 100 nm auf. Pfeile zeigen mögliche Kontamination durch nicht mitochondriale Partikel und beschädigte Mitochondrien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

< br /> Abbildung 3. Mitochondriale Lebensfähigkeit. Vertreter Mikrophotographien von isolierten Mitochondrien (A) unter dem Phasenkontrastbeleuchtung und (B und C) unter Fluoreszenz, mit Mitochondrien mit MitoTracker Red CMXRos gekennzeichnet. Maßstabsbalken 25 um (A, B) und 5 um (C). Diese Bilder zeigen, dass Mitochondrien erhalten Membranpotential.   Pfeile zeigen Mitochondrien fehlen Membranpotential oder Schmutz (D) ATP-Gehalt nmol / mg Protein als mitochondriale ATP-Assay und (E) bestimmt RCI (Stand 3 / Zustand 4), wie von Clark-Elektrode bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.

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. Abbildung 4. Kennzeichen-Karte für die ATP-Assay Diese Platte Karte veranschaulicht, wie Sie Standards (A1 - A12), Mitochondrien Proben (B1 - C6) und Negativkontrollen (C7 - C9) für die ATP-Assay. Während des Assays wurden 100 ul Atmungspuffer, 50 ul von Säugerzellaufschluß-Lösung und 50 ul der Substratlösung rekonstituiert werden allen Vertiefungen gegeben (A1 - C9).

Um erfolgreich zu isolieren Mitochondrien mit diesem Protokoll ist es wichtig, alle Lösungen und Gewebeproben auf Eis zu halten, um die mitochondriale Lebensfähigkeit bewahren. Auch wenn auf Eis gehalten wird isolierten Mitochondrien eine Abnahme der funktionellen Aktivität im Laufe der Zeit ¹⁹ aufweisen. Wir empfehlen, dass alle Lösungen und Ergänzungen vor, vorbereitet werden. Wir voraus wiegen und zu speichern Subtilisin A in 4 mg Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und speichern sie bei -20 ° C. Ähnlich BSA vorgewogen und in 20 mg Aliquots in 1,5-ml-Mikroröhrchen, die bei -20 ° C gelagert werden gespeichert. Kurz vor der Rohre verwendet werden von -20 ° C entfernt und Subtilisin A und BSA in 1 ml Homogenisierungspuffer für die Verwendung in der mitochondrialen Isolierungsverfahren gelöst.

Zwei Biopsieausstanzungen von Skelettmuskelgewebe unter Verwendung einer 6 mm Biopsie Punch ausreichend Mitochondrien für den Einsatz in der klinischen und chirurgischen Verfahren für therapeutische Interventionen ¹⁷-18. Um die Anzahl der Mitochondrien haben wir zwei Methoden, Hämozytometers und Partikelgrößenzählung verwendet zu schätzen. Die Verwendung Teilchengröße Zählung wird empfohlen. Die Partikelgrößenzähler verwendet elektrische Impedanz, um das Volumen der Partikel, die durch eine Öffnung einer festgelegten Größe zu messen. Die Partikelgrößenzähler ist teuer, aber bietet genaue und zuverlässige Schätzungen und ist benutzerunabhängig. Mitochondrienzahl von hemocytometry geschätzt ist wirtschaftlicher. Unsere Studien haben gezeigt, dass dieses Verfahren eine variable schätzt, dass etwa eine Größenordnung geringer als die unter Verwendung eines Partikelgrößenzähler erhalten werden. Wir haben auch festgestellt, dass die Zählungen, die durch Hämocytometer erhalten sind stark abhängig von dem Benutzer. Wir schlagen vor, dass eine konsistente Schätzungen sicherzustellen, dass alle zählt mit einer Zählkammer sollte von einer Person durchgeführt werden.

Wir haben ATP Assay-Kits gefunden, die zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion zu sein. Das Kit liefert alle notwendigen reagents und bietet eine einfache und schnelle Methode für die Bestimmung der metabolischen Aktivität von isolierten Mitochondrien. Die ATP-Assay liefert ähnliche Ergebnisse wie jene mit einem Clark-Elektrode erhalten und ist daher mit früheren Datenanalyse ^20-21 kompatibel.

Ein Hauptvorteil der mitochondrialen Trennprotokolls ist, dass es für die Isolierung eine hohe Ausbeute an lebensfähigen, Atmung zuständigen Mitochondrien frei von Verunreinigungen in weniger als 30 min. Differentialfiltration anstelle von Differential-Zentrifugation reduziert Verfahren Zeit. Andere Protokolle beinhalten verschiedene Zentrifugationsschritte mit insgesamt Isolation Zeit 60 min bis 100 min ^13-17. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist, dass Gewebehomogenisierung ist standardisiert. Die kommerzielle Gewebe Dissociator bietet eine standardisierte Zyklus und liefert konsistente und reproduzierbare Ergebnisse. Dies steht im Gegensatz zur manuellen Homogenisierung, die einer Benutzervariabilität undInkonsistenz. Unser Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien mit Gewebedissoziation und Differentialfiltration stellt einen Isolationszeitrahmen für klinische und chirurgische therapeutische Intervention ^17,18 kompatibel.

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien des Instituts behandelt. Wir haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

Diese Studie wurde von National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss HL-103542 und der BCH Anästhesie Research Foundation Distinguished Trailblazer Award an GAP unterstützt.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.