Рассечение

Этот протокол описывает, как препарировать премиграторных черепной нервный гребень (NC) от Xenopus Laevis neurulas. Эти экспланты можно покрыть на фибронектине и культивировали в пробирке, или привиты обратно в эмбрионы хозяев. Этот метод позволяет изучать механизмы НК эпителий-в-мезенхимы перехода, миграции и дифференциации.

Нервного гребня (NC) является переходным население спинной нервной трубки клетка, которая подвергается переход эпителий-в-мезенхимы (EMT) в конце нейруляции, мигрирует широко к различным органам и дифференцируется в многих видов производных (нейроны, глиальные, хрящи и кости, пигментные и эндокринные клетки). В этом протоколе, мы опишем, как рассекают премиграторных черепной NC из эмбрионов Laevis Xenopus, с целью изучения развития NC в естественных условиях и в пробирке. Лягушка модель имеет много преимуществ для изучения раннего развития; обильные партии имеются, эмбрионы развиваются быстро, в естественных условиях усиления и потеря стратегий функциональных позволяют манипуляции экспрессии генов до NC вскрытия в донора и / или эмбрионов хозяев. Эксплантаты NC можно покрыть на фибронектине и используется для исследований в пробирке. Они могут быть культивированы в течение нескольких дней в бессывороточной среде. Мы также описать, как привить ЧПУ эксплантов назадв эмбрионы принимающих для изучения NC миграцию и дифференцировку в естественных условиях.

Нервного гребня (NC) является переходным эмбриональных клеточная популяция, которая возникает из нервной трубки в конце нейруляции у эмбрионов позвоночных. События сигнализации и генетические, которые контролируют спецификации NC начаться уже в гаструляции. NC задается на границе между нервной и не-нейральной эктодермы по сигналам от окружающих спинной тканей. В конце нейруляции, NC клетки пройти переход эпителий-в-мезенхимы (EMT) и мигрируют широко в зародыше следующее стереотипных маршрутов, отвечая на окружающих руководящие сигналы. После того, как они достигли своего конечного пункта назначения, они дифференцируются в широкий спектр производных, например нейронов, глии, кости, хрящи и пигментных клеток ^1-5. Из-за их вклад в многих типах клеток и эмбриональных тканей, дефектов на любом этапе НК развития клеток, от индукции до конечной дифференциации, может вызвать врожденные синдромы названные neurocristopathies ^6. Experimental манипуляции с развивающейся NC на разных стадиях - Спецификация, ЕМТ, миграции и дифференцировки - улучшит наше понимание neurocristopathies и позволяют дизайн потенциальных терапевтических стратегий.

Xenopus Laevis эмбрион является моделью выбора для изучения развития ЧПУ. Большое количество эмбрионов легко получить, и внешний оплодотворение дает доступ к самых первых шагов развития. Многие инструменты доступны для экспериментально манипулировать X. Laevis эмбрионального развития. Джин усиления из-функции и нокдаун легко выполнить с помощью microinjecting отдельные клетки ранних Бластулы. Эмбриональные ткани можно вырезать для реассоциации в пробирке ^7-11 или обратно-прививки анализов ^12,13.

В этом протоколе, мы опишем, как рассекать из премиграторных черепной NC в X. Laevis поздно neurulas, до ​​миграции. Эти экспланты можно культивировать на фибронектина-Coateд пластины для изучения миграции и дифференциации в контролируемых в пробирке экспериментальных условиях. NC экспланты также могут быть привиты в нормальных или манипулировать эмбрионов принимающих изучать их миграции и дифференциации в естественных условиях.

Эксперименты соответствовать государственным и европейских правилах, касающихся защиты животных, используемых для научных целей и с международно установленных принципов замены, сокращения и уточнения.

1. Подготовка Фибронектин покрытием блюда ¹⁴

1. Пипетка 500 мл 10 мг / мл культуральной класса фибронектина, разведенного в 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в стандартной пластиковой чашке Петри (диаметр 40 х 11 мм). Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Примечание: при использовании стеклянной посуды или покровные стекла для последующего изображений, использовать 100 мг / мл фибронектина решение.
2. Промыть три раза 1х PBS.
3. Заменить PBS 500 мл 1x PBS с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
4. Промыть три раза 1х PBS.
5. Залейте 1x PBS и держать при температуре 4 ° С до использования (обычно в течение 24-48 часов).

