تشريح

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إلى اللحمة المتوسطة التي تمر بمرحلة انتقالية، والهجرة، والتمايز.

قمة العصبية (NC) هو السكان الخلية الظهرية الأنبوب العصبي عابرة أن يخضع لظهارة الانتقالية إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في نهاية تكون العصيبة، على نطاق واسع يهاجر نحو مختلف الأجهزة، ويميز في العديد من أنواع المشتقات (الخلايا العصبية، الدبقية، الغضاريف والعظام، والخلايا الصباغية والغدد الصماء). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح الجمجمة NC premigratory من الأجنة القيطم المورق، من أجل دراسة تطوير NC في الجسم الحي في المختبر. نموذج الضفدع توفر العديد من المزايا لدراسة التطور المبكر؛ هي دفعات وفيرة والأجنة تتطور بسرعة، في الجسم الحي الربح والخسارة من وظيفة تسمح استراتيجيات التلاعب في التعبير الجيني قبل NC في تشريح المانحة و / أو الأجنة المضيفة. لل explants NC يمكن مطلي على فبرونيكتين وتستخدم لفي الدراسات المختبرية. أنها يمكن تربيتها لعدة أيام في وسط المصل خالية محددة. نحن أيضا تصف كيفية الكسب غير المشروع إإكسبلنتس NC العودةفي الأجنة المضيفة لدراسة الهجرة NC والتمايز في الجسم الحي.

قمة العصبية (NC) هي الخلايا الجنينية عابرة السكان أن يخرج من الأنبوب العصبي في نهاية تكون العصيبة في أجنة الفقاريات. الأحداث إشارات والوراثية التي تتحكم في مواصفات NC تبدأ في وقت مبكر تكون المعيدة. يتم تحديد NC على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية التي كتبها إشارات من الأنسجة المحيطة الظهرية. في نهاية تكون العصيبة، والخلايا NC الخضوع لظهارة الانتقال إلى اللحمة المتوسطة (EMT) والهجرة على نطاق واسع في الجنين التالية الطرق النمطية من خلال الاستجابة لتوجيه العظة المحيطة. بمجرد أن وصلت إلى وجهتها النهائية، فإنها تفرق في مجموعة واسعة من المشتقات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية والعظام والغضاريف، والخلايا الصباغية ^1-5. بسبب مساهمتها في العديد من أنواع الخلايا والأنسجة الجنينية، والعيوب في أي خطوة من تطوير خلايا NC، من الحث على التمايز النهائي، يمكن أن يسبب أعراض الخلقية اسمه neurocristopathies ^6. Eالتلاعب xperimental من NC النامية في مراحل مختلفة - مواصفات، EMT، والهجرة، والتمايز - من شأنها تحسين فهمنا للneurocristopathies والسماح تصميم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

والمورق القيطم الجنين هو نموذج من خيار لدراسة تطوير NC. أعداد كبيرة من الأجنة من السهل الحصول عليها، والإخصاب الخارجي يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى من التنمية. العديد من الأدوات المتاحة لمعالجة تجريبيا اكس. المورق التطور الجنيني. مكسب من وظيفة وضربة قاضية الجينات هي سهلة لأداء microinjecting بواسطة الخلايا الفردية من blastulas في وقت مبكر. ويمكن خفض الأنسجة الجنينية في المختبر لإعادة الترابط ^7-11 أو ترقيع العودة المقايسات ^12،13.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح خارج premigratory NC في الجمجمة X. المورق neurulas في وقت متأخر، قبل الهجرة. يمكن تربيتها هذه إإكسبلنتس على فبرونيكتين-coateلوحات د لدراسة الهجرة وتمايز في التحكم في ظروف تجريبية المختبر. ويمكن أيضا أن المطعمة إإكسبلنتس NC في الأجنة المضيفة العادي أو التلاعب بها لدراسة هجرتها والتمايز في الجسم الحي.

تجارب الامتثال التنظيم الوطنية والأوروبية لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية ومع المبادئ المعمول بها دوليا من استبدال، والحد من والصقل.

1. إعداد أطباق فبرونيكتين ^{المغلفة-14}

1. ماصة 500 مل من 10 ملغ / مل ثقافة الصف فبرونيكتين المخفف في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في طبق بتري البلاستيكية القياسية (Ø 40 × 11 مم). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ملاحظة: في حالة استخدام الأطباق الزجاجية أو coverslips الزجاج للتصوير لاحقة، واستخدام 100 ملغ / مل حل فبرونيكتين.
2. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
3. استبدال برنامج تلفزيوني مع 500 مل من 1X PBS/0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
5. ملء مع برنامج تلفزيوني 1X والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى استخدام (عادة لمدة 24-48 ساعة).

