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요약

이 프로토콜은는 Xenopus laevis의의 neurulas에서 premigratory 두개골 신경 능선 (NC)를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 외식은 피브로넥틴 및 체외 배양에 도금, 또는 다시 호스트 배아에 이식 할 수 있습니다. 이 기술은 NC 상피 - 투 - 중간 엽 이행, 이주 및 분화의 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

초록

신경 능선 (NC)이 neurulation의 끝에서 상피 - 투 - 중간 엽 전이 (EMT)를 거쳐 임시 지느러미 신경 튜브의 세포 집단이다, 다양한 기관으로 광범위하게 마이그레이션 및 파생 상품의 많은 종류의 (신경 교세포로 분화 연골과 뼈, 색소 및 내분비 세포). 이 프로토콜에서는, 우리는 생체 내 및 시험 관내에서 NC의 개발을 연구하기 위하여는 Xenopus laevis의 태아에서 premigratory 두개골 NC를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 개구리 모델은 초기 개발을 연구하는 많은 장점을 제공하고, 풍부한 일괄 배아 생체 이득과 기능 전략의 손실 전에 기증자 및 / 또는 호스트 배아에서 NC의 해부 유전자 발현의 조작을 허용, 신속하게 개발, 사용할 수 있습니다. NC 이식편은 피브로넥틴에 도금 및 시험 관내 연구를 위해 사용될 수있다. 이들은 무 혈청 한정 배지에서 몇 일 동안 배양 될 수있다. 우리는 또한 NC 외식을 다시 이식하는 방법에 대해 설명합니다생체 내에서 NC의 이동과 분화를 연구하는 호스트 배아에.

서문

신경 능선 (NC)는 척추 동물의 배아에서 neurulation의 끝 부분에 신경 튜브에서 나온다 과도 배아 세포 집단이다. NC 사양을 제어하는​​ 신호 유전 이벤트는 초기 낭 배기로 시작합니다. NC는 주변 등의 조직으로부터의 신호에 의해 신경과 비 신경 외배엽의 경계에 지정됩니다. neurulation의 끝에서, NC 세포는 상피 - 투 - 중간 엽 전이 (EMT)를 거쳐 안내 신호를 주변에 응답하여 틀에 박힌 경로 다음 배아에서 광범위하게 마이그레이션 할 수 있습니다. 그들의 최종 목적지에 도달하면, 그들은 파생 상품, 예를 들면 신경 세포, 아교, 뼈, 연골, 그리고 색소 세포 1-5의 광대 한 배열로 분화. 때문에 많은 종류의 세포와 배아 조직, NC 세포 개발의 모든 단계에서의 결함, 유도에서 최종 분화에 기여으로, neurocristopathies 6이라는 선천성 증후군의 원인이 될 수 있습니다. E사양, EMT, 이주 및 분화 - - 다른 단계에서 개발하고 NC의 xperimental 조작 neurocristopathies에 대한 우리의 이해를 개선하고 잠재적 인 치료 전략의 디자인을 허용합니다.

는 Xenopus laevis의 배아는 NC의 개발을 연구하는 선택의 모델입니다. 배아의 큰 숫자는 쉽게 구할 수 있고, 외부 수정 개발의 첫 번째 단계에 액세스 할 수 있습니다. 많은 도구를 실험적으로 X를 조작 할 수 있습니다 배아 발달을 laevis의. 이득의 기능과 최저 유전자는 초기 blastulas의 개별 세포를 미세 주입에 의해 수행하기 쉽다. 배아 조직을 체외 재 연결 7-11 또는 백 접목 분석 (12, 13)에 절단 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 X에서 premigratory 두개골 NC를 해부하는 방법에 대해 설명합니다 이주 전에 후반 neurulas을 laevis의. 이러한 외식은 피브로넥틴 도금 파이프에 배양 할 수있다의 이동과 분화를 연구하는 D 판은 체외 실험 조건에서 제어. NC 외식은 생체 내에서 자신의 이동과 분화를 연구하는 정상 또는 조작 호스트 배아에 이식 할 수 있습니다.

프로토콜

실험은 과학적 목적 및 교체, 감소 및 정제 국제적으로 확립 된 원칙에 사용되는 동물의 보호에 관한 국가와 유럽 규정을 준수합니다.

