Diseksiyonu

Bu protokol Xenopus laevis neurulas gelen premigratory kranial sinir kret (NC) teşrih nasıl açıklanır. Bu eksplantlar, fibronektin ve in vitro kültürlenmiş üzerine kaplanır, ya da arka ana embriyolara aşılanabilirler. Bu teknik NC epitel-to-mezenşimin geçiş, göç, ve farklılaşma mekanizmaları eğitim veriyor.

Nöral krest (NC) nörülasyon sonunda epitel-to-mezenşimin geçiş (EMT) uğrar geçici bir dorsal nöral tüp hücre nüfusu, çeşitli organlara doğru yoğun göç ve türevlerinin birçok türleri (nöronlar, glia içine ayırır kıkırdak ve kemik, pigmentli ve endokrin hücreler). Bu protokol, in vivo ve in vitro NC gelişimini incelemek amacıyla, Xenopus laevis embriyolardan premigratory kafatası NC incelemek nasıl açıklar. Kurbağa modeli, erken gelişimini incelemek için birçok avantaj sunuyor; bol partiler embriyolar in vivo kazanç ve fonksiyon stratejileri kaybı öncesinde donör ve / veya ana embriyoların NC diseksiyon gen ifadesinin değiştirilmesine izin verir, hızla geliştirmek mevcuttur. NC Eksplantlar fibronektin üzerine kaplanmıştır ve in vitro çalışmalar için de kullanılabilir. Bir serumsuz ortam içinde tanımlanmış birkaç gün boyunca kültürlenebilir. Biz de Kuzey Carolina eksplantlarının geri greft nasıl açıklarin vivo NC göç ve farklılaşma çalışmak için ana embriyolara.

Sinir ucu (NC), embriyonun içinde nörülasyon sonunda nöral tüpünden çıkan geçici bir embriyonik hücre popülasyonu. NC şartname kontrol sinyalizasyon ve genetik olaylar gibi erken gastrulasyon olarak başlar. NC çevreleyen dorsal dokulardan gelen sinyaller tarafından nöral ve nöral olmayan ektoderm arasındaki sınırda belirtildi. Nörülasyon sonunda, Kuzey hücreleri epitel-to-mezenşimin geçiş (EMT) geçmesi ve yol gösterici ipuçları çevreleyen yanıt vererek kalıplaşmış yolları takip embriyo yoğun göç. Onların nihai hedefe ulaştığında, onlar türevleri, örneğin nöronlar, glia, kemik, kıkırdak, ve pigmentli hücrelerin ^1-5 geniş bir diziye ayırt. Çünkü birçok hücre tipleri ve embriyonik dokular, NC hücreleri gelişme herhangi bir aşamasında kusurları, indüksiyon nihai farklılaşma katkıları, neurocristopathies ⁶ adlı konjenital sendromlara neden olabilir. Dşartname, EMT, göç, ve farklılaşma - - farklı aşamalarında gelişen NC Xperimental manipülasyon neurocristopathies anlayışımızı geliştirmek ve potansiyel tedavi stratejileri tasarımı sağlayacaktır.

Xenopus laevis embriyo NC gelişimini incelemek için tercih edilen bir modeldir. Embriyoların çok sayıda elde etmek kolay, ve dış döllenme gelişme ilk adımlardan erişim sağlar. Birçok araç deneysel X işlemek için kullanılabilir embriyo gelişimini laevis. Kazanç fonksiyon-ve demonte gen erken blastulas bireysel hücrelerin microinjecting gerçekleştirmek kolaydır. Embriyonik dokular in vitro tekrar birleşme ^7-11 veya sırt-aşılama deneyleri ^12,13 için kesilebilir.

Bu protokol, biz X. premigratory kranial NC teşrih nasıl açıklar önce göç geç neurulas, laevis'den. Bu eksplantlar, fibronektin boru hattlar üzerinde kültürlenebiliriçinde göç ve farklılaşma çalışma d plakalar vitro deney koşullarında kontrol edilir. NC eksplantlan in vivo olarak göç ve farklılaşma çalışma normal veya manipüle ana embriyolara aşılanabilirler.

Deneyler bilimsel amaçlı ve değiştirme, azaltma ve arıtma uluslararası yerleşik ilkeleri ile kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin ulusal ve Avrupa yönetmeliğe uygun.