2. تشريح إإكسبلنتس NC

3. طلي إإكسبلنتس على فيبرونكتين]

1. تعبئة في طبق المغلفة فبرونيكتين مع التعديل Danilchick متوسطة (MDM، كلوريد الصوديوم 53 ملي، Na2CO ₃ 5 ملم، K غلوكونات 4.5 ملم، 32 ملم غلوكونات الصوديوم، MgSO ₄ 1 ملم، و CaCl ₂ 1 ملم، 0.1٪ BSA، وضبط درجة الحموضة إلى 8.3 مع 1 M Bicine ^18).
2. نقل لل explants في طبق المغلفة فبرونيكتين باستخدام ماصة P1000. لم تسمح لل explants للمس واجهة الهواء السائل. الأولى، ماصة بعض السائل إلى الحافة، ثم لل explants، ثم بعض السائل مرة أخرى. لا تسمح لأي طرف في الهواء أثناء نقل لل explants في طبق المغلفة فبرونيكتين. مرة واحدة غيض داخل السائل من صحن المغلفة فبرونيكتين، والسماح لل explants يذهب ببطء عن طريق الجاذبية، أو دفع بلطف شديد. تجنب إخراج لل explants سريع جدا.
3. وضع 10-30 إإكسبلنتس في الطبق باستخدام سكين الحاجب. تجنب جوانب الطبق، والتي هي غير كافية للتصوير اللاحقة.
4. ليس محاولة لتحريك الطبق حتى تعلق لل explants على فبرونيكتين (يستغرق حوالي 15-30 دقيقة). إذا لزم الأمر، قم بتحريك الطبق بعناية فائقة.
5. وضع الطبق في الحاضنة المبردة (بين 15-20 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الرسم البياني لنرى ^17). عندما وضعت في 15 درجة مئوية، وخلايا عه عادة المهاجرة بكفاءة ونثر بعد 6 ساعة من الحضانة (قد تختلف هذا التوقيت بين التجارب).

4. تطعيم إإكسبلنتس في الأجنة المضيف

1. قطع ساترة الزجاج غرامة الى قطع صغيرة جدا باستخدام ملقط الخشنة. حجم القطع يجب أن يكون ما يقرب من 1.5 مم ^2. تزج القطع في طبق بتري تحتوي على 3/4 حركة عدم الانحياز أو برنامج تلفزيوني باستخدام ملقط.
2. إعداد الجنين المضيف: تشريح خارج NC المضيفة في 3/4 كما هو موضح في حركة عدم الانحياز 3) مع عناية خاصة لا تضر الجنين المضيف أثناء إزالة الغشاء المحي وتشريح NC. التوتر الأنسجة يميل إلى زيادة حجم الاجتثاث: لندع الجنين المضيف شفاء جزئيا في حين تشريح الجنين المانحة.
3. في طبق المغلفة الاغاروز آخر أو في جزء آخر من نفس الطبق، تشريح خارج يزدرع NC من الجنين المانحة كما هو موضح في البروتوكول 3. نقل الكسب غير المشروع NC في طبق يحتوي على المضيف مع الرعاية، كما هو موضح فيبروتوكول 3.
4. وضع على الفور يزدرع NC على منطقة ذاب المضيف باستخدام ملقط. ازدراع يجب إرفاق جزئيا. وضع قطعة من الزجاج ساترة على الجنين المطعمة للحفاظ على الكسب غير المشروع في المكان. اختيار قطعة من الزجاج أكبر من الجنين لتجنب الإضرار بها. فإن الجنين يكون قليلا بالارض.
5. الانتظار لمدة 15-20 دقيقة على الأقل، ثم إزالة بلطف ساترة. دعونا الجنين استرداد لمدة 10 دقيقة أخرى وماصة بعناية في طبق نظيف مليئة 3/4 حركة عدم الانحياز، وذلك باستخدام البلاستيك ماصة باستير.

عندما مطلي على فبرونيكتين، لل explants قمة العصبية إرفاق بسرعة (15-30 دقيقة) وازدراع ينتشر داخل شقة 2 ساعة (الشكل 1A). بعد 3-6 ساعة تبدأ في الخلايا مبعثر. في 24 ساعة عند 15 درجة مئوية، وقد بدأت العديد من الخلايا لتهاجر بعيدا عن ازدراع (الأرقام 1B و 1C). صفار يجعل الخلايا مشرق جدا تحت النقيض من المرحلة (الشكل 1B). نتوءات الخلية (filopodes وlamellipodes) واضحة للعيان بعد تلطيخ phalloidin من الهيكل الخلوي الأكتين (الشكل 1C).

