Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon

Burada tam ¹⁵ N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Plazma membranı mikro bölgeler lipid ve sterol ortamının fiziksel özelliklerine göre özellikleri ve süreçleri sinyalizasyon özellikle rollere sahiptir. Proteomik analiz için bitki hücrelerinden sterol bakımından zenginleştirilmiş membran mikro bölgelerini ayıklama çok hazırlık adımları ve diğer hücre bölmelerinden kontaminasyonların kaynaklarına esas olarak zor bir iştir. Plazma membranı, bir bitki hücresinde, tüm membran sadece yaklaşık% 5-20 teşkil eder ve bu nedenle, yüksek düzeyde saflaştırılmış plazma membran fraksiyonunun izolasyonu zordur. Sık kullanılan bir yöntem, 95% ¹ bir saflığı olan plazma zar vezikülleri verir polietilen glikol ve dekstran, sulu iki aşamalı bölümleme içerir. Plazma membranı içinde Sterol zengin zar mikro bölgeler alkalik pH seviyelerinde de soğuk bir noniyonik deterjan ile muamele üzerine çözünmezler. Bu deterjan, dirençli membran fraksiyonu olarak ultra-santrifüj ile hacmi, plazma membran ayrılabilirucrose degrade ^2. Daha sonra, proteinler, metanol / kloroform çökeltme sükroz gradyanı düşük yoğunluklu bant elde edilebilir. Çıkarılan protein daha sonra, sindirilmiş tuzu alınır ve son olarak LC-MS/MS ile analiz tripsin edilecektir. Sterol zengin mikro bölgeleri için bizim çıkarma protokolü Arabidopsis thaliana hücre kültürlerinden temiz deterjan dirençli membran fraksiyonlarının hazırlanması için optimize edilmiştir.

Biz faiz ³ biyolojik tedavisi sonrasında nicel karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için sadece azot kaynağı olarak K ¹⁵ NO ₃ ile Arabidopsis thaliana süspansiyon hücre kültürlerinin tam metabolik etiketleme kullanın. Ortak protein çıkarımı için, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücre kültürlerinin eşit oranlarını karıştırılarak son sayısal sonuç üzerinde hazırlık aşamalarının etkileri minimumda tutulur. Ayrıca, ekstraksiyon sırasında malzeme kaybı kontrolü ve aynı şekilde muamele örnekleri, her ikisi de bir etkileyecekd Bu nedenle ışık ve kaldırma peptidin oranı sabit kalır. Önerilen yöntemde etiketli veya diğer denetim ⁴ olarak görev yaparken etiketsiz hücre kültürü, bir biyolojik tedavi uğrar ya.

1972 yılında, Jonathan Singer ve Garth Nicolson genellikle 1960'ların başında kabul edilen protein-lipid-protein sandviç modeli yerine, akışkan mozaik modeli hücre zarının bir yapı modelini önerdi. Singer ve Nicolson biyolojik zar tüm lipid ve protein molekülleri serbestçe ve kolayca ⁵ yaygın iki boyutlu bir sıvı olarak kabul edilebilir olduğu varsayılmaktadır. O zamandan bu yana, zar bileşimin plazma zarı ve bilginin bir yapı modeli daha da karmaşık bir hale geldi. Özel olarak, plazma membranı içinde, bu protein kompleksleri ve lipid / sterol göre yapısal bozukluğu olan yapıların mikro bölgeleri olarak görülebilir. Yapay modeli membranlar ^6,7, steroller ve spingolipitler yanal değişmiş fiziksel özelliklere sahip bölgeleri oluşturmak için diğer lipid türlerden ayırmak olabilir. Hücre zarının içinde bu ayrılma esas sterol ve yüksek sa arasındaki kendiliğinden ilişkilendirerek özelliklerine neden olurphopsho ve sfingolipidler ⁸ turated hidrokarbon zincirleridir. Özellikle sert sterol halkaları sert ve düz doymuş yağ türleri ve bu etkileşimler membran kalınlığı ve sertliği arttırarak, daha genişletilmiş konfigürasyonlar halinde komşu hidrokarbon zincirlerini kuvvet ile etkileşimleri lehine.