1.. Fibronektin kaplı kaplar ¹⁴ hazırlanması

1. Standart bir plastik Petri tabağı (çap: 40 x 11 mm) içine 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde sulandırılmış 10 mg / ml kültürü dereceli fibronektin Pipet 500 ml. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Not: sonraki görüntüleme için cam yemekleri veya cam lamelleri kullanarak, eğer bir 100 mg / ml fibronektin çözümü kullanın.
2. 1x PBS ile üç kez durulanır.
3. 1x PBS/0.1% Bovine Serum Albumin (BSA), 500 ml PBS ile değiştirin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. 1x PBS ile üç kez yıkayın.
5. 1x PBS ile doldurun ve (genellikle 24-48 saat) kullanılıncaya kadar 4 ° C'de tutun.

2. NC Eksplantlarından diseksiyonu

1. Hazırlama 3/4 Normal Amphibian Medium (NAM) (110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM MgSO _4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO _3, 0,2 X PBS, 50 mg / ml ) ^10,15 gentamisin. 4 ° C'de diseksiyonu, mağaza için en fazla 1 hafta devam etmeyin Eski NAM agaroz kaplı diseksiyon yemekler (aşağıda) hazırlanması için kullanılabilir.
2. 3/4 NAM içinde% 2 agaroz 10 ml ile kaplanmış diseksiyon için 60 mm Petri kapları, hazırlayın.
3. Diseksiyon araçları toplamak: plastik Pasteur pipet, bir güzel böcek pin pin tutucu (referans için malzemeler tabloya bakınız), (bir cam Pasteur pipet ¹⁶ ucundaki parafin gömülü kaş saç ile yapılan) bir "kaş bıçak", iki ince üzerine monte diseksiyon forseps, P1000 pipet ve ipuçları, 50 büyütme 8-40X ile bir dürbün steroskop, optik lifler kılavuzları ile parlak bir ışık kaynağı. Tüm kesme aletleri temiz tutulmalı, her deneyden sonra, distile su ile iki kez wi yıkayın% 100 etanol inci ve kurumaya bırakın. Tozdan uzak saklayın.
4. Neredeyse tepesine taze NAM diseksiyon çanak doldurun.
5. X'i elde standart prosedürler ¹⁰ ve onlar (Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre ¹⁷⁾ neurula aşamasına 16 olana kadar onları yaş göre embriyolar laevis'den.
6. 16 embriyolar plastik Pasteur pipet kullanarak diseksiyon çanak içine sahne yerleştirin.
7. Binoküler kapsamında sonraki tüm adımları uygulayın. Forseps iki çift vitellin membran çıkarın. Embriyoların dorsal kısmını zarar vermemek için dikkatli olun.
8. Embriyolar diseksiyon başlamak aşamada 17 ulaşana kadar bekleyin. Sinir ucu açık bir şekilde daha erken aşamalarında aksine, nöral borudan ayrılmış olduğu için Aşama 17 uygundur. 17 sahne sonra, NC göç ve çevredeki mezenşimin ile karışmasının başlar.
9. Korumak amacıyla embriyolar için bir niş yapmak için forseps ile agaroz küçük bir delik kazmakdiseksiyonu sırasında onları. Tek embriyo dorsal yüzü yukarı yerleştirin. Not: modelleme kil yerine agaroz bir delik kazma embriyolar korumak için de kullanılabilir.
10. Kaş bıçak ve böcek iğne ile anterior nöral kıvrımın yan kısmında bir kesi yapmak. Derin embriyonun içine de gitmek için dikkatli olun: 2-3 hücre tabakası (! Archenteron olarak derin ulaşmak asla) kesti hedefliyoruz. Bütün diseksiyon işlemi sırasında kesilmiş dokuları X yana hava-sıvı arayüzü ile temas girmesine izin hiçbir laevis embriyonik dokular, yüzey gerilimi ile lize edilmiştir.
11. Sinir daha dorsal kısmında paralel ikinci bir kesi aynı araçları kullanarak kat olun.
12. Gerekirse, 90 ° etrafındaki çanak çevirin. İlk iki kesiler arka tarafında, kaş bıçak ve böcek iğne ile üçüncü dikey kesi olun. NC lateral, ektoderm pigmentli dış tabakasının altında hücreleri kalın bir kütledirnöral tüp.
13. Üçüncü yarık kenarından başlayarak temel nc pigmentli ektoderm tabaka ayırmak için kaş bıçak ucu kullanın.
14. Üçüncü kesi başlayarak NC dokuyu ayırmak için kaş bıçak tarafını kullanın. Yatan sefalik mezoderm beyaz ise NC doku, oldukça grimsi olduğunu. Dikkatle mezodermden NC ayrı.
15. Optik vesicle itibaren öne NC doku ayırmak ve eksplant boşaltmak için bu düzeyde kesti. In situ hibridizasyon ile, bazı eksplantlarında snail2 ifadesi (bir standart işaretleyici NC) kontrol ilk deneyler, bir kontrol olarak, tavsiye edilir.