للتجربة تطعيم مثلي، تم حقن الأجنة المانحة مع GFP مرنا من أجل متابعة الخلايا المطعمة في الجنين المضيف غير المسماة. وقد ذاب في الجمجمة NC على جانب واحد من المضيف؛ 30-60 دقيقة بعد عملية جراحية تعافى الكسب غير المشروع، لتحل محل المضيف ذاب الجمجمة NC (الشكل 1D، 2 ساعة بعد التطعيم). وبعد بضع ساعات، هاجروا الخلايا GFP إيجابيةالخروج من ازدراع واتبعت طرق الهجرة النمطية للخلايا NC نحو مواقع القحفي بطني (الشكل 1E). في الضفادع الصغيرة، وضعت هياكل القحفي NC-مشتقة (الشكل 1G). عندما ذاب الجمجمة NC، وهذه الهياكل في عداد المفقودين، مما أدى إلى تقصير وجه مع العين المجاورة للغدة الاسمنت (الشكل 1H، السهام الحمراء). في الضفادع الصغيرة المطعمة، ساهمت خلايا NC المانحة إلى هياكل القحف الوجهي، مما أدى إلى وجهه مورفولوجيا العادي (أرقام 1F و1I، الأسهم الخضراء).

الشكل 1. في المختبر والمجراة في السلوك من explanted NC الجمجمة. AC)   وكان تشريح Premigratory NCالخروج من مرحلة الجنين 17 العصيبة ومطلي على طبق المغلفة فبرونيكتين. A) 2 ساعة بعد الطلاء، وتولى ازدراع وانتشارها. B) 24 ساعة بعد الطلاء، وخلايا هاجروا بكفاءة على فبرونيكتين. C) أقدام صفاحية وأرجل كاذبة خيطية وينظر بشكل واضح في الخلايا المهاجرة NC المسمى مع phalloidin (الأخضر) المرحلة DI) العصيبة 17 GFP + المسمى اتخذ premigratory NC من الجنين حقن GFP والمطعمة مرة أخرى إلى الجنين المضيف، الذي تم ذاب الجمجمة NC في مرحلة 17 - 18. D) بعد ساعتين من التطعيم، وقد شفى ازدراع. هاجروا الخلايا EF) المطعمة NC بنشاط وتعبئة تيار الفك السفلي كما هو مبين في مرحلة الشرغوف 31 و 41. المرحلة G) مراقبة 41 الشرغوف. H) الذوبان في نورث كارولاينا و أدى إلى الفشل الكبير في الوجه والعين التنمية (H: نلاحظ أن GLAN الأسمنتد تطور المجاورة للعين، وذلك بسبب عدم وجود خلايا NC ملء المناطق الفك، السهام الحمراء. . مقارنة للسيطرة الشرغوف في G) F، I) وفي المقابل، واستعادة الخلايا المطعمة NC العين والتنمية هياكل القحفي (F، I، الأسهم الخضراء) AC، أشرطة النطاق = 100 مم؛ DI، مقياس بار = 1 ملم دال، عرض الظهرية. EI وجهات نظر الجانب. تم تعديل هذا الرقم من Milet وآخرون ¹² الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يصف هذا البروتوكول تقنية سهلة لازدراع premigratory الجمجمة NC في اكس الأجنة المورق. الأجنة المستخدمة في مثل هذه التجارب تحتاج إلى أن تكون قوية وتلتئم بشكل جيد. تجاهل أي دفعة من الأجنة غير صحية. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الأجنة في درجات حرارة مختلفة (من 12 إلى 18-20 درجة مئوية)، من أجل استئصال قمة العصبية في المرحلة 17 وليس في وقت لاحق. بعد المرحلة 17، قد تكون مختلطة مع قمة العصبية الأديم المتوسط ​​رأسي ولا يمكن إزالتها تماما. الأنسجة القيطم تلتئم بسرعة ومن ثم تفقد التصاق بهم إلى الأنسجة الأخرى. من المهم أن تعمل بسرعة ووضع إإكسبلنتس قمة العصبية في المضيف بمجرد أن يتم رفعه فإنه من الجهة المانحة.

فيما يتعلق في تجارب المختبر، ويمكن الحصول على أطباق الثقافة فبرونيكتين الملوثة بالبكتيريا أو الفطريات بعد بضعة أيام. استخدام المواد والحلول المضادات الحيوية ونظيفة أو معقمة كلما كان ذلك ممكنا.

