Dissection של

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.

הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים בצינור עצבי הגבי חולפת שעוברת מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) בסוף neurulation, נודד בהרחבה לאיברים שונים, ומבדיל בסוגים רבים של מכשירים נגזרים (נוירונים, גליה, סחוס ועצם, תאי פיגמנט ומערכת האנדוקרינית). בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory מעוברי Xenopus laevis, במטרה ללמוד פיתוח NC in vivo ו במבחנה. מודל הצפרדע מציע יתרונות רבים ללמוד פיתוח מוקדם; קבוצות בשפע זמינות, עובר לפתח במהירות, in vivo רווח והפסד של אסטרטגיות פונקציה לאפשר מניפולציה של ביטוי גנים לפני לנתיחה NC בתורם ו / או עוברי מארח. יכול להיות מצופה explants NC בפיברונקטין ומשמש למחקרים במבחנה. הם יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים במדיום מוגדר חופשי בסרום. אנו גם מתארים כיצד להרכיב explants NC בחזרהלעוברי מארח לחקר נדידת NC ובידול in vivo.

הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת העולה מהצינור העצבי בסוף neurulation בעוברי החולייתנים. אירועי האיתות וגנטיים המפקחים על מפרט NC להתחיל מוקדם ככל gastrulation. NC זו שצוין בגבול בין עצבי והאאקטודרם אינו עצבי על ידי אותות מרקמות גב שמסביב. בסופו של neurulation, תאי NC לעבור מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) ולהעביר בהרחבה בעובר בעקבות מסלולים סטריאוטיפיים על ידי היענות לרמזים המקיפים מנחים. ברגע שהם הגיעו ליעד הסופי שלהם, הם להתמיין למגוון רחב של מכשירים פיננסיים נגזרים, למשל תאי עצב, גליה, עצם, סחוס, ותאי פיגמנט ^1-5. בגלל תרומתם לסוגי תאים רבים וברקמות עובריים, פגמים בכל שלב בהתפתחות תאי NC, מאינדוקציה להתמיינות סופית, יכול לגרום לתסמונות מולדים בשם neurocristopathies ^6. Eהמניפולציה xperimental של NC הפיתוח בשלבים שונים - מפרט, EMT, הגירה, ובידול - תשפר את ההבנה של neurocristopathies ולאפשר עיצוב של אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

עובר laevis Xenopus הוא מודל של בחירה ללמוד פיתוח צפון קרוליינה. מספר גדול של עוברים הם קלים להשגה, והפריה חיצונית נותנת גישה לשלבים הראשונים של פיתוח. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני X. laevis התפתחות עוברית. גן רווח של פונקציה ומציאה קל לביצוע על ידי microinjecting תאים בודדים של blastulas המוקדם. רקמות עוברי ניתן לחתוך לאיחוד מחדש במבחנה ^7-11 או מבחני גב השתלת ^12,13.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory בX. laevis מאוחר neurulas, לפני ההגירה. יכול להיות מתורבת explants אלה על פיברונקטין-coateצלחות ד ללמוד הגירה והבחנה שבשליטה בתנאי ניסוי מבחנה. יכול גם להיות מורכב explants NC לעוברי מארח נורמלים או מניפולציה כדי ללמוד ההגירה והבידול שלהם in vivo.

ניסויים לעמוד ברגולציה לאומית ואירופית בהגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות ועם עקרונות שנקבעו בעולם של החלפה, הפחתה ועידון.

1. הכנת מאכלים מצופים פיברונקטין ¹⁴

1. פיפטה 500 מיליליטר של פיברונקטין 10 תרבות הכיתה מ"ג / מיליליטר מדולל ב1x בופר פוספט (PBS) לתוך צלחת פטרי פלסטיק סטנדרטית (Ø 40 x 11 מ"מ). לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. הערה: אם משתמש בכלים מזכוכית או coverslips זכוכית להדמיה הבאה, להשתמש בפתרון פיברונקטין 100 מ"ג / מיליליטר.
2. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
3. החלף PBS עם 500 מיליליטר של% PBS/0.1 1x הסרום אלבומין שור (BSA). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
4. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
5. מלא עם 1x PBS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (בדרך כלל ל24-48 hr).