2. Вскрытие ЧПУ эксплантов

3. Плакировка Экспланты на фибронектине

1. Принудительная покрытой фибронектином блюдо с модифицированной Danilchick среды (МДМ, NaCl 53 мм, Na2CO _3, 5 мм, К глюконат 4,5 мм, Na глюконат 32 мм, MgSO ₄ 1 мм, CaCl ₂ 1 мм, BSA 0,1%, корректировки РН до 8,3 с помощью 1 М Bicine ^18).
2. Трансфер эксплантов в покрытой фибронектином блюдо с использованием P1000 пипетки. Никогда не позволяйте экспланты коснуться интерфейс воздух-жидкость. Во-первых, некоторые жидкости пипеткой в ​​наконечник, то эксплантаты, то некоторые снова жидкость. Не допускайте воздух в наконечник при передаче эксплантов в покрытой фибронектином блюдо. Как только верхушка находится внутри жидкости, покрытой фибронектином блюдо, пусть экспланты медленно спуститься под действием силы тяжести, или нажмите очень мягко. Избегайте слишком быстро извлечения эксплантов.
3. Поместите 10-30 эксплантов в блюдо с помощью бровей нож. Избегайте стороны блюдо, которые не являются достаточными для последующей визуализации.
4. Старайтесь не перемещать антенну до экспланты не приложил на фибронектина (она занимает около 15-30 мин). При необходимости перемещения антенны очень тщательно.
5. Место блюдо в охлажденном инкубатора (между 15-20 ° С, для температуры на высотах см. ^17). При помещении при 15 ° С, клетки аре правило миграции эффективно и рассеяния после 6 часов инкубации (это сроки могут варьироваться от экспериментов).

4. Прививка эксплантов в хост эмбрионов

1. Вырезать тонкой стеклянной покровное на очень мелкие кусочки, используя грубые щипцы. Размер кусков должно быть приблизительно 1,5 мм ^2. Погрузите куски в чашку Петри, содержащую 3/4 NAM или PBS с помощью щипцов.
2. Подготовка принимающей эмбриона: рассекать из хозяина NC в 3/4 ДН, как описано в пункте 3) с особой тщательностью, чтобы не повредить хоста эмбриона при удалении желточной оболочки и рассекает NC. Ткань напряжение имеет тенденцию к увеличению размера абляции: пусть хозяин эмбрион исцелить частично в то время рассечения доноров эмбрионов.
3. В другом агарозном покрытием блюдо или в другой части того же самого блюда, рассекать из эксплантов NC от доноров эмбрионов, как описано в Протоколе 3. Передача трансплантата NC в чашку, содержащую хост с осторожностью, как описано вПротокол 3.
4. Сразу же место эксплантов NC на принимающей абляции области с помощью щипцов. Эксплант должны придавать частично. Положите кусок покровного стекла на привитого эмбриона для поддержания трансплантат на месте. Выберите кусок стекла больше, чем эмбриона, чтобы избежать его повреждения. Эмбрион будет немного сплющенные.
5. Подождите не менее 15-20 мин, затем аккуратно снимите покровное. Пусть эмбрион восстановить в течение еще 10 мин и осторожно пипеткой его в чистую посуду, заполненную 3/4 ДН, с помощью пластиковой пипетки Пастера.

При посеве на фибронектина, нервного гребня экспланты быстро прикрепить (15-30 мин) и эксплантат распространяется плоским течение 2 часов (рис. 1А). После 3-6 час клетки начинают разбрасывать. На 24 ч при 15 ° С, многие клетки начали мигрировать от эксплантов (фиг. 1В и 1С). Желток делает клетки очень яркий под фазового контраста (рис. 1В). Сотовые выступы (filopodes и lamellipodes) отчетливо видны после фаллоидина окрашивание цитоскелета актина (рис. 1в).

Для эксперимента ортотопической прививки, эмбрионы доноры инъецировали мРНК GFP, чтобы следовать привитых клеток в немеченого принимающей эмбриона. Черепной NC была удалена на одной стороне хоста; 30-60 мин после операции трансплантат зажила, заменив абляции множество черепной NC (рис. 1D, 2 часами после прививки). Через несколько часов, то GFP-позитивные клетки мигрировалииз эксплантата и следовали стереотипные миграционные пути NC клеток по отношению к вентральной черепно-лицевых местах (рис. 1E). В головастиков, NC-производные черепно-лицевые структуры разработали (рис. 1 г). Когда черепной NC была удалена, эти структуры отсутствовали, в результате чего лица с укороченной глаза, примыкающей к цементной железы (рис. 1H, красные стрелки). В привитых головастиков, донорские клетки NC внесли свой ​​вклад в черепно-лицевых структур, в результате чего в нормальном лицевой морфологии (фиг. 1F и 1I, зеленые стрелки).