هو الأمثل هذا الإجراء وأو قمة العصبية في الجمجمة. في الواقع، هذه الفئة من السكان الخلية ويعرف جيدا والمترجمة في المرحلة 17 الأجنة القيطم. للأسف، وهذا النموذج ليس مناسبا لإجراء مثل هذه التجارب على الجذع NC. أجنة الطيور هي أكثر مناسبة لأولئك الذين يرغبون في التلاعب مثل جذع السكان الخلية NC.

لل explants الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من السلوك NC، سواء في الجسم الحي في المختبر. يتم حفظها البرنامج التنموي الجزيئي NC إلى حد كبير في الفقاريات ^19. التنمية الضفدع هو نموذج قوي لدراسة الفقاريات NC EMT، والهجرة والتمايز. X. الخلايا الجنينية المورق تحتوي على صفار بما يكفي للسماح بقائهم على قيد الحياة في المختبر لعدة أيام دون إضافة أي المغذيات الخارجية. وبالتالي، يمكن أن الدراسات في المختبر اختبار تأثير عوامل النمو المختلفة أو المركبات الكيميائية، في مستنبت بسيطة وتسيطر عليها بالكامل. وكانت مثل هذه التجاربتهدف إلى تحليل EMT والهجرة، بما في ذلك دراسة آثار الكيماوي جاذبة أو الكيماوي طارد، تفعيل أو عرقلة مسارات الإشارات، الخ ^14،20-24 يمكن أيضا أن هذا النهج أن تستخدم لتحسين تصميم بروتوكولات التمايز الموجهة NC. في سياق وضع بروتوكولات للطب التجديدي، والحصول على أنواع الخلايا المشتقة من NC المتنوعة في المختبر يمكن أن تستخدم في فحص المخدرات لفهم وعلاج neurocristopathies ^25،26.

ودبرت التنمية NC بواسطة تفاعل معقد بين الخلايا وائح الحكم الذاتي وإشارات من الأنسجة المحيطة بها. التلاعب التجريبية في التعبير الجيني، سواء في NC المانحة أو في الجنين المضيف، والسماح الخلية التمييز الحكم الذاتي من جوانب الحكم الذاتي noncell التنمية NC. الجمع بين المكسب من وظيفة وتدق إلى أسفل النهج لهذا البروتوكول للثقافة في المختبر والمجراة في تطعيم تم استخدام بنجاحد ^{14،21،23،27-36.}

هذه التقنية يمكن تكييفها لتطعيم الأنسجة الأخرى في الأجنة المضيفة واختبار للهجرة والتمايز إمكاناتها. على سبيل المثال، استخدمنا المحفزة الأديم الظاهر سقف blastocoel (في "الغطاء الحيواني") للبحث عن مفتاح النسخي الحد الأدنى من أجل التنمية NC. درسنا تأثير اثنين من عوامل النسخ، pax3 وzic1، على التزام NC والتطور اللاحق. كانت مطلية القبعات الحيوان مع pax3 وzic1 مكاسب من وظيفة على فبرونيكتين في المختبر أو backgrafted في الأجنة المضيفة. وجدنا أن الخلايا Pax3/Zic1-induced تهاجر والتفريق مثل حسن النية الخلايا NC على حد سواء في التجارب المختبرية والأجنة المضيفة ^12.

وتشارك العديد من الآليات الجزيئية التي تتحكم NC EMT والهجرة أيضا في نشر المنتشر في سرطان ^37. ويهدف هذا البروتوكول إلى توفير بسيطة ورخيصة وefficiأداة الأنف والحنجرة لعلماء البيولوجيا التطورية وغيرهم من الباحثين في استكشاف الآليات الأساسية لهذه السلوكيات الخلية الرئيسية.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

المؤلفين أشكر أدلين دوللي للصور من يزدرع على فبرونيكتين، اريك Theveneau لإجراء مناقشات مفيدة ومرفق الحيوان من معهد كوري. CM هو زميل ما بعد الدكتوراه لمنطقة إيل دي فرانس (دومين من أجل المصلحة فيل الجذعية القطب)، جامعة باري سود (الملحق Temporaire كوت ENSEIGNEMENT آخرون للبحوث)، والوكالة الوطنية للبحوث لا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة باري سود (Attractivite 2011)، والمركز الوطني للبحوث العلميه (برنامج العمل Thematique آخرون Incitative سور)، والرابطة من أجل لا مناهضة بحوث السرطان جنيه منحة SFI20101201882، الدوري الفرنسي الدرجة مناهضة جنيه للسرطان، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (الوكالة الوطنية للبحوث برنامج لا بلان).