1. 피브로넥틴 코팅 요리 (14)의 준비

  1. 표준 플라스틱 페트리 접시 (Ø 40 X 11mm)로 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 희석하여 10 ㎎ / ㎖ 문화 등급 피브로넥틴의 피펫 500 ㎖. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 참고 : 다음 영상에 유리 그릇 또는 유리 커버 슬립을 사용하는 경우, 100 ㎎ / ㎖의 fibronectin 솔루션을 사용합니다.
  2. 1X PBS로 3 회 씻어.
  3. 1X PBS/0.1 %의 소 혈청 알부민 (BSA)의 500 ㎖의 PBS를 교체합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
  4. 1X PBS로 3 회 씻어.
  5. 1X PBS와 함께 입력하고 (보통 24-48 시간 동안) 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오.

2. NC 외식 해부

<올>
  • 준비 3 / 4 일반 양서류 중간 (NAM) (110 mM의 NaCl을 2 ㎜의 KCl, 1 ㎜ 중 Ca (NO 3) 2, 1 ㎜ 망초, 0.1 mM의 EDTA, 1 mM의 탄산 수소 나트륨, 0.2 배 PBS, 50 ㎎ / ㎖ ) 10,15을 겐타 마이신. 4 ℃에서 해부, 저장소에 대해 1 주일 이상 보관하지 마십시오 이전 NAM은 아가 로스 코팅 해부 접시 (아래)의 제조에 사용 할 수 있습니다.
  • 3 / 4 NAM 2 % 아가로 오스 10 ㎖로 코팅 해부 용 60mm 페트리 접시를 준비합니다.
  • 해부 도구를 수집 플라스틱 파스퇴르 피펫, 최고의 곤충 핀은 핀 홀더 (참고 자료 표 참조), (유리 파스퇴르 피펫 (16)의 끝 부분에 파라핀 눈썹 머리로 만든) "눈썹 칼", 두 개의 미세에 장착 해부 집게, P1000 피펫 팁, 50 배율 8-40X와 양안 입체경, 광학 섬유 가이드 밝은 조명. 모든 해부 도구를 청결하게 유지해야한다, 각 실험 후, 증류수로 2 회 위스콘신 헹구어100 % 에탄올을 토륨 건조 할 수 있습니다. 멀리 먼지 저장합니다.
  • 거의 정상에 신선한 NAM과 해부 접시에 기입하십시오.
  • X를 얻 표준 절차 (10) 그들이 (Nieuwkoop와 페이버 발달 테이블 (17)에 따라) neurula 스테이지 (16)에 도달 할 때까지를 나이에 따라 배아를 laevis의.
  • 16 배아 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 해부 접시에 무대를 놓습니다.
  • 양안 범위에서 이후의 모든 단계를 수행합니다. 포셉 두 쌍의 난황 막 제거합니다. 배아의 등 부분이 손상되지 않도록주의하십시오.
  • 태아가 해부를 시작하는 단계 17에 도달 할 때까지 기다립니다. 신경 문장이 명확하게 초기 단계는 대조적으로, 신경관 따로 설정되어 있기 때문에 스테이지 (17)가 적절하다. 단 17 일 후, 노스 캐롤라이나 마이그레이션 및 주변 중간 엽과 섞여서 시작합니다.
  • 유지하기 위해 배아에 대한 틈새 시장을 집게와 아가로 오스의 작은 구멍을 파해부 동안 그들. 하나의 배아 등의면을 위로 놓습니다. 참고 : 모델링 점토 대신 아가로 구멍을 파고 배아를 유지하는데 사용될 수있다.
  • 눈썹 칼과 곤충 핀 앞쪽에 신경 배의 측면 부분에 절개를합니다. 깊은 배아로도 이동하지 않도록주의 : 2 ~ 3 세포층 (! archenteron만큼 깊이에 도달하지 않음)을 극복하는 것을 목표로하고 있습니다. 전체적인 박리 과정에서 해부 조직이 X.시기 공기 - 액체 계면에 접촉 입력 할 수 없다 laevis의 배아 조직은 표면 장력에 의해 용해된다.
  • 신경의 추가 지느러미 부분의 제 2 평행 절개 동일한 장비를 사용하여 접어 만든다.
  • 필요한 경우, 90 °의 주위에 요리를 켭니다. 처음 두 절개의 후방 측에, 눈썹 칼과 곤충 핀 세 번째 수직 절개를합니다. NC는 측면, 외배엽의 색소 외부 층 아래 세포의 두꺼운 질량신경 튜브에.
  • 세 번째 절개의 가장자리에서 시작하여 기본 NC에서 색소 외배엽 층을 분리 눈썹 칼의 끝 부분을 사용합니다.
  • 세 번째 절개로 시작하는 NC 조직을 분리 눈썹 칼의면을 사용합니다. 기본 두부 중배엽 흰 동안 NC 조직이 아니라 회색이다. 조심스럽게 중배엽에서 NC를 구분합니다.
  • 광학 소포에서 전방으로 NC 조직을 분리하고, 이식편을 무료로이 수준에서 잘라. 현장 하이브리드 화에 의해 일부 외식에 snail2 식 (정식 NC 마커)를 검사하는 첫 번째 실험에 대한 제어로 추천합니다.