3. FİBRONEKTİN üzerine kaplama Eksplantlarındaki

1. Dolgu fibronektin kaplı tabak Modifiye Danilchick Ortamı (MDM, 53 mM NaCl, 5 mM Na2CO _3, K Glukonat 4.5 mM, 32 mM Na Glukonat, MgSO ₄ 1 mM _CaCl2, 1 mM, BSA% 0.1 ile, pH ayarlamak 1 M bisin ile 8.3 ' ^18).
2. P1000 pipet kullanarak fibronektin kaplı çanak içine eksplantlarının aktarın. Eksplantlar hava-sıvı arayüzü dokunmasına izin vermeyin. İlk olarak, daha sonra bir sıvı tekrar, eksplantlar, daha sonra ucu içine bir sıvı pipetle. Fibronektin kaplı çanak içine eksplantlarm aktarılırken ucu içine herhangi bir hava izin vermeyin. Ucu fibronektin kaplı yemeğin sıvı içinde sonra, eksplantlan yavaş yavaş yerçekimi tarafından aşağı gidelim, ya da çok hafifçe itin. Çok hızlı eksplantlarının fırlatıp kaçının.
3. Kaş bıçak kullanarak çanak 10-30 eksplantlarının yerleştirin. Sonraki görüntüleme için yeterli değildir yemeğin tarafı, kaçının.
4. Eksplant (yaklaşık 15-30 dakika sürer) fibronektin takılı kadar çanağı hareket çalışın. Gerekirse, çok dikkatli çanağı hareket.
5. (Sıcaklık grafik ¹⁷ görmek için 15-20 ° C arasında) bir soğutmalı inkübatör tabak yerleştirin. 15 ° C'de yerleştirilir, hücreler are genellikle verimli bir şekilde göç ve inkübasyon 6 saat sonra, saçılma (bu zamanlama deneyler arasında değişebilir).

4. Ana embriyolara eksplantlarındaki Aşılama

1. Kaba forseps kullanarak çok küçük parçalar halinde ince bir cam lamel kesti. Parçalarının büyüklüğü yaklaşık 1.5 ^mm2 olmalıdır. Forseps kullanarak 3/4 NAM veya PBS içeren bir Petri kabı içine parçaları daldırın.
2. Ev sahibi embriyo Hazırlanması: vitellin membran kaldırılması ve NC diseksiyon sırasında ev sahibi embriyo zarar vermemek için özel bakım) ile 3 açıklandığı gibi 3/4 NAM içinde ana NC teşrih. Donör embriyo diseksiyon sırasında ev sahibi embriyo kısmen iyileşmek istiyorum: doku gerginlik ablasyon boyutunu artırmak eğilimindedir.
3. Protokol 3'te tarif edildiği gibi bir agaroz kaplı tabak içinde veya aynı çanak başka bir yerinde, donör embriyo NC eksplant teşrih. Açıklandığı gibi, dikkatle konağı içeren çanak içine NC grefti aktarınProtokolü 3.
4. Hemen forseps kullanarak ev sahibi ablasyon alanı üzerine NC eksplant yerleştirin. Eksplant kısmen eklemek gerekir. Yerine greft korumak için aşılanmış embriyo üzerine cam lamel bir parça koyun. Hasar görmelerini önlemek için embriyo daha büyük bir cam parçası seçin. Embriyo basık biraz olacaktır.
5. En az 15-20 dakika bekleyin, sonra yavaşça lamel kaldırmak. Embriyo başka bir 10 dakika boyunca geri olsun ve dikkatli bir şekilde plastik Pasteur pipeti kullanılarak, 3/4 NAM dolu temiz bir tabak içine pipetle.

Fibronektin üzerinde kaplama yaparken, nöral krest eksplantlar hızla (15-30 dakika) takın ve eksplant 2 saat (Şekil 1A) dahilinde düz yayılır. 3-6 saat hücreler dağılmaya başlar sonra. 15 ° C'de 24 saat sonra, hücreler, bir çok uzak eksplant (Şekil 1B ve 1C) göç etmeye başlamıştır. Sarısı faz kontrast (Şekil 1B) altında hücreleri çok parlak yapar. Hücre çıkıntıların (filopodes ve lamellipodes) aktin hücre iskeletinin (Şekil 1C) lekelenmesini falloidin sonra açık bir şekilde görülebilir.

Ortotopik aşılama deneyde, verici embriyolar etiketsiz ana embriyo hücreleri aşılanmış takip etmek amacıyla GFP mRNA enjekte edilmiştir. Kafatası NC konakçının bir tarafında ablasyon, 30-60 dakika ameliyat sonrasında greft ablasyon ana kafa NC (Şekil 1D, aşılama sonrası 2 saat) yerine, iyileştikten. Birkaç saat sonra, GFP-pozitif hücrelerin göçdışarı ekspfanttan ve ventral kraniofasial yerlerde (Şekil 1E) doğru NC hücrelerin basmakalıp göç yollarını izledi. Iribaşlara, Kuzey-türetilmiş kraniofasiyal yapılar (Şekil 1G) geliştirdik. Kafatası NC ablasyon, bu yapılar çimento bezinin (Şekil 1 H, kırmızı oklar) bitişik gözle kısaltılmış yüz sonuçlanan eksik. Aşılanmış tetarlar olarak, verici NC hücreler normal yüzey morfolojisi (Şekil 1F ve 1I, yeşil oklar) sonuçlanan kranyo-yüz yapıları katkıda bulunmuştur.

Şekil 1.. In vitro ve eksplante kranial NC in vivo davranış. AC)   Premigratory NC disseke edildiBir sahne 17 neurula embriyo ve fibronektin kaplı çanak. A) kaplamadan sonra 2 saat üzerine kaplama, eksplant bağlı ve yayılma gelmiştir. B) 24 saat sonra kaplama, hücreleri verimli fibronektin üzerinde göç etmiştir. C) lamellipodia ve filopodia . açık DI) neurula aşama Phalloidin (yeşil) ile etiketlenmiş NC hücrelerin göç görülür 17 GFP + premigratory NC bir GFP-enjekte embriyo alınır ve kafatası NC aşamada 17 de ablasyon hangi bir konakçı embriyo haline geri-aşılı edildi etiketli - 18. D) İki saat sonra aşılama, eksplant iyileştikten. EF) Aşılı NC hücreleri aktif olarak dışarı göç ve iribaş aşamada 31 ve 41. G) Kontrol aşama 41 iribaş gösterildiği gibi çene akışı doldurulan. H) NC etti Kesip yüz ve göz gelişimi dramatik bir başarısızlıkla sonuçlandı (H: unutmayın çimento Gland nedeniyle çene alanı, Kırmızı okları doldurma NC hücrelerin eksikliği, göze komşu geliştirir. .) G iribaş kontrol etmek karşılaştırmak F, I) Buna karşılık, aşılı NC hücreler göz ve kraniofasial yapıları geliştirme (F, I, yeşil oklar) restore AC, Ölçek bar = 100 mm;. DI, Ölçek bar = 1 mm . D, dorsal görünümü. EI, yan bakıldı. Bu rakam Milet ve diğ modifiye edilmiştir. ^12. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Bu protokol X. laevis embriyoların premigratory kranial NC eksplantasyona kolay bir teknik anlatılmaktadır. Bu tür deneyler için kullanılan embriyo sağlam olması ve iyileştirmek gerekir. Sağlıksız embriyoların herhangi bir toplu atın. Buna ek olarak, ve daha sonraki bir aşamada 17 nöral tepe tüketim için, (12 ile 18-20 ° C) çeşitli sıcaklıklarda embriyolar büyür. 17 sahne sonra, nöral krest sefalik mezoderm ile karıştırılabilir ve tamamen kaldırılamaz. Ksenopus dokuları çabuk iyileşmesi ve daha sonra diğer dokulara yapışıklıklarını gevşek. Bu, hızlı bir çalışma ve kısa sürede donörden eksize edilir olarak konakçıya nöral tepe eksplantlar için önemlidir.

Vitro deneylerde ilişkin, fibronektin kültür yemekleri birkaç gün sonra bakteri veya mantar ile kontamine alabilirsiniz. Mümkün olduğunca sık antibiyotik ve temiz veya steril malzeme ve çözümleri kullanın.

Bu prosedür, f optimizeveya kranial nöral krest. Nitekim, bu hücre popülasyonu iyi tanımlanmış ve 17 sahne Xenopus embriyolar lokalize olur. Ne yazık ki, bu model gövde NC tür deneyler gerçekleştirmek için uygun değildir. Kuş embriyolar gibi gövde NC hücre popülasyonu manipüle ilgilenen olanlar için daha uygundur.

Bu protokol açıklanan eksplantları, in vivo ve in vitro olarak hem de, Kuzey Carolina davranışının çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir. NC moleküler gelişim programı büyük ölçüde omurgalıların ¹⁹ muhafaza edilir. Kurbağa gelişme omurgalı NC EMT, göç ve farklılaşmayı çalışmak için güçlü bir modeldir. X. laevis embriyonik hücreler, herhangi bir harici bir besin ilavesi birkaç gün boyunca in vitro hayatta kalma izin verecek kadar sarısı içerir. Bu nedenle, in vitro çalışmalar, basit ve tam olarak kontrollü bir kültür ortamı içinde, çeşitli büyüme faktörleri ya da kimyasal bileşiklerin etkisini test edebilir. Bu tür deneyler olmuşturBu yaklaşım aynı zamanda geliştirilmiş yönettiği NC farklılaşma protokolleri tasarlamak için kullanılan sinyal yolları, vb ^14,20-24 aktive ya da engelleme, kemo-cezbedici ya da kemo-kovucular etkilerini inceleyerek dahil EMT ve göç, analiz etmek için tasarlanmıştır. , Rejeneratif tıp için çeşitli protokoller geliştirmek NC-türevi hücre tipleri, in vitro olarak anlaşılması için, ilaç taramasında kullanılabilir elde etmek ve neurocristopathies ^25,26 tedavi bağlamında.

NC kalkınma çevre dokulara hücre özerk düzenlemeler ve sinyalleri arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra. Donör NC veya ana embriyoda ya da gen ekspresyonunun deneysel manipülasyonlar, Kuzey Carolina gelişme noncell özerk açıdan seçici hücre özerk izin verir. Kazanç fonksiyon-ve knock-down birleştiren in vitro kültür için bu protokol yaklaşımları ve in vivo grefti başarıyla kullanmak olmuşturd ^{14,21,23,27-36.}

Bu teknik, ana embriyolara diğer dokuları aşı ve göç ve farklılaşma potansiyelleri test etmek için uyarlanabilir. Örneğin, NC gelişimi için bir asgari transkripsiyonel anahtarı aramak için pluripotent blastocoel çatı ektoderm ("hayvan kap") kullandık. Biz NC bağlılık ve sonraki gelişimi üzerinde iki transkripsiyon faktörleri, pax3 ve zic1, etkisini inceledik. Pax3 ve zic1 kazanç fonksiyon-ile hayvan kapaklar in vitro fibronektin üzerinde kaplama veya ana embriyolara backgrafted edildi. Biz Pax3/Zic1-induced hücreleri göç ve in vitro ve in ana embriyoların ¹² hem de iyi niyetli NC hücreleri gibi ayırt bulundu.

NC EMT ve göçü yöneten çok sayıda moleküler mekanizmaları da kanser ³⁷ metastatik yayılması katılıyor. Bu protokol sunmayı amaçlayan basit, ucuz ve efficigelişimsel biyologlar ve bu anahtar hücre davranışlarının temel mekanizmalarını keşfetmek için diğer araştırmacılar için Yönetim aracı.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yazarlar yararlı tartışmalar ve Institut Curie'nin Hayvan Tesisi için fibronektin, Eric Theveneau üzerinde eksplant resimler için Adeline Dolly teşekkür ederim. CM Bölge Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Pole Stem), Universite Paris Sud (Ataşesi TEMPORAIRE d'Enseignement et de Recherche) ve Agence Nationale de la Recherche bir doktora sonrası adam. Bu çalışma Universite Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (Aksiyon thématique ve teĢvik sur Programı), Dernek dökün la Recherche contre le Kanser Grant SFI20101201882, Ligue contre le Kanser ve Agence Nationale de la tarafından finanse edildi Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programı Blanc).