Рисунок 1. В пробирке и в естественных условиях поведения эксплантированной черепной NC. AC)   Премиграторных NC рассекалииз стадии 17 нейрулы эмбриона и высевали на покрытой фибронектином блюдо. A) 2 ч после посева, эксплантат придает и распространяться. Б) 24 часа в сутки после посева, клетки эффективно мигрировали на фибронектина. C) ламеллиподий и филоподии отчетливо видны в переходе NC клетки, меченные фаллоидином (зеленый) этап DI) нейрулы 17 GFP + помечены премиграторных NC был взят из GFP впрыском эмбриона и бэк-привитой в хозяйскую эмбриона, из которого черепно NC был абляции на стадии 17. - 18. Г) Через два часа после прививки, эксплантат зажила. EF) привитого NC клетки активно мигрировали и заселили нижнечелюстной поток, как показано на головастика этапе 31 и 41. стадии G) управления 41 головастик. H) абляции NC имеет привело к резкому отказа лица и развития глаза (Н: обратите внимание, что цемент Гланд развивается рядом с глазом, в связи с отсутствием NC клеток, населяющих челюсти области, красные стрелки. . Сравните контролировать головастика в G) F, I), напротив, привитые клетки NC восстановили глаз и развитие черепно-лицевой сооружения (F, I, зеленые стрелки) переменного тока, масштабные линейки = 100 мм;. Д.И., Шкала бар = 1 мм . D, вид спинной. Е.И., вид сбоку. Эта цифра была изменена с Милет и соавт. ¹² Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Этот протокол описывает простой метод для эксплантата премиграторных черепной NC в эмбрионах Laevis X.. Эмбрионы, используемые для таких экспериментов должны быть надежными и заживают. Отменить любые партию нездоровых эмбрионов. Кроме того, эмбрионы растут при различных температурах (от 12 до 18-20 ° С), для того, чтобы вырезать нервный гребень на этапе 17, а не позже. После стадии 17, нервный гребень может быть смешан с головной мезодермы и не может быть удалена полностью. Xenopus ткани быстро заживают и затем теряют свою адгезию к другим тканям. Важно, чтобы работать быстро и поместить нервного гребня эксплантов в хозяина, как только он вырезают из донора.

Что касается в пробирке эксперименты, фибронектин культуры блюда может получить загрязненные бактериями или грибками через пару дней. Используйте антибиотиками и чистый или стерильный материал и решения как можно чаще.

Эта процедура оптимизирована еили черепно нервного гребня. В самом деле, эта ячейка население четко определены и локализуется в стадии 17 эмбрионов Xenopus. К сожалению, эта модель не подходит для выполнения таких экспериментов на магистральной NC. Эмбрионы птиц больше подходят для тех, кто заинтересован в манипулировании такой ствол NC клеточной популяции.

Эксплантаты описанные в этом протоколе может быть использован для изучения различных аспектов НК поведения, как в естественных условиях и в пробирке. Молекулярная программа ЧПУ развития в значительной степени сохраняется у позвоночных ^19. Лягушка развитие является мощным моделью для изучения позвоночных NC EMT, миграцию и дифференцировку. X. Laevis эмбриональные клетки содержат достаточно желток, чтобы позволить их выживание в пробирке в течение нескольких дней без добавления какого-либо внешнего питательного вещества. Таким образом, исследования в пробирке может проверить влияние различных факторов роста или химических соединений, в простой и полностью контролируемой питательной среде. Такие эксперименты былипредназначен для анализа EMT и миграции, в том числе изучения эффектов химио-аттрактантов или химио-репеллентов, активировать или блокировать сигнальные пути и т.д. ^14,20-24 Этот подход также может быть использована для разработки улучшенных направленной дифференцировки протоколы ЧПУ. В контексте разработки протоколов для регенеративной медицины, получение разнообразных NC-производные типы клеток в пробирке могут быть использованы в скрининге лекарственных для понимания и лечения neurocristopathies ^25,26.

Развитие ЧПУ организованы сложного взаимодействия между сотовыми автономных правил и сигналов от окружающих тканей. Экспериментальные манипуляции экспрессии генов, либо в доноров NC или в принимающей эмбриона, позволяют дискриминацию клеток автономной от noncell автономных аспектах развития НК. Объединение усиления из-функции и нокдауна подходы к этому протоколу для культуры в пробирке и в естественных условиях прививки успешно использоватьг ^{14,21,23,27-36.}

Эта техника может быть адаптирована для прививки других тканей в эмбрионы принимающих и проверить их миграции и дифференцировки потенциалов. Например, мы использовали плюрипотентных бластоцель эктодермы на крыше ("животное колпачок") искать минимальной транскрипции переключатель для развития НК. Мы изучали влияние двух факторов транскрипции, Pax3 и Zic1, на НК приверженности и последующего развития. Животных шапки с Pax3 и Zic1 усиления из-функции высевали на фибронектине в пробирке или backgrafted в эмбрионы хозяев. Мы обнаружили, что Pax3/Zic1-induced клетки мигрируют и дифференцируются как добросовестных NC клеток в пробирке и в эмбрионах принимающих ^12.

Многочисленные молекулярные механизмы, которые управляют NC EMT и миграции также участвуют в метастазирования при раке ^37. Этот протокол направлен на предоставление простой, дешевый и коэффициентами полезногоЛОР инструмент для биологов развития и другими исследователями для изучения фундаментальных механизмов этих ключевых поведения клеток.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Авторы благодарят Adeline Долли для картин эксплантата на фибронектина, Эрик Theveneau за полезные обсуждения и вивария Института Кюри. CM является докторской парень из области Иль-де-Франс (Domaine d'intérêt Majeur стволовых полюс), Universite Paris Sud (атташе Temporaire d'Enseignement др. де Recherche) и Национальное агентство по де-ла-Recherche. Эта работа финансировалась по Universite Paris Sud (Attractivite 2011), Национального центра де-ла-Научных Исследований (Программа действий Thematique ET Incitative сюр), Ассоциации залить ла Recherche Контр ле Рак Грант SFI20101201882, Лига Контр ле Рак, и Национальное агентство по Recherche (Agence Nationale-де-ла Recherche Программа Блан).