    • 3. 피브로넥틴에 도금의 Explants

    1. 강제로 피브로넥틴 코팅 접시 수정 Danilchick 중간 (MDM, 염화나트륨 53 밀리미터, Na2CO 5 mm의 K 글루 콘 산염 4.5 mm의 나 글루 콘 산염 32 밀리미터, 망초 1 ㎜, 염화칼슘 1 ㎜, BSA 0.1 %로, 산도를 조정 1 M Bicine 8.3에 18).
    2. P1000 피펫을 사용하여 피브로넥틴 - 코팅 접시에 외식을 전송합니다. 외식 공기 - 액체 인터페이스를 터치 할 수 있도록하지 마십시오. 먼저, 다음 몇 가지 액체를 다시 외식 후, 끝으로 몇 가지 액체를 피펫. 피브로넥틴 - 코팅 접시에 외식을 전송하는 동안 끝으로 모든 공기를 허용하지 않습니다. 끝이 피브로넥틴 코팅 접시의 액체 내부되면, 외식 천천히 중력에 의해 아래로 가자, 또는 매우 조심스럽게 밀어 넣습니다. 너무 빨리 외식를 배출하지 마십시오.
    3. 눈썹 칼을 사용하여 접시에 10-30 외식을 놓습니다. 다음 영상에 적합하지 않은 접시의 측면을, 피.
    4. 외식이 (대략 15 ~ 30 분 소요) 피브로넥틴에 부착 할 때까지 요리를 움직이지 않도록하십시오. 필요한 경우, 아주 조심스럽게 접시를 이동합니다.
    5. (온도 차트는 17 참조 15 ~ 20 ° C의 사이) 냉장 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 15 ° C에 배치하면, 세포가 아칸소전자 일반적으로 효율적으로 마이그레이션 및 배양 6 시간 후에 산란 (이 타이밍 실험 사이에 차이가있을 수 있습니다).

    4. 호스트 태아로의 Explants를 접목

    1. 거친 집게를 사용하여 매우 작은 조각으로 미세 유리 커버 슬립을 잘라. 조각의 크기는 약 1.5 mm 2 있어야합니다. 집게를 사용하여 3 / 4 NAM 또는 PBS를 함유하는 페트리 접시로 매 담금.
    2. 호스트 배아의 제조 : 난황 막 제거하고 NC 해부 동안 호스트 배아를 손상시키지 않도록 특별히주의) 3의 설명에 따라 3 / 4 NAM에 호스트 NC를 해부. 도너 배아 해부 동안 호스트 배아 부분적으로 치유하자 : 티슈 장력 절제의 크기를 증가시키는 경향이있다.
    3. 프로토콜 3에 설명 된대로 다른 아가 로스 코팅 접시 또는 동일한 접시의 다른 부분에서 도너 배아로부터 NC 이식편을 해부. 의 설명에 따라주의하여 호스트를 포함하는 접시에 NC 이식을 전송프로토콜 3.
    4. 즉시 집게를 사용하여 호스트 절제 영역에 NC 이식편을 배치합니다. 이식편 부분적으로 연결해야합니다. 장소에 이식을 유지하기 위해 이식 배아에 유리 커버 슬립의 조각을 넣어. 그것은 손상을 방지하기 위해 배아보다 큰 유리 조각을 선택합니다. 배아는 평평 조금있을 것입니다.
    5. 적어도 15 ~ 20 분 동안 기다린 후 부드럽게 커버 슬립을 제거합니다. 배아가 다른 10 분 동안 복구 할 수 조심스럽게 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여, 3 / 4 NAM 가득 깨끗한 접시에 피펫.