Sterol zenginleştirilmiş membran mikro bölgeleri arasında sık görülen özelliklerinden biri, non-iyonik deterjanlar, böyle bir Triton X-100 veya Brij 35 ile muamele üzerine kendi çözünmezlik oldu. Bu fraksiyonlar membran microdomains ile özdeş olduğu düşünülmüş ve bunların biyokimyasal hazırlama yöntemi ² dayalı deterjan dayanıklı membranlar (DRM) çağrıldı. DRM çıkarma sırasında iyonik olmayan deterjanların kullanılması biyokimyasal DRM hazırlık doğrudan canlı hücrenin ⁹ içinde herhangi bir spesifik membran bölmesine uygun olmayabilir gibi bazı eleştiriler aldı. Özellikle, protein oranı deterjan, bu tür müstahzarlar içinde önemli görünen birs değişik deterjanlar, yanı sıra farklı deterjan miktarlarda deterjan dirençli membran fraksiyonunun ¹⁰ farklı bileşim verebilir. Bununla birlikte, belirli bir protein, özellikle bu tür hücresel sterol zengin zar etki ile ilişkilendirmek ve bu proteinlerin iyi deterjan dayanıklı membran fraksiyonlarının ¹¹ biyokimyasal preparasyonlarda zenginleştirilmiş olduğunu gösteren kanıtlar vardır. Bitki DRM fraksiyonunda bulundu ve DRMS ​​mevcudiyeti sterol bağımlı olduğu için protein çekirdek, örneğin fasciclin benzeri arabinogalaktan proteinleri (Flaş) ve Stok protein aile üyeleri olarak, özellikle GPI-sabitlenmiş proteinlerin, idi. Ayrıca, böyle bir reseptör benzeri kinazlar veya fosfolipazlar gibi bazı sinyal proteinleri, ^11, bulunmuştur. Bu sonuçlar memeli zar microdomains ^12,13 birçok proteomik çalışmalar ile uyumludur. Ayrıca bitkilerde stres yanıtı ¹⁴ bağlamında membran mikro bölgeleri rolü için bulgular artmaktadır ^-16.

Burada açıklanan protokol plazma membranı mikro bölgeleri fraksiyonasyonu için güçlü bir yöntem sağlar ve özellikle de bize sterol zengin zar bölmesinin ^4,11,14 stres kaynaklı değişiklikleri tasvir sağlar deterjan konsantrasyonuna bir proteini kullanır.

PROSEDÜRÜ

Ekstraksiyon protokolü yaygın olarak kullanılan reaktifler ve tamponlar:

1. Arabidopsis thaliana hücre süspansiyon kültürleri için JPL orta
   • 3 uM H ₃ BO ₃
   • 3 mcM MnSO ₄ x H ₂ O
   • 1,1 uM ZnSO ₄ x 7H ₂ O
   • 0.15 uM KJ
   • 0.03uM Na ₂ MoO ₄ x 2 H ₂ O
   • 3 nM _CoCl2 x 6 _H2O
   • 3 nM CuSO ₄ x 5H ₂ O
   • 0.9 mM _CaCI2 x 2 H ₂ O
   • 0.5 mM MgSO ₄ x 7H ₂ O
   • 0.5 uM FeSO ₄ x 7H ₂ O
   • 0.5 uM EDTA ₂ x 2 H, Na ₂ O
   • 0.12 mcM tiamin HCl
   • 0.16 uM nikotinik asit
   • 0.097 uM piridoksin HCl
   • 0.107 mM NAA
   • 0.375 mM KH ₂ PO ₄
   • 0.061 mM NaH2 PO ₄ x 2 H ₂ O
   • 0.039 mM Na ₂ HPO ₄
   • 0.027 mM glisin
   • 0.56 mM miyo-inositol
   • % 1.5 sukroz
   • 10 mM K ¹⁴ NO ₃ ya da 10 mM K ¹⁵ NO ₃

Not: JPL ortamının pH, KOH ile 5.7 'e ayarlanmalıdır. Ortam, filtreleme ya da otoklav kullanılmadan önce sterilize edilmelidir.

2. Tampon H
   • 100 mM HEPES-KOH (pH 7.5)
   • 250 mM sukroz
   • % 10 (a / h) gliserol
   • 5 mM EDTA
   • 5 mM askorbik asit
   • % 0.6 (ağ / hac) PVP K-25 veya K-30
   • 5 mM DTT (taze ekle)
   • 1 PMSF (taze ekle)
   • proteaz ve fosfataz inhibitörleri (taze ekle)
     • 50 mM NaF
     • 1 mM Na ₃ VO ₄
     • 1 mM benzamidin
     • 0.3 uM mikrocystin
     • 4 uM löpeptin
     • proteaz önleyici kokteyl
3. Tampon R
   • 5 mM potasyum fosfat
   • 0.33 M sükroz
   • 3 mM KCl
   • 0.1 mM EDTA
   • 1 mM DTT (taze ekle)
4. Tampon TNE
   • 25 mM Tris-HCI, pH 7.5
   • 150 mM NaCl
   • 5 mM EDTA
5. İki fazlı bir sistem (6 g sistemi örnek taze ağırlığın en fazla 15 g uygundur) hazırlama yöntemi
   Aşağıda listelenen ve 15 ml Falcon tüpü karışımı katkı maddeleri olarak iyice karıştırın:
   • % 20 (ağ / ağ), dekstran T500 - 2.6 g
   • % 40 (ağırlık / ağırlık), poli (etilen glikol) (PEG 3350) - 1.3 g
   • sakaroz - 0.678 g
   • 0.2 M potasyum fosfat, pH 7,8-0,15 mi
   • 2 M KCl - 0.014 mi
   • İki fazlı bir sistemin toplam kütlesi 6 g kadar su ilave edilir.
6. TNE sukroz tamponu içinde çözeltiler
   • 2.4 M, 1.6 M, 1.4 M, 0.15 M
7. Tripsin sindirim için reaktifler
   • ÜTÜ: 6 M üre, 2 M tiyoüre (10 mM Tris-HCl pH 8.0)
   • İndirgeme tampon maddesi (su içinde 1 ug / ul DTT, 6.5 mM)
   • Alkilasyon tampon maddesi (su içinde 5 ug / ml iyodoasetamid, 27 mM)
   • LysC endopeptidaz (0.5 ug / ml)
   • Tripsin, modifiye dizilim derecesi (0.4 ug / ul)
8. C ₁₈ üzerinde peptid tuzsuzlaştırma için Reaktifler
   • yeniden süspansiyon çözeltisi:% 2 trifloroasetik asit (TFA), su içinde% 5 asetonitril
   • Çözelti A:% 0.5 asetik asit
   • çözelti B:% 80 asetonitril,% 0.5 asetik asit
9. Phosphopeptide zenginleştirme için Reaktifler
   • Çözelti A:% 0.1 TFA,% 5 asetonitril
   • Çözelti B:% 0.1 TFA,% 80 asetonitril
   • _TiO2 10 mikron
   • Amonyak (hisse senedi% 25 çözelti)
   • Piperidin (hisse senedi% 100)