2. Dissection של Explants NC

1. הכינו את 3/4 רגיל אמפיבי בינוני (NAM) (110 mM NaCl, 2 מ"מ KCl, 1 מ"מ Ca (NO _{3) 2,} 1 מ"מ MgSO _4, 0.1 mM EDTA, 1 מ"מ NaHCO _3, 0.2X PBS, 50 מ"ג / מיליליטר gentamycin ^10,15). אל תשמרו בשבוע יותר מ 1 לנתיחה, לאחסן ב 4 ° C. NAM המבוגר יותר יכול לשמש להכנת מאכלים לנתיחה מצופה agarose (להלן).
2. הכן 60 מ"מ צלחות פטרי לנתיחה, מצופות ב10 מיליליטר של 2% agarose ב3 / 4 NAM.
3. לאסוף כלים לנתיחה: טפטפות פסטר מפלסטיק, סיכת חרקים הטובה ביותר רכוב על בעל פינים (ראה טבלת חומרים לעיון), "סכין גבה" (שנעשה עם שיער גבה המוטבע פרפין בקצה של זכוכית פיפטה פסטר ^16), שני בסדר מלקחיים לנתיחה, פיפטה P1000 וטיפים, stereoscope משקפת עם הגדלה 8-40X ל50, מקור אור בהיר עם מדריכי סיבים אופטיים. יש לשמור את כל הכלים לנתח נקיים; לאחר כל ניסוי, יש לשטוף אותם פעמיים עם מים מזוקקים, ברגע שwiה 100% אתנול ולתת להתייבש. לאחסן הרחק מאבק.
4. מלא את הצלחת לנתיחה עם NAM הטרי כמעט עד לפסגה.
5. השג X. laevis עוברים על פי נהלים קבועים ¹⁰ וגילם עד שהם מגיעים neurula שלב 16 (על פי טבלה התפתחותית Nieuwkoop ופייבר ^17).
6. הנח שלב 16 עוברים לתוך הצלחת לנתיחה באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק.
7. לבצע את כל השלבים הבאים בהיקף המשקפת. להסיר את קרום vitelline עם שני זוגות מלקחיים. היזהר שלא לגרום נזק לחלק הגבי של העוברים.
8. חכה עד שהעוברים הגיעו שלב 17 להתחיל הנתיחה. שלב 17 מתאים מאז הרכס העצבי באופן ברור מוגדר מלבד הצינור העצבי, בניגוד לשלבים מוקדמים יותר. לאחר שלב 17, צפון קרוליינה מתחילה נודדת ומתערבב עם mesenchyme שמסביב.
9. לחפור חור קטן בagarose עם מלקחיים כדי להפוך את נישה לעוברים על מנת לשמור עלשלהם במהלך הניתוח. הנח בצד את גב עובר אחד. הערה: הפלסטלינה ניתן להשתמש כדי לשמור את העוברים במקום לחפור בור לagarose.
10. עושה חתך בחלק הצדדי של הקפל העצבי הקדמי עם סכין הגבה וסיכת החרק. היזהר שלא ללכת יותר מדי עמוק לתוך העובר: מטרה לחתוך 2-3 שכבות תא (לעולם לא יגיע עמוק כמו archenteron!). במהלך תהליך הנתיחה השלם, לא לאפשר רקמות גזורים להיכנס במגע עם ממשק האוויר הנוזלי מאז X. רקמות עוברי laevis הן lysed על ידי מתח פנים.
11. לעשות חתך במקביל שני בחלק הגבי יותר מעצבי לקפל באמצעות אותם מכשירים.
12. במידת הצורך, מכוון את צלחת לווין סביב 90 מעלות. לעשות חתך בניצב שלישי עם סכין הגבה וסיכת החרקים, בצד האחורי של שני החתכים הראשונים. צפון קרוליינה היא מסה עבה של תאים מתחת לשכבה החיצונית של פיגמנט האאקטודרם, לרוחבלצינור העצבי.
13. השתמש בקצה של סכין הגבה לנתק את שכבת האאקטודרם פיגמנט מNC הבסיסי, החל מקצה החתך השלישי.
14. השתמש בצד השני של סכין הגבה כדי לנתק את רקמות NC החל מהחתך השלישי. רקמת NC היא די אפרפרה, בעוד המזודרם cephalic שבבסיס הוא לבן. להפריד את צפון קרוליינה בזהירות מן המזודרם.
15. לנתק את רקמת NC anteriorly מהשלפוחית ​​אופטית, ולחתוך ברמה זו כדי לשחרר את explant. כביקורת לניסויים הראשונים, בדיקת ביטוי snail2 (סמן NC הקנונים) בכמה explants ידי הכלאה באתר מומלץ.

3. Explants ציפוי על פיברונקטין

1. למלא את הצלחת מצופה פיברונקטין עם Danilchick בינוני שונה (MDM, NaCl 53 מ"מ, Na2CO ₃ 5 מ"מ, K גלוקונאט 4.5 מ"מ, Na גלוקונאט 32 מ"מ, MgSO ₄ 1 מ"מ, ₂ מ"מ CaCl 1, BSA 0.1%, להתאים את ה-pH .8.3 עם 1 M Bicine ^18).
2. העבר את explants לתוך הצלחת מצופה פיברונקטין באמצעות פיפטה P1000. לעולם אל תאפשר explants לגעת בממשק האוויר הנוזלי. ראשית, פיפטה כמה נוזל לתוך הקצה, אז explants, אז כמה נוזל שוב. אל תאפשר לאף אוויר לקצה בעת העברת explants לתוך הצלחת מצופה פיברונקטין. ברגע שהקצה נמצא בנוזל של המנה מצופה פיברונקטין, בואו explants לרדת באיטיות על ידי כוח הכבידה, או לדחוף בעדינות רבה. הימנעו להוציא explants מהר מדי.
3. הנח 10-30 explants בצלחת באמצעות סכין הגבה. הימנע מהצדדים של המנה, שהם לא מתאימים להדמיה הבאה.
4. נסה לא להזיז את הצלחת עד explants צירפו בפיברונקטין (זה לוקח בערך 15-30 דק '). במידת הצורך, להעביר את הצלחת בזהירות רבה.
5. מניחים את הצלחת בחממה בקירור (בין 15-20 ° C, לתרשים טמפרטורה רואה ^17). כאשר הניחו ב15 מעלות צלזיוס, תאי arדואר בדרך כלל נודד ביעילות ובפיזור לאחר 6 שעות של דגירה (תזמון עשוי להשתנות בין ניסויים).

4. השתלת Explants לעוברי מארח

1. חותכים coverslip זכוכית עדין לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מלקחיים גסים. הגודל של החתיכות צריך להיות כ 1.5 מ"מ ^2. לטבול את החתיכות לתוך צלחת פטרי המכילה 3/4 NAM או PBS באמצעות מלקחיים.
2. הכנת עובר המארח: לנתח את המארח NC ב3 / 4 NAM כמתואר ב3) עם טיפול מיוחד שלא לפגוע בעובר המארח תוך הסרת קרום vitelline ולנתח את צפון קרוליינה. מתח הרקמות נוטה להגדיל את הגודל של אבלציה: בואו עובר המארח לרפא באופן חלקי בזמן לנתח את עובר התורם.
3. בצלחת מצופה agarose אחר או בחלק אחר של אותה המנה, לנתח את explant NC מעובר התורם כפי שתואר בפרוטוקול 3. העבר את שתל NC לתוך הצלחת המכילה את המארח בזהירות, כפי שתואר בפרוטוקול 3.
4. מייד למקום explant NC על אזור ablated המארח באמצעות מלקחיים. Explant צריך לצרף באופן חלקי. שים חתיכת הזכוכית coverslip על העובר מורכב כדי לשמור על השתל במקום. בחר חתיכת זכוכית גדולה יותר מהעובר, כדי למנוע פגיעה בו. העובר יהיה קצת שטוח.
5. לחכות לפחות 15-20 דקות, ולאחר מכן להסיר בעדינות את coverslip. בואו העובר להתאושש עוד 10 דקות ו פיפטה בזהירות אותו לתוך צלחת נקייה מלאה 3/4 NAM, באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק.

כאשר מצופים על פיברונקטין, explants הרכס העצבי לצרף במהירות (15-30 דק ') וexplant מתפשט שטוח בתוך שעה 2 (איור 1 א). אחרי 3-6 תאי שעות יתחילו להתפזר. ב24 שעות ב15 מעלות צלזיוס, תאים רבים החלו להגר מן explant (איורים 1B ו 1C). חלמון גורם לתאים בהירים מאוד תחת בניגוד שלב (איור 1). בליטות תא (filopodes וlamellipodes) נראות בבירור לאחר phalloidin הכתמה של שלד התא אקטין (תרשים 1C).

לצורך ניסוי השתלת orthotopic, עובר התורם הוזרקו עם GFP-mRNA על מנת לעקוב אחר התאים המורכבים בעובר המארח ללא תווית. NC הגולגולת היה ablated בצד אחד של המארח; 30-60 דקות לאחר ניתוח השתל הגליד, החלפת מארח ablated NC גולגולת (איור 1D, 2 שעות לאחר השתלה). כמה שעות לאחר מכן, תאי ה-GFP החיובי היגרומ explant ואחרי מסלולי נדידה הסטריאוטיפיות של תאי NC כלפי מקומות הגחון craniofacial (איור 1E). בראשנים, מבני craniofacial נגזרו-NC פיתחו (איור 1G). כאשר NC גולגולת היה ablated, מבנים אלה היו חסרים, וכתוצאה מכך פנים קיצרו עם עין סמוכה לבלוטת המלט (איור 1H, חיצים אדומים). בראשנים מורכבים, תאי NC התורם תרמו למבני קרניו-פנים, וכתוצאה מכך פנים מורפולוגיה נורמלית (1F דמויות ו1I, חיצים ירוקים).

איור 1. במבחנה בהתנהגות vivo של NC גולגולת explanted. AC)   Premigratory NC היה גזורמ עובר neurula שלב 17 ומצופים על צלחת מצופה פיברונקטין.) 2 שעות לאחר ציפוי, explant צרף ולהתפשט. B) 24 שעות לאחר ציפוי, תאים היגרו ביעילות על פיברונקטין. C) lamellipodia וfilopodia נראים בבירור בתאים נודדים NC שכותרתו עם phalloidin (ירוק) שלב DI) Neurula 17-GFP + כותרת NC premigratory נלקח מעובר המוזרק GFP וגב מורכבים לעובר מארח, שממנו NC הגולגולת היה ablated בשלב 17. - 18. ד ') שעתיים לאחר ההשתלה, explant הגליד. תאי EF) מורכבים NC היגרו באופן פעיל ומאוכלסים זרם mandibular כפי שמוצגים בשלב ראשן ביום 31 וב41. שלב G) בקרה 41 ראשן. H) ablating NC יש הביא לכישלון דרמטי של פני ופיתוח העין (H: שים לב שglan המלטד מפתחת סמוך לעין, בשל חוסר בתא NC אכלוס אזורי הלסת, חצים אדומים. . השוואה לשלוט ראשן בG) F, I) בניגוד לכך, תאי NC המורכבים החזירו את העין ופיתוח מבנים craniofacial (F, אני, חיצים ירוקים) AC, ברים בקנה מידה = 100 מ"מ;. DI, בר = 1 מ"מ בקנה מידה . ד ', צפה בגב. EI, תצוגות צד. נתון זה שונה מMilet et al. ¹² אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול זה מתאר טכניקה קלה explant NC גולגולת premigratory בעוברי laevis X.. העוברים המשמשים לניסויים כאלה צריכים להיות חזקים ולרפא היטב. לבטל את כל אצווה של עוברים בריאים. בנוסף, לגדול עוברים בטמפרטורות שונות (מ -12 ל 18-20 ° C), על מנת לכרות רכס עצבי בשלב 17 ולא מאוחר יותר. לאחר שלב 17, רכס עצבי עשוי להיות מעורב עם המזודרם cephalic ולא ניתן להסיר לחלוטין. רקמות Xenopus לרפא במהירות ולאחר מכן משוחררת ההידבקות שלהם לרקמות אחרות. חשוב לעבוד במהירות ומקום explants הרכס העצבי לתוך המארח ברגע שהוא נכרת מהתורם.

בנוגע לניסויים במבחנה, מנות תרבות פיברונקטין יכולות לקבל מזוהמות בחיידקים או פטריות אחרי כמה ימים. שימוש בחומרים ופתרונות אנטיביוטיקה ונקיים או סטרילי לעתים קרובות ככל האפשר.

הליך זה הוא מותאם fאו רכס עצבי גולגולתי. ואכן, אוכלוסיית תא זו מוגדרת היטב ומקומי בשלב 17 עוברי Xenopus. למרבה הצער, דגם זה אינו מתאים לביצוע ניסויים כאלה בתא המטען NC. עוברי ציפור מתאימים יותר למי שמעוניין במניפולצית אוכלוסיית תא כזה תא מטען NC.

Explants המתואר בפרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של התנהגות NC, גם in vivo ו במבחנה. התכנית התפתחותית המולקולרית NC נשמרת במידה רבה בבעלי חוליות ^19. פיתוח צפרדע הוא מודל רב עוצמה כדי לחקור EMT NC חוליות, הגירה ובידול. X. תאים עובריים laevis מכילים מספיק חלמון כדי לאפשר את הישרדותם במבחנה במשך כמה ימים ללא תוספת של כל חומר מזין חיצוני. לפיכך, במבחנה יכולה לבדוק את ההשפעות של גורמי גדילה שונים או תרכובות כימיות, במדיום תרבות פשוט ושליטה מלאה. ניסויים כאלה היונועד לנתח EMT והגירה, ובכלל זה לומד את ההשפעות של הכימותרפיה משיכה או הכימותרפיה דוחי, של הפעלה או חסימת מסלולי איתות, וכו ^'14,20-24 גם גישה זו יכולה לשמש כדי לתכנן השתפרו פרוטוקולי בידול NC בבימויו. בהקשר של פיתוח פרוטוקולים לרפואת רגנרטיבית, קבלת סוגים שונים הנגזרים-NC תאים במבחנה יכול לשמש בהקרנת סמים להבנה ולטיפול בneurocristopathies ^25,26.

פיתוח NC הוא בניצוחו של יחסי גומלין מורכבים בין תקנות אוטונומיות תא ואותות מן הרקמות הסובבות. מניפולציות ניסיוני של ביטוי גנים, או בתורם NC או בעובר המארח, לאפשר תא להפלות אוטונומי מהיבטים אוטונומיים noncell של פיתוח צפון קרוליינה. שילוב של עלייה של פונקציה ולדפוק למטה מתקרב לפרוטוקול זה לתרבות במבחנה בהשתלה vivo כבר להשתמש בהצלחהד ^{14,21,23,27-36.}

טכניקה זו יכולה להיות מותאמת ללהשתיל רקמות אחרות לעוברי מארח ולבדוק את פוטנציאל הנדידה והתמיינותם. לדוגמא, יש לנו להשתמש האאקטודרם pluripotent blastocoel הגג ("הכובע של בעלי החיים") כדי לחפש את מתג תעתיק מינימאלי לפיתוח צפון קרוליינה. יש לנו בחנו את ההשפעה של שני גורמי שעתוק, PAX3 וzic1, על מחויבות של NC ופיתוח שלאחר מכן. כובעי חיה עם PAX3 וzic1 לזכות-of-פונקציה היו מצופים על פיברונקטין במבחנה או backgrafted לעוברי מארח. מצאנו כי תאי Pax3/Zic1-induced להגר ולהבדיל כמו תום לב תאי NC הן במבחנה בעוברי מארח ^12.

מנגנונים מולקולריים השולטים במספר רב של EMT NC והגירה מעורבים גם בהפצת גרורתי בסרטן ^37. פרוטוקול זה מטרתו לספק דרך פשוטה, זול וefficiכלי ent עבור ביולוגים התפתחותיים וחוקרים אחרים לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התנהגויות תא מפתח אלה.

יש המחברים אין לחשוף.

המחברים מודים אדלין דולי לתמונות של explant על פיברונקטין, אריק Theveneau לדיונים מועילים ומתקן בעלי החיים של מכון קירי. CM הוא בחור דוקטורט של אזור איל דה פראנס (Domaine d'interet Majeur גזע פולני), אוניברסיטת פריז Sud (נספח ד 'הזמנית של Enseignement et de משוכלל ונדיר), וסוכנות ידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר. עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה לפריז Sud (Attractivite 2011), המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (תכנית הפעולה Thematique et sur Incitative), איגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le הסרטן גרנט SFI20101201882, Ligue contre le הסרטן, וסוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר התכנית בלאן).