    결과

    피브로넥틴에 도금 할 때, 신경 능선 외식 신속하게 (15 ~ 30 분)을 첨부하여 이식편은 2 시간 (그림 1A)에서 플랫 퍼집니다. 3-6 시간의 세포가 흩어 시작하면. 15 ° C에서 24 시간, 많은 세포가 떨어져 이식편 (그림 1B 및 1C)에서 이주하기 시작했다. 노른자는 위상차 (그림 1B)에서 세포가 매우 밝은 있습니다. 세포 돌기 (filopodes 및 lamellipodes)은 액틴 세포 골격 (그림 1C)의 염색을 Phalloidin의 후 명확하게 볼 수 있습니다.

    동소 이식 실험의 경우, 기증자의 배아는 레이블이없는 호스트 배아에 이식 세포를 수행하기 위해 GFP mRNA를 주사했다. 두개골 NC는 호스트의 한면에 절제되었다; 30 ~ 60 분 수술 후 이식은 절제된 호스트 두개골 NC (그림 1D, 이식 후 2 시간)를 교체, 치유했다. 몇 시간 후, GFP 양성 세포가 이주중 이식편에서와 복부 두개 안면 위치 (그림 1E)으로 NC 세포의 틀에 박힌 이동 경로를 따라 갔다. 올챙이에서 NC-파생 된 두개 안면 구조 (그림 1G)를 개발했습니다. 두개골 NC가 절제 할 때, 이러한 구조는 시멘트 선 (그림 1H, 빨간색 화살표)에 인접한 눈을 가진 단축 얼굴의 결과로 누락되었다. 이식 올챙이에서 기증자 NC 세포는 정상적인 얼굴 형태 (그림 1 층과 1I, 녹색 화살표)의 결과로, 부교감 얼굴 구조에 기여했다.

    figure-results-992
    그림 1. 시험 관내 및 외식 두개골 NC의 생체 내 행동. AC)   Premigratory NC가 해부했다중 단 17 neurula 배아로부터 피브로넥틴 코팅 접시.) 도금 후 2 시간에 도금, 이식편이 부착 확산하고있다. B) 24 시간 도금 후, 세포가 효율적으로 피브로넥틴에 이주. C) lamellipodia는 및 filopodia . 명확 DI) Neurula 무대 phalloidin도 (녹색)으로 표시 NC 세포를 마이그레이션에서 볼 수 있습니다 17 GFP + premigratory NC는 GFP가 주입 된 배아에서 가져온 두개골 NC는 단계 17에서 절제 한에서 호스트 배아에 백 접목 한 레이블 - 18. D) 두 시간 이식 후 이식편 치유했다. EF) 그라프 NC 세포가 적극적으로 마이그레이션 및 올챙이 단계 31 및 41. G) 제어 단계 41 올챙이 그림과 같이 하악 스트림을 채워있다. H) NC가있다 탄두 얼굴과 눈 개발의 극적인 실패의 결과 (H : 참고 시멘트 GLAND 인해 턱 영역, 적색 화살표를 채우는 NC 세포의 부족 때문에, 눈에 인접한 개발한다. .) G의 올챙이를 제어하기 위해 비교 F, I) 반면, 이식 NC 세포는 눈과 두개 안면 구조의 개발 (F, I, 녹색 화살표)을 복원 한 AC, 스케일 바 = 100 ㎜,. DI, 스케일 바 = 1mm . D, 등의보기. EI, 측면보기. 이 그림은 Milet 등에서 수정되었습니다. 12 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    토론

    이 프로토콜은 X를 laevis의 태아에 premigratory 두개골 NC를 이식편하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이러한 실험에 사용 된 배아는 견고하고 잘 치료해야합니다. 건강에 해로운 배아의 배치를 폐기하십시오. 또한, 그리고 나중에 17에 신경 능선을 절제하기 위해, (12 18 ~ 20 ° C)에서 다양한 온도에서 배아를 성장. 단 17 일 후, 신경 문장은 두개의 중배엽과 혼합 될 수 있으며 완전히 제거 할 수 없습니다. Xenopus의 조직이 빠르게 치유하고 다른 조직에 자신의 접착력을 풀어. 그것은 빠른 속도로 일을하고 즉시이 기증자로부터 적출 될 때 호스트에 신경 능선 외식을 배치하는 것이 중요합니다.

    생체 외 실험에 관하여, 피브로넥틴 배양 접시는 며칠 후 세균이나 곰팡이에 오염받을 수 있습니다. 가능한 한 자주로 항생제를 청소 또는 살균 물질 및 솔루션을 사용합니다.

    이 절차는 F를 최적화또는 두개골 신경 능선. 사실,이 세포 집단은 잘 정의 된 무대 17 Xenopus의 배아에서 지역화됩니다. 불행하게도,이 모델은 트렁크 NC에서 같은 실험을 수행하는 데 적합하지 않습니다. 새의 배아는 줄기 NC 세포 인구를 조작에 관심이있는 사람들을 위해 더 적합하다.

    이 프로토콜에 설명 된 이식편은 생체 내 및 생체 외 모두에서 NC 행동의 다양한 측면을 연구하는데 사용될 수있다. NC 분자 발달 프로그램은 주로 척추 동물 (19)에 보존되어있다. 개구리 개발은 척추 NC의 EMT, 이주 및 분화를 연구 할 수있는 강력한 모델입니다. X. laevis의 배아 세포는 외부의 영양소를 첨가하지 않고 며칠 동안 체외에서 생존을 허용하기에 충분한 노른자가 포함되어 있습니다. 따라서, 시험 관내 연구는 간단하고 완전히 제어 된 배지에서, 다양한 성장 인자 또는 화합물의 효과를 시험 할 수있다. 이러한 실험을했습니다이 방법도 개선 감독 NC 분화 프로토콜을 설계하는 데 사용할 수있는 신호 전달 경로 등 14,20-24을 활성화하거나 차단하는, 화학 - 유인 나 화학 - 기피제의 효과를 공부하는 등의 EMT 및 마이그레이션을 분석하기 위해 설계. 재생 의학을위한 프로토콜을 개발하고 다양한 NC-파생 된 세포 유형 체외에서의 이해를위한 약물 검사에 사용될 수를 획득하고 neurocristopathies에게 (25), (26) 치료의 맥락에서.

    NC 개발은 주변 조직에서 세포 자율 규제와 신호 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 기증자 노스 캐롤라이나에있는 또는 호스트 배아에있는 하나의 유전자 발현 실험 조작은, NC 개발 noncell 자율적 인 측면에서 차별 세포가 자율적 수 있습니다. 이득 함수의 노크 다운을 결합하여 체외 배양을 위해이 프로토콜에 접근 및 생체 이식에 성공적으로 사용 된D 14,21,23,27-36.

    이 기술은 호스트 배아에 다른 조직을 이식하고 그들의 이동과 분화 가능성을 테스트하기 위해 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 NC 개발을위한 최소한의 전사 스위치를 찾기 위해 만능 blastocoel 지붕 외배엽 ( "동물 캡")을 사용했다. 우리는 NC의 노력과 후속 개발에 대한 두 가지 전사 인자, PAX3 및 zic1의 효과를 연구했다. PAX3 및 zic1 이득의 ​​기능을 가진 동물 모자는 체외에서 피브로넥틴에 도금 또는 호스트 배아에 backgrafted했다. 우리는 Pax3/Zic1-induced 세포가 이주 및 체외에서 호스트 배아 (12)의 두 선의 NC 세포와 같은 분화 것으로 나타났습니다.

    NC의 EMT 및 마이그레이션을 관리하는 다수의 분자 메커니즘은 암 (37) 전이성 보급에 참여하고 있습니다. 이 프로토콜을 제공하는 것을 목적으로, 간단한 저렴하고 effici발달 생물학 및 이러한 핵심 세포 행동의 근본적인 메커니즘을 탐구하는 다른 연구자 천만 도구입니다.

    공개

    저자가 공개하는 게 없다.

    감사의 말

    저자는 도움이 토론과 문화원 퀴리의 동물 시설에 대한 피브로넥틴, 에릭 Theveneau에 이식편의 사진을 Adeline 돌리 감사합니다. CM은 지역 일 드 프랑스 (도멘 드 Interet 죄르 장대 줄기), 대학교 파리 수드 (아타 Temporaire 디부 Enseignement 엣 드 공들인), 그리고 직원은 국립 드 라 공들인의 박사 후 동료입니다. 이 작품은 대학교 파리 수드 (Attractivite 2011), 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique (액션 Thematique 등 Incitative 쉬르 프로그램), 협회 부어 라 공들인 contre 르 암 그랜트 SFI20101201882, 리그 contre 르 암과 직원은 국립 드 라에 의해 투자되었다 공들인 (직원은 국립 드 라 공들인 프로그램 블랑).

    자료

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Fibronectin from bovine plasmaSigmaF4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction VEuromedex04-100-811-CLower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000FST26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mmFST11252-20

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