PROTOCOLS

1.. Arabidopsis thaliana hücre süspansiyon kültürleri metabolik etiketleme

1. Arabidopsis Col-0 hücreye büyütünTam ¹⁴ N-JPL ortam içinde ¹⁷ yaprak türetilmiş süspansiyon kültürleri, 80-100 mmol / m 'de sabit ışık durumda steril bir şişe içinde ¹⁵ N-JPL ortam içinde ve kültürlerin bir takım ⁽¹⁸ "ortak reaktif maddeler ve tampon maddeleri" bölümüne bakınız) 120 rpm'de çalkalanarak sabit altında ² s, 23 ° C,.
2. Hücre kültürlerinin muhafaza edilmesi için, 1 litre şişeler yedi günlük hücre kültürü, 40 ml taze JPL ortamının 400 ml'sini aşılamak.
3. Hücre kültürlerinin Hasat paslanmaz çelik bir ağ ile geniş bir cam huni içinden vakumlu emme yoluyla gerçekleşir. Hücreler, gözenekli plaka üzerinde ve huni içinde birikir ve oradan kolayca toplanabilir. Hücreler, öğütmeden önce -80 ° C'de ya da sıvı nitrojen içinde dondurulur edilmesi tavsiye edilir.

NOT: ¹⁵ N için metabolik olarak etiketlenmiş hücre kültürleri, iki hafta içinde ¹⁹ boyunca en az iki geçit bir azot kaynağı olarak sadece K ¹⁵ NO ₃ kullanın. Deneyimlerini deKarşılaştırmalı proteomik için riments, ¹⁵ N etiketli hücre kültürü kullanmak normal bir ortam içinde bir kültür etiketlenmemiş korumak. Diğer (Şekil 1) bir kontrol olarak hizmet ederken Biyolojik arıtma sonra, işaretlenmiş veya işaretlenmemiş ya kültüre uygulanacaktır. Protein hazırlanması için, her ikisi de kültürler ²⁰ birleştirilecektir. Deney düzeneği planlama, bir karşılıklı etiketleme Aynı işlem bir kez etiketlenmemiş hücrelere ¹⁵ N-işaretli hücrelerin bir kez uygulanır ve hangi kurulum ⁴ ile ilgili etiketlenmemiş veya ¹⁵ N-işaretli hücrelerin kontroller olarak hizmet dikkate önerilir. Bu durumda, hücre kültürlerinin çift miktarlarda ihtiyaç vardır.

2. Plasma Membrane Arıtma

NOT: Aksi belirtilmediği sürece bütün ileri adımlar soğuk odanın ve / veya buz üzerinde gerçekleştirilir.

1. Sıvı azot içinde 7 günlük hücre süspansiyon kültürlerinin yaklaşık 1 L hücreleri homojenize.Bu malzeme daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. Bir çanak içinde taze ağırlığına göre, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş dondurulmuş hücre kültürlerinin aynı miktarlarda karıştırılır ve hemen tampon H 2 hacim ekleyin. Membran microdomain hazırlanması durumunda en az 7 g hem etiketli ve etiketsiz hücrelerin taze ağırlık kullanmak için tavsiye edilir.
3. Bir çalkalama kabı yerleştirmek ve malzemeyi eritilir ve çözelti, su ve buz kristalleri olmadan dek çalkalayın.
4. 50 ml santrifüj tüplerine Miracloth tabakası üzerinden filtre Homojenat.
5. 8 dakika boyunca 10,000 x g'de tampon, H ve santrifüj ile Denge örnekleri.
6. Yaklaşık 32 ml'lik bir hacme sahip, önceden soğutulmuş bir ultra-santrifüj tüpleri (Beckman Coulter rotor SW31Ti örneğin) içine yerleştirin süpernatant
7. Denge tampon maddesi H ile örnekler ve Beckman SW32Ti bir rotor kullanılarak 30 dakika boyunca 4 ° C'de 100,000 x g'de santrifüj ile pelet mikrozomları.
8. Santrifüj sonra süpernatant kaldırmak.

NOT: Üst faz, çözünür proteinler içerir. Bu fraksiyonun bir miktar aynı zamanda, çözünür proteinler ayrıca protein çökeltme ve sonraki analiz için kaydedilebilir.

9. R tamponu içinde bulunan bir miktarda her bir numunenin zar topağı yeniden süspanse edin ve U1, iki fazlı bir sistemin üst kısmında (Şekil 2) üzerine yerleştirin. 6 g, iki fazlı bir sistem kullanıldığında, zar yeniden süspansiyon haline getirilmiş pelet tam olarak 2 g yük.

Not: tampon R nihai hacmi (6 g sistemi kullanılırken tampon R'nin 1.6 ml tabi ~) kullanılacak olacak iki fazlı sistemin büyüklüğüne bağlıdır. Bu, çok saf tampon yerine iki fazlı sistem üzerine bütün örnek yüklemek mümkün çözündürme için çok fazla tamponu kullanılarak ve zaman, talep ağırlığı elde etmek için iki aşamalı bir sistem üzerine eklenebilir yeniden süspanse edilmesi için daha az tampon kullanılması önerilir.

10. Th için kullanılan tampon olarak saf R aynı hacimde yükU2 üzerine e örnek resüspansiyon.
11. Yavaş yavaş onları 30x (yaklaşık 1 inversiyon / sn) çevrilmesi ile U1 ve U2 tüpler karıştırın.

NOT: şiddetle iki-fazlı sistemi sallamayın. Bu ultra-santrifuj aşamada Fazların ayrılmasından eksikliği neden olabilir.

12. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de örnekleri santrifüj.
13. Santrifüj sonra süpernatant kaldırmak.
14. U2 üzerine U1, üst faz transferi ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de santrifüj tekrarlayın.
15. SW41Ti ultrasantrifüjdeki tüplerin içine U2 Üst faz Taşı ve tampon R beş ciltlik ile sulandırmak ve iyice karıştırın.

NOT: Nihai üst faz beş kez seyreltilmiş edilebilir önce ayrı ultrasantrifüjdeki tüplere ayrılabilir gerekebilir.

16. SW41Ti bir rotor kullanılarak bir saat boyunca 4 ° C'de 200,000 x g'de örnekleri santrifüj.
17. Smal süspanse membran peletTNE tamponu miktarda deterjan dirençli membran izolasyonu için (tipik olarak 200 ul tampon kullanılır).

NOT: Bu fraksiyonun bir miktar bölünmemiş plazma membranının analizi için kaydedilebilir.

NOT: Plazma membranı fraksiyonu bir gece boyunca deterjan dayanıklı membran ve çözünebilen fraksiyonlar halinde deterjan fraksiyonasyon önce 4 ° C'de saklanabilir.

3. Deterjan dayanıklı Membran Hazırlanması

1. Bradford tahlili ile plazma membran fraksiyonunun konsantrasyonu kontrol edin.
2. Plazma zar fraksiyonu için Triton X-100 ilave edin. Deterjanın nihai konsantrasyonu% 0.5-1 arasında kalmalıdır. Ağırlık oranı protein ağırlık deterjan 13-15 arasında kalmalıdır.
3. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de yaklaşık 100 rpm'de çalkalayın örnekleri.
4. Sukroz, 1.8 M nihai konsantrasyon elde etmek üzere muamele edilmiş plazma zarının bir hacim 2.4 M sukroz, üç sayılarını. '/ Li>
5. Şekil 3'te gösterildiği gibi, 1.8 M fraksiyonu üzerindeki ilgili sakaroz çözüm yüklenerek SW41Ti ultra santrifüj tüplerinde sükroz gradyanı hazırlayın.
6. Beckman SW41Ti bir rotor kullanılarak 18 saat boyunca 4 ° C'de 250,000 x g'de örnekleri santrifüj.
7. Dikkatlice 0.15 M/1.4 M sükroz ara yüzeyinde bir sütlü halka olarak görülebilir düşük yoğunluklu bandının bozmamak için rotordan ultrasantrifüj tüpleri çıkarın. Bazen hiçbir görülebilir, ancak bir bölümü halen deterjan dayanıklı protein fraksiyonunu içerir.
8. Gradyanın tepesinden 0.75 ml hacim fraksiyonu çıkarın. Fazlar arası halka ve aşağıdaki 0.5 ml 'den yaklaşık 1.5 ml hacim kapak fraksiyonlar 2 ve 3 deterjan dayanıklı membran fraksiyonu temsil etmektedir. 15 ml Falcon tüpleri içine bu fraksiyonlar toplayın. Kısımlar 9 ve 10, deterjan çözünebilen membran fraksiyonu içeren ve de karşılaştırma için toplanabilir. Daha fazla analiz, havuz Fract içiniyonları 2 ve 3, hem de parçacıklar 9 ve 10,.

4. Metanol / kloroform ile deterjan Dayanıklı Fraksiyondan Proteinlerin çıkarımı

Not: Bütün aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Iyice fraksiyonlar toplanmış ve vorteks metanol 4 sayılarını.
2. 1 kloroform hacmi, vorteks iyice ekleyin.
3. Iyice su 3 hacimleri, vorteks ekleyin.
4. Bir tezgah üstü santrifüj (örneğin Eppendorf 5417R) kullanılarak 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje örnekleri.
5. Interfaz protein katman üzerinde sulu fazın çıkarın.
6. Iyice metanol 3 cilt, vorteks ekleyin.
7. 10 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüje örnekleri.
8. Süpernatantı ve pelet kurulayın. Kurutulmuş pelet in çözeltisi sindirim için hazırdır.

5. In-Tripsin çözeltisi sindirim

NOT: Bu yordam tüm adımlar de yapılırdenatüranlar ile amino asit yan zincirlerin türetme istenmeyen azaltmak için, oda sıcaklığı.

1. 6 M üre, 2 M thiurea, pH 8 (UTU) küçük hacimde bir örnek çözülür. Numunenin (genellikle yaklaşık 40 ul) ile uyumlu olarak, düşük hacim kullanın.
2. Çözünmeyen malzeme peletlendi, 10 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj (örneğin Eppendorf 5417R) 5000 x g UTU içinde çözünür Spin örnekleri.
3. Nihai çözeltinin pH'ı, uygun şekilde tripsin emdirme için 8.0 'a yakın olmalıdır. PH şeritleri ile kontrol edin.
4. Numune protein her 50 ug için indirgeme tamponu 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.

NOT: Protein içeriği yalnızca bir tahmindir gereklidir. Numune miktarı sınırlı olduğunda oldukça bir protein numunesi israf daha doğruluğunu kurban daha iyidir.

5. Her numune 50 ug protein için alkilleme tamponu 1 ul ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe.
6. 50 ug protein başına örnek lysC 0.5 ul ekleyin ve 700 rpm sabit çalkalama ile oda sıcaklığında üç saat süreyle inkübe edilir. Gerekirse, özet de bir gece boyunca gerçekleştirilebilir. Ancak, sıcak sıcaklıklarda uzamış zaman nedeniyle sulu pH 8 şartlarında plastik boru malzemesi adsorpsiyonu için peptid kaybını artırabilir olarak tavsiye edilmez.
7. Dört hacim 10 mM Tris-HCI, pH 8, örnek seyreltin.

Not: Bu adım tripsin yüksek tuzuna çok hassas olduğu gibi üre seyreltilmesi için kesinlikle gereklidir.

8. 50 ug protein başına örnek tripsin 1 ul ekleyin ve 700 rpm sabit çalkalama ile gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
9. PH 2 (% 2 trifloroasetik asit, yaklaşık olarak 1/10 hacim eklemek) ulaşmak için% 0.2 'lik nihai bir konsantrasyona kadar TFA örnekleri asitleştirmek.

NOT: Örnekler saklanabilir - daha fazla kullanılan 20 ° C kadar, ama saklamak için iyidir4 ° C'de StageTips üzerinde onları kısa bir süre (bir hafta) veya StageTips tuzsuzlaştırma sonra saklayın ise.

6. _{C18-StageTips} imalatı

1. Böyle bir tek kullanımlık plastik Petri kabı gibi düz, temiz bir yüzey üzerinde bir Empore Disk C18 yerleştirin.
2. 1.5 mm çapında bir künt uçlu derialtı iğne kullanarak küçük bir diski dışarı Punch. Disk iğne yapışır ve bir pipet ucu içine aktarılabilir.
3. Iğnenin dışında disk itin ve kaynaşık silika ya da iğnenin içinde bulunan uygun bir boru parçası tarafından bir pipet ucu arasında bir dar sabitleyin.

Not: StageTips, oda sıcaklığında ²¹ kuru saklanabilir.

7. Peptid tuz giderme ve Konsantrasyon için _{C18-StageTips} kullanımı

1. Hazırlanan StageTip üzerine çözelti B, 50 ul yerleştirerek bir _C18-StageTip hale getirin. Bir tezgah üstü c 2 dakika boyunca 2000 rpm'de santrifüj ucu Spinentrifuge (örneğin Eppendorf 5417R).

Not: bir Eppendorf santrifüj içinde StageTips dönmeye kullanımlar parçalar, sıvı, bir 2 ml reaksiyon tüpünde toplanacaktır. Daha büyük ölçekli preparatlar için, kademe uçlarına da 200 ul ipuçları 96 ile bir uç rafa yerleştirilebilir ve sıvı, bir mikrotiter plakası içinde toplanabilir.

NOT: nedeniyle ucundan C ₁₈ diski dışarı iplik riski bir tezgah üstü santrifüj (örneğin Eppendorf 5417R) 3.000 xg daha yüksek hızlarda kullanmayın.

2. 100 ul çözelti A, bir tezgah üstü santrifüj (örneğin Eppendorf 5417R) içinde 5,000 x g de santrifüj ucu Spin kullanarak StageTip dengelenmesi.
3. 2. adımı tekrarlayın.
4. Içeriye dikkatlice disk ile pipet içine örnek pipetleme diske yük örneği.

NOT: Bir disk yaklaşık bağlayabilirsiniz. 100 ug protein.

5. Ce ipuçlarını Spinntrifuge numunenin bütün hacmi _C18 disk üzerinden geçecek kadar.
6. Çözelti A 100 ul santrifüjde ipuçlarını Spin ile StageTips iki kez yıkayın.

Not: Yıkanan ve yüklü StageTips bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

7. Yeni bir 1.5 ml reaksiyon tüpünde eluatın toplamak çözelti B, 40 ul örnek Zehir.
8. Hızlı vakumda konsantre örnek. Sol sadece yaklaşık 1 ya da 2 ul sıvı olduğu gibi İdeal koşullar altında, dehidrasyon işlemi durdurun.

Not: Kuru örnekleri yıl için -80 ° C'de saklanabilir.

9. Örnek yeniden süspansiyon solüsyonu 9 ul'lik bir son hacim ekleme ve kütle spek analizi için mikrotitre aktarın.

Not: kullanılan yeniden süspansiyon tamponu nihai hacmi deneyi ve kütle spektrometresi hassasiyetine ihtiyaçlarına bağlıdırkullanılır.

8. Phosphopeptide zenginleştirme için alternatif Protokol

NOT: phosphopeptide zenginleştirilmesi için, aşama 2'de protein çıkarma fosfataz inhibitörleri varlığında yapılmalıdır.

NOT: Tam protein konsantrasyonu, aşağıdaki adımları için tespit edilmesi gerekmez. Bu gereksiz örnek kaybını önlemek için protein içeriğinin kaba bir tahmin için yeterli

1. _C8-StageTips (aşama 6 ₁₈ ° C de-StageTips hazırlanması için aynı protokol takip) hazırlayın.
2. Hazırlanan _C8-StageTips en transfer TiO _2-boncuk 1 mg (100 | ig protein başına için 1 mg TiO _2).
3. Bir tezgah üstü santrifüj (örneğin Eppendorf 5417R) 5 dakika boyunca 2,000 x g çözelti C, spin 100 ul TiO _2-ipuçları dengelenmesi.
4. (Bu çözeltinin 100 ul olmalıdır aşama 7.7 sindirilir ve tuzdan arındırılmıştır peptidlerin 100 ug karıştırınB) solüsyonu, A 100 ul
5. 1.000 xg, 5 dakika spin; dengelenmiş TiO ₂ sütun üzerine karışık örnek yükleyin.
6. Flow-through toplayın ve (ikinci geçişte sonra aracılığıyla akışını tutmak) yine aynı ucuna yükleyin.
7. Çözelti A 100 ul ile uç yıkayın, 2000 x g'de santrifüj, bir tezgah üstü santrifüj (örneğin Eppendorf 5417R) 5 min.
8. % 5 amonyak ile birlikte 50 ul örnek Zehir.
9. % 5 piperidin, 50 ul (her ikisi de sıvı kısımlar kombine edilebilir) ile örnek Zehir.
10. Hemen% 20 fosforik asit kullanılarak 50 ul örnek asitleştirmek. pH yaklaşık 2 olmalıdır.

NOT: _TiO2 ipuçları kaydedin ve toz almak. Bu, B çözeltisi ile yıkandı, ve bir ya da iki tur için tekrar kullanılabilir.

11. Yine (bkz. adım 8) C ₁₈ ipuçları üzerinde asitlendirilmiş örnekleri desalt.

9. Peptid Karışımlarının LC-MS/MS analizi

1. Desalted phosph süspanseyeniden süspansiyon tamponunda opeptides.
2. Yük seçim LC-MS/MS sistemine örnek yeniden süspanse ve yarı maksimum 60.000 tam genişlikleri önerilen çözünürlükte veri bağımlı modunda spektrumları elde.

NOT: Optimum parçalanma, nötr kaybı tarama ya çok aşamalı aktivasyonunu ^{23 22} uygulanabilir, veya varsa edilmelidir. ETD mevcut ise bu fosforik asit ²⁴ kaybı olmadan peptid omurgası parçalanma sağlayacaktır.

NOT: ham veriden Tepe listeleri ayıklanır ve veritabanı kimlik yanı sıra kantitatif için teslim olması gerekir. Burada, Maskot ve LTQ, LTQ-Orbitrap ve LTQ-FT araçların (Thermo Scientific) ham veri dosyaları için çalışır MSQuant kullanarak ayarlarını açıklar.

3. MSQuant yılında "Yardımcı" Menüsü içinde DTAsupercharge kullanarak pik listesini çıkarmak. Varsayılan ayarları kullan.
4. Maskot arama motoruna zirve liste dosyası çıkan gönderin. Critical ayarları: kütle tolerans 10 ppm iyon öncüsü, MS / MS kütle tolerans 0.5 Da. Sabit modifikasyonlar: sisteinlerin karbamido, değişken modifikasyonlar: metionin oksidasyon, fosforilasyon serin, treonin, tirosin. Kantitasyon yöntemi: ¹⁵ N metabolik etiketleme.
5. Web sayfası dosyası olarak Maskot sonucu kaydedin.
6. MSQuant içine Maskot sonuç dosyası ve ham dosya yükleyin. Ilgilendiren tüm proteinleri seçin ve "Otomatik nicelleştirilmesine" çalıştırın. Program ham dosyadan tam tarama spektrumları okumak ve her peptid etiketli ve etiketsiz ortakları için zirve entegrasyonu yapacağız.
7. Bir elektronik tablo programı veya bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyasına ihracat kantitasyon sonuçları. Veriler daha sonra Excel ya da Statquant ²⁵ ya da kraker ²⁶ gibi diğer yazılım paketleri kullanılarak ileri istatistiksel analiz için teslim edilebilir.

Metabolik olarak etiketlenmiş Arabidopsis hücre kültürleri kullanılarak sunulmuştur protokolü ile bitki dokusunun (Adım 2, Şekil 2 ve 4) plazma membranları izole ve plazma zarı içindeki deterjan dayanıklı zar fraksiyonları ettirecek mümkündür (aşama 3, Şekil 3 ve 5). Daha sonra, protokol izin verir, bu deterjan dirençli membran fraksiyonları (aşama 4) ve karşılaştırmalı proteomik analizi (aşama 5) için, proteinin sindirim proteinlerin elde edilmesi. Son olarak, Phosphopeptides (adım 8) 'nin isteğe bağlı zenginleştirme hücresel sinyal süreçler üzerinde çalışılması özellikle ilgi çekicidir. Son adım, daha sonra işaretlenmiş ve işaretlenmemiş hücre kültüründen membran fraksiyonlarının protein bolluğu oranlarının sayısal veri analizi (aşama 9, Şekil 6).

2-fazlı sistem (aşama 2) ve daha sonra santrifüj karıştırıldıktan sonra tipik sonuçlar açık renkli bir üst faz ve aYeşil alt faz (Şekil 2) renkli. Yeşil kloroplast ve diğer iç membranlar membran vezikülleri alt dekstran fazına dahil edilir ise plazma zar vezikülleri, tercihen, üst PEG faz ile ilişkilendirir. Renk ayrımı gözlenen edilemez ise, adım 2 doğru yürütülen değildi ve plazma membranlar iç zarının önemli miktarda kirlenmiş olacaktır. Plazma zar proteinlerinin zenginleştirilmesi, iki fazlı bir sistemin alt aşamasında plazma membran fraksiyonlarının ve proteinlerin küçük parçalar proteomik analizi ile gösterilebilir. Alt faz, hücrenin iç membranlar içerir. Örneğin, bu tür reseptör kinaz proteinleri gibi, özellikle, tipik, bilinen zar proteinleri, plazma, plazma zar fraksiyonu (PM) ve iç membranlar (IM) içeren alt faz fraksiyonu (Şekil 4A), düşük yoğunlukta, yüksek bolluk göstermektedir. Yüksek endoplazmik retikulum show da, bilinen proteinleriç zar fraksiyonu içinde bolluğu ve plazma zar fraksiyonu (Şekil 4B) gözlenmemiştir.

Deterjan dirençli membran fraksiyonları (aşama 3) ve daha sonra zenginleştirme ideal bir durumda düşük yoğunluklu zar veziküllerinin tüp yüksekliğinin yaklaşık olarak 1/5 ^th (Şekil 3) bir süt halkasının oluşumu ile sonuçlanacaktır. Protein oranı (aşama 3.2) Triton X-100 konsantrasyonları veya deterjanın ayarlama deterjan dirençli ve deterjan çözünebilen fraksiyonlar halinde ayrılması için uygun ise, ilave halkayı gradyanın alt kısımlarında görülebilir ve aynı zamanda membran kümeleri olacak düşük yoğunluklu bandında. Bu durumlarda, protein oranı ve toplam deterjan miktarda deterjan iki zar alanı fraksiyonların yeniden üretilebilir ayrılması için gerekli olan kritik misel konsantrasyonunun farklıdır. Protein oranı nihai deterjan konsantrasyonu ve deterjan kullanarak ENR, burada açıklananörneğin remorin gibi tipik protein mikro bölge, bir ichment (AT3G61260) ^27, bir DRM fraksiyonun karşılaştırmalı kütle spektrometrik analizi, deterjan çözünebilen fraksiyondan (adım 3.8) yanı sıra bölünmemiş plazma zarı ve iç membran tarafından teyit edilebilir. (Şekil 6A), beklendiği gibi remorin proteinin en yüksek bolluk DRM fraksiyonda bulunmuştur. Gibi ABC-taşıyıcı AT1G59870 (Şekil 6B) halinde membran mikro bölgeleri, mevcut olmayan proteinler, DRM fraksiyonu artan bir bolluk göstermezler. Örneğin 60S ribozom (Şekil 6D) arasındaki ATPase F0 kompleksi (Şekil 6C) ve ribozomal protein (At1G001100) bir mitokondriyal protein (AT2G07707) olarak da tipik kirleticiler, DRM fraksiyonunda zengin bir bolluk göstermezler minimal miktarlarda olsa da hala tespit edilebilir.

Plazmadaki protein fosforilasyon durumunun kütle spektrometrik analizi, protein bolluğu oranlar sonra, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücre kültürlerinin zar fraksiyonları kantitatif olarak (Şekil 6) ayırt edilebilir. MSQuant (tipik sonuçları msquant.alwaysdata.net ) kantitatif pencere belirlenen peptidler (Şekil 6A) çoğu için 1-1 arasında bir iyon yoğunluğu oranı göstermelidir. Iyon yoğunluğu oranı önemli ölçüde 01:01 sapma ile peptitler diferansiyel etiketli ve etiketsiz hücre kültürü arasında düzenlenir olarak kabul ve (Şekil 6C) uygulanan tedavi ile etkilenen proteinlere eşleşen adaylar vardır. Başarılı bir metabolik etiketleme iyi bir kalite kontrol eş elüsyon etiketli ve Şekiller 6B ve D 'de nano-HPLC ayırma (aşama 9) tek bir tepe noktası olarak etiketlenmemiş peptid sürümlerini gösterildiği gibi, her ikisi de.

Şekil 1. Tam metabolik etiketli ve etiketsiz A. thaliana'nın hücre kültürleri kullanılarak deneysel tasarım iki varyantın Metabolik etiketleme deneysel strateji. Şematik. Deneyci tersi biyolojik tedavi ya tabi bir kontrol ve (metabolik etiketli) ¹⁵ N hücreleri (etiketsiz) ¹⁴ N hücreleri kullanmaya karar verebilir. Karşılıklı deney tasarımı her iki varyant paralel olarak yürütülmektedir.

Şekil 2. Kloroplast ve diğer iç membranlar Bott ile ilişkili ise, polietilen glikol (PEG) ve dekstran dayanan bir sulu iki-fazlı sistem bitki zar veziküllerinin ayrılması için iş akışı. Plazma zar vezikülleri üst PEG faza ayrıldısantrifüj işleminden sonra om dekstran aşaması. Üst fazın ek yıkama ile, daha iyi bir temizleme elde edilebilir, ama aynı zamanda madde kaybı artar.

Şekil 3,. Düşük yoğunluklu membran fraksiyonlarının zenginleştirilmesi düşük yoğunluklu deterjan dayanıklı membran fraksiyonlarının zenginleştirilmesi için sukroz gradyanının. Gösterimi. Düşük yoğunluklu zar vezikül bandın bir gece boyunca santrifüj işleminden sonra beklenen konumu belirtilmiştir.

Şekil 4. İki fazlı sistemde saflaştırmadan sonra plazma zar proteinlerinin zenginleştirilmesi. Normalleştirilmişplazma membranı (PM) ve iç membranlar (IM) fraksiyon ölçülen proteinler için protein iyon yoğunlukları. (A) plazma zarının tipik bilinen bileşenleri IM fraksiyonunda daha PM fraksiyonunda daha yüksek bolluk göstermektedir. iç membran (B) bileşenleri, bilinen bir doğal ters davranışı gösterir. Normalleştirme için, her bir protein için iyon yoğunluğu miktarlar örnek başına toplam iyon yoğunluğunun bir kısım olarak ifade edildi ve daha sonra tekrardan arasında ortalama. Toplam iyon yoğunluklarının fraksiyonu daha sonra iki tedavi arasında ortalama olarak ifade edildi. Hata çubukları bağımsız olarak gelişen hücre kültürlerinden üç hazırlıkları standart sapmasını temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. . Ölçülen kesirleri içinde standart protein belirteçlerinin Bereket Arsalar belli subsellüler bölmelere seçilen protein belirteçleri (- sterol zengin mikro bölgeler, AM - plazma zarı, IM - İç membranlar, SP - çözünür proteinler DRM) normalize protein iyon yoğunluklarının dağılımını temsil eder. (A) remorin sterol zengin zar mikro bölgeleri için bir marker olarak, (B) ABC-tipi taşıyıcı protein ailesinin bir sterol bağımlı olmayan proteinin bir temsilcisi olarak, (C) F0 mitokondriyal kompleks alt-birimi (D) '60S bolluğu kalıpları Tipik bir ko-temizleyici kirletici olarak ribozom alt-birimi. Normalleştirme için, her bir protein için iyon yoğunluğu miktarlar örnek başına toplam iyon yoğunluğunun bir kısım olarak ifade edildi ve daha sonra tekrardan arasında ortalama. Toplam iyon yoğunluklarının fraksiyonu daha sonra iki Akne tedavi edici arasındaki ortalama olarak ifade edildidepartmanlarında. Hata çubukları bağımsız olarak gelişen hücre kültürlerinden üç hazırlıkları standart sapmasını temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,. Net peptit DNNLLGK arasında, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş Arabidopsis hücre. (A) Tüm tarama spektrumu elde edilen protein ekstrelerinin bir 1:1 karışımından bir peptidin beklenen yoğunluk oranı 01:01 iyon arası MSQuant kantitatif protein kütle spektrometrisi. Ekran görüntüsünü beklenen sonuçları ayırma (sağ zirve) etiketli ve m / z ekseni üzerinde peptidlerin etiketlenmemiş (sol tepe noktası) sürümü. Monoizotopik kütle ve ilk izotop mavi işaretleri ile gösterilir. (B) Etiketli (mavi) birnano-HPLC kromatografi sırasında tek bir tepe noktası olarak peptidin ko-elute d etiketlenmemiş (kırmