Dissecção

Este protocolo descreve como dissecar crista neural craniana premigratory (NC) de Xenopus laevis neurulas. Estes explantes podem ser semeadas em fibronectina e cultivadas in vitro, ou enxertados em embriões hospedeiros. Esta técnica permite estudar os mecanismos da transição epitélio NC-to-mesênquima, migração e diferenciação.

A crista neural (NF) é uma população de células do tubo neural dorsal transiente que sofre uma transição epitélio para mesênquima (EMT) no final de neurulação, migra extensivamente para vários órgãos, e diferencia-se em vários tipos de derivados de (neurónios, células da glia, cartilagem e osso, as células pigmentadas e endócrino). Neste protocolo, descrevemos como dissecar o premigratory craniano NC a partir de embriões de Xenopus laevis, a fim de estudar o desenvolvimento NC in vivo e in vitro. O modelo sapo oferece muitas vantagens para estudar o desenvolvimento precoce; lotes abundantes estão disponíveis, os embriões se desenvolvem rapidamente, no ganho vivo e perda de estratégias de função permitem a manipulação da expressão gênica antes NC dissecção em doador e / ou embriões de acolhimento. Os explantes de NC podem ser semeadas em fibronectina e utilizados para estudos in vitro. Eles podem ser cultivadas durante vários dias, num meio definido isento de soro. Nós também descrevem como enxertar explantes NC voltaem embriões de acolhimento para estudar a migração NC e diferenciação in vivo.

A crista neural (NF) é uma população de células embrionárias transiente que surge a partir do tubo neural, no final de neurulação em embriões de vertebrados. Os eventos de sinalização e genéticos que controlam a especificação NC começar tão cedo quanto a gastrulação. O NC é especificado na fronteira entre o ectoderma neural e não neural por sinais de tecidos dorsais circundantes. No final da neurulação, células NC sofrer uma transição epitélio para mesênquima (EMT) e migrar extensivamente no embrião seguindo vias estereotipados por responder ao redor pistas orientadoras. Uma vez que eles chegaram ao seu destino final, eles se diferenciam em uma vasta gama de derivados, por exemplo, neurônios, glia, ossos, cartilagens e células pigmentadas ^1-5. Por causa de sua contribuição para muitos tipos de células e tecidos embrionários, defeitos em qualquer etapa do desenvolvimento NC células, a partir de indução de diferenciação final, pode causar síndromes congênitas nomeados neurocristopathies ^6. Emanipulação Xperimental do NC desenvolvimento em diferentes estágios - especificação, EMT, migração e diferenciação - irá melhorar a nossa compreensão da neurocristopathies e permitir desenho de estratégias terapêuticas potenciais.

O embrião de Xenopus laevis é um modelo de escolha para estudar o desenvolvimento NC. Um grande número de embriões são fáceis de obter, e fecundação externa dá acesso aos primeiros passos do desenvolvimento. Muitas ferramentas estão disponíveis para manipular experimentalmente X. laevis desenvolvimento embrionário. Gene ganho de função e knockdown são fáceis de realizar por microinjecting células individuais dos primeiros blástulas. Tecidos embrionários podem ser cortados para in vitro reassociation ^7-11 ou ensaios de back-enxerto ^12,13.

Neste protocolo, descrevemos como dissecar premigratory NC craniano em X. laevis neurulas final, antes da migração. Estes explantes podem ser cultivados em fibronectina coateplacas d para estudar a migração e diferenciação em controladas em condições experimentais in vitro. Explantes NC também pode ser enxertado em embriões hospedeiros normais ou manipuladas para estudar a sua migração e diferenciação in vivo.

Experimentos cumprir com a regulamentação nacional e comunitária relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos e com princípios internacionalmente consagrados de substituição, redução e aperfeiçoamento.

1. Preparação de Pratos fibronectina revestidos ¹⁴

1. Pipetar 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grau de cultura diluído em 1x tampão fosfato salino (PBS) para uma placa de Petri de plástico padrão (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Nota: se estiver usando pratos de vidro ou lamelas de vidro para imagens subsequentes, use a / ml solução fibronectina 100 mg.
2. Lavar três vezes com PBS 1x.
3. Substituir PBS com 500 ml de 1x PBS/0.1% Albumina de Soro Bovino (BSA). Incubar a 37 ° C durante 30 min.
4. Lavar três vezes com PBS 1x.
5. Encha-se com PBS 1x e manter a 4 ° C até à sua utilização (geralmente de 24-48 h).

2. Dissecção dos explantes NC

1. Preparar 3/4 normal anfíbio Médio (NAM) (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM de Ca _{(NO3) 2,} 1 mM de _MgSO4, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de NaHCO _3, 0,2 x PBS, 50 mg / mL gentamicina ^10,15). Não mantenha mais de 1 semana para dissecação, armazenar a 4 ° C. NAM mais podem ser utilizados para a preparação de pratos revestidos-de dissecação de agarose (abaixo).
2. Prepare 60 milímetros placas de Petri para dissecção, revestidos com 10 ml de 2% de agarose em 3/4 NAM.
3. Recolhe ferramentas de dissecação: pipetas de Pasteur de plástico, um pino mais fino inseto montado no suporte do pino (ver tabela materiais de referência), uma "faca sobrancelha" (feito com o cabelo da sobrancelha embebidos em parafina, na ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro ^16), dois fina fórceps de dissecação, pipeta P1000 e dicas, um estereoscópio binocular com ampliação de 8-40X 50, uma fonte de luz brilhante, com guias de fibras ópticas. Todas as ferramentas de dissecação devem ser mantidos limpos, depois de cada experimento, lavar duas vezes com água destilada, uma vez wiª etanol 100% e deixar secar. Guarde longe da poeira.
4. Preencha o prato dissecção com NAM fresco quase até o topo.
5. Obter X. laevis embriões de acordo com os procedimentos padrão ¹⁰ e idade deles até atingirem neurula fase 16 (de acordo com Nieuwkoop e Faber tabela de desenvolvimento ^17).
6. Coloque fase 16 embriões no prato dissecção usando o Pasteur pipeta de plástico.
7. Realizar todas as etapas subseqüentes sob o escopo binocular. Retirar a membrana vitelina, com dois pares de pinças. Tenha cuidado para não danificar a parte dorsal dos embriões.
8. Espere até que os embriões atingiram fase 17 para iniciar a dissecção. Fase 17 é adequado uma vez que a crista neural é claramente separado do tubo neural, em contraste com as fases anteriores. Após fase 17, NC começa a migrar e se misturando com o mesênquima circundante.
9. Cave um buraco pequeno na agarose com uma pinça para fazer um nicho para os embriões, a fim de manterlos durante a dissecção. Coloque um embrião dorsal voltada para cima. Nota: massa de modelar pode ser utilizada para manter os embriões em vez escavar um buraco no agarose.
10. Faça uma incisão na parte lateral da prega neural anterior com a faca sobrancelha eo pino do inseto. Tenha cuidado para não ir muito fundo no embrião: destinam-se a cortar 2-3 camadas celulares (nunca chegam tão profundo como o archenteron!). Durante todo o processo de esvaziamento, nunca permitir que os tecidos dissecados para entrar em contacto com a interface ar-líquido desde X. tecidos embrionários laevis são lisadas pela tensão superficial.
11. Faça uma segunda incisão paralela na parte mais dorsal do neural dobra usando os mesmos instrumentos.
12. Se necessário, gire o prato em torno de 90 °. Fazer uma terceira incisão perpendicular com a faca sobrancelha e o pino de insectos, no lado posterior dos dois primeiros incisões. O NF é uma massa espessa de células debaixo da camada exterior pigmentada de ectoderma, lateralpara o tubo neural.
13. Utilize a ponta da faca sobrancelha para separar a camada pigmentada da ectoderme NC subjacente, a partir da terceira borda da incisão.
14. Usar o lado da faca sobrancelha para separar o tecido de NC a partir da terceira incisão. O tecido NC é bastante acinzentada, enquanto a mesoderme cefálica subjacente é branco. Separe cuidadosamente o NC a partir da mesoderme.
15. Retire o tecido NC anteriormente da vesícula óptica, e cortar a este nível para liberar o explante. Como um controlo para a primeira experiência, o controlo de expressão snail2 (um marcador NC canónica) em alguns explantes por hibridação in situ é recomendada.

3. Galvanização explantes sobre fibronectina

1. Preencha o prato revestido com fibronectina Modificado Danilchick Médio (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO ₃ 5 mM, K gluconato de 4,5 mM, Na Gluconate 32 mM, _MgSO4 1 mM, _CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, ajuste de pH a 8.3 com 1 M de Bicina ^18).
2. Transferir os explantes no prato revestido com fibronectina com uma pipeta P1000. Nunca permitir que os explantes de tocar a interface ar-líquido. Primeiro, um pouco de líquido pipeta na ponta, em seguida, os explantes, em seguida, um pouco de líquido novamente. Não permita que o ar para a ponta durante a transferência dos explantes no prato revestido de fibronectina. Uma vez que a ponta está dentro do líquido do prato revestido de fibronectina, deixe-os explantes lentamente descer por gravidade, ou empurrar gentilmente. Evite ejetar os explantes rápido demais.
3. Coloque 10-30 explantes no prato usando a faca sobrancelha. Evitar os lados do prato, que não são adequados para a imagiologia subsequente.
4. Tente não mover o prato até os explantes ter anexado a fibronectina (leva cerca de 15-30 minutos). Se necessário, mova o prato com muito cuidado.
5. Coloque o prato em uma incubadora de refrigeração (entre 15-20 ° C, para ver gráfico de temperatura ^17). Quando colocado a 15 ° C, as células de are geralmente migrando de forma eficiente e dispersão após 6 horas de incubação (este tempo pode variar entre os experimentos).

4. Enxertia explantes em embriões de host

1. Corte uma lamela de vidro fino em pedaços muito pequenos, usando uma pinça grossa. O tamanho das peças deve ser de cerca de 1,5 mm ^2. Mergulhar os pedaços num prato de Petri contendo 3/4 de NAM ou PBS utilizando fórceps.
2. Preparação do embrião hospedeiro: dissecar o anfitrião NC em 3/4 NAM como descrito em 3) com um cuidado especial para não danificar o embrião hospedeiro durante a remoção da membrana vitelina e dissecando o NC. A tensão do tecido tende a aumentar o tamanho da ablação de: permitir que o embrião hospedeiro curar parcialmente dissecando o embrião dador.
3. Em outro prato revestido de agarose ou em outra parte do mesmo prato, dissecar o explante NC a partir do embrião dador, tal como descrito no protocolo 3. Transferir o enxerto NC no prato contendo o hospedeiro com cuidado, como descrito emProtocolo no 3.
4. Imediatamente coloque o explante NC para a área de acolhimento ablated usando uma pinça. O explante deve anexar parcialmente. Coloque um pedaço de lamela de vidro para o embrião enxertada para manter o enxerto no lugar. Escolha um pedaço de vidro maior que o embrião para evitar danificá-lo. O embrião vai ser um pouco achatado.
5. Aguarde pelo menos 15-20 min, em seguida, remova cuidadosamente a lamela. Deixe o embrião recuperar durante mais 10 minutos e cuidadosamente pipetar-lo em um prato limpo preenchido com 3/4 de NAM, utilizando a pipeta de Pasteur de plástico.

Quando plaqueadas em fibronectina, os explantes da crista neural anexar-se rapidamente (15-30 min) e o explante estende horizontalmente dentro de 2 horas (Figura 1A). Depois de 3-6 células hr começar a se dispersar. Em 24 horas, a 15 ° C, muitas células começaram a migrar a partir do explante (Figuras 1B e 1C). Yolk torna as células muito brilhante em fase de contraste (Figura 1B). Protuberâncias celulares (filopodes e lamellipodes) são claramente visíveis depois de coloração com faloidina do citoesqueleto de actina (Figura 1C).

Para a experiência de enxertia ortotópico, os embriões de dadores foram injectados com GFP ARNm, a fim de seguir as células enxertadas no embrião hospedeiro não marcado. O craniana NC foi excisada de um lado do hospedeiro; 30-60 minutos após a cirurgia, o enxerto ter cicatrizado, substituindo o hospedeiro sujeito a ablação craniana NC (Figura 1D, 2 horas após o enxerto). Algumas horas mais tarde, as células GFP positivas migrarama partir do explante e seguiu as rotas de migração estereotipados de células da CN em relação locais craniofaciais ventral (Figura 1E). Em girinos, estruturas craniofaciais NC-derivados têm desenvolvido (Figura 1G). Quando craniana NC foi excisada, estas estruturas foram ausentes, resultando numa cara encurtado com o olho adjacente à glândula cimento (Figura 1H, setas vermelhas). Em girinos enxertadas, as células NC doadores têm contribuído para as estruturas crânio-faciais, resultando em uma morfologia facial normal (Figuras 1F e 1I, setas verdes).

Figura 1. In vitro e in vivo de comportamento explantado craniana NC. AC)   Premigratory NC foi dissecadoa partir de um embrião de fase de neurula 17 e colocado em um prato revestido com fibronectina. A) 2 h após o plaqueamento, o explante tem anexado e propagação. B) 24 horas após o plaqueamento, as células foram eficientemente migraram na fibronectina. C) lamellipodia e filopodia são vistas claramente na migração de células NC marcadas com faloidina (verde) fase DI) nêurula 17 GFP + rotulados premigratory NC foi feita a partir de um embrião de injecção de GFP e de back-enxertado num embrião hospedeiro, a partir do qual craniana NC foi excisada a fase 17. - 18. D) Duas horas após a enxertia, o explante curou. células EF) Grafted NC migraram ativamente e povoaram o fluxo mandibular como mostrado na fase de girino 31 e 41. fase G) 41 Controle de girino. H) ablação do NC tem resultou em uma falha dramática da face e desenvolvimento do olho (H: note que a glan cimentod desenvolve-se adjacentemente ao olho, devido à falta de células NC povoam as zonas do maxilar, setas vermelhas. . Compare para controlar girino em G) F, I) Em contraste, as células enxertadas NC ter restaurado olho e desenvolvimento craniofacial estruturas (F, I, setas verdes) AC, Barras de escala = 100 mm;. DI, Escala bar = 1 milimetro . D, vista dorsal. EI, vistas laterais. Este valor foi modificado a partir Milet et al. ¹² Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo descreve uma técnica fácil de explantar premigratory craniano NC em embriões laevis X.. Os embriões utilizados para tais experimentos precisam ser robusto e curar bem. Descarte qualquer lote de embriões saudáveis. Além disso, os embriões crescem a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), de modo a excisar crista neural na fase 17, e não depois. Após a fase 17, crista neural pode ser misturado com mesoderme cefálica e não pode ser removido completamente. Tecidos Xenopus curar rapidamente e, em seguida, perder a sua aderência a outros tecidos. É importante trabalhar rapidamente e colocar os explantes da crista neural para o hospedeiro, logo que é cortado a partir do dador.

Quanto experimentos in vitro, placas de cultura fibronectina pode ficar contaminado com bactérias ou fungos depois de um par de dias. Use materiais e soluções de antibiótico e limpas ou estéreis o mais rápido possível.

Este procedimento é otimizado fou crista neural craniana. Com efeito, esta população de células é bem definida e localizada na fase 17 embriões de Xenopus. Infelizmente, este modelo não é adequado para a realização de tais experimentos no tronco NC. Embriões de aves são mais adequados para aqueles que estão interessados ​​em manipular tal população de células tronco NC.

Os explantes descritos neste protocolo pode ser utilizado para o estudo de vários aspectos do comportamento NC, tanto in vivo como in vitro. O programa de desenvolvimento molecular NC é amplamente conservada em vertebrados, ^19. Desenvolvimento Frog é um modelo poderoso para estudar vertebrados NC EMT, migração e diferenciação. X. células embrionárias laevis conter gema suficiente para permitir a sua sobrevivência in vitro durante vários dias, sem adição de qualquer nutriente externa. Assim, os estudos in vitro podem testar os efeitos de vários factores de crescimento ou de compostos químicos, em um meio de cultura simples e totalmente controlada. Tais experiências têm sidoconcebido para analisar EMT e migração, incluindo o estudo dos efeitos de quimio-atraentes ou repelentes de quimio, de activação ou de bloqueio de vias de sinalização, etc ^14,20-24 Esta abordagem também pode ser utilizada para a concepção de protocolos de diferenciação melhoradas dirigidos NC. No contexto do desenvolvimento de protocolos para a medicina regenerativa, a obtenção de diversos tipos de células derivadas da CN in vitro podem ser utilizados na triagem de drogas para compreender e tratar neurocristopathies ^25,26.

Desenvolvimento NC é orquestrado por uma complexa interação entre os regulamentos autônomos celulares e sinais dos tecidos circundantes. Manipulações experimentais de expressão gênica, tanto no doador NC ou no embrião hospedeiro, permitir célula autônoma de discriminar aspectos autônomos noncell de desenvolvimento NC. Combinando ganho de função e knock-down abordagens para este protocolo para o cultivo in vitro e em enxerto vivo foi usar com sucessod ^{14,21,23,27-36.}

Esta técnica pode ser adaptada para enxertar outros tecidos em embriões hospedeiros e para testar os seus potenciais de migração e diferenciação. Por exemplo, usamos o ectoderma telhado blastocélica pluripotentes (o "cap animal") para procurar uma chave de transcrição mínima para o desenvolvimento NC. Temos estudado o efeito de dois fatores de transcrição, PAX3 e zic1, no NC compromisso e posterior desenvolvimento. Tampões animais com PAX3 e zic1 ganho-de-função foram semeadas em fibronectina in vitro ou backgrafted em embriões hospedeiros. Descobrimos que as células Pax3/Zic1-induced migrar e diferenciar como bona fide células NC tanto in vitro como em embriões de acolhimento ^12.

Inúmeros mecanismos moleculares que governam NC EMT e migração também estão envolvidos na disseminação metastática do câncer ^37. Este protocolo tem como objectivo fornecer uma maneira simples, barata e efficient ferramenta para os biólogos do desenvolvimento e outros pesquisadores para explorar os mecanismos fundamentais desses comportamentos celulares importantes.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores agradecem Adeline Dolly para as fotos de explante sobre a fibronectina, Eric Théveneau para discussões úteis e Biotério do Institut Curie. CM é um pós-doutorado da Região Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Adido Temporaire d'Enseignement et de Recherche) e Agence Nationale de la Recherche. Este trabalho foi financiado pela Universite Paris Sud (Attractivite 2011), o Centre National de la Recherche Scientifique (Programa de Acção Thématique et incitativo sur), Associação pour la Recherche contre le Câncer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, e Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programa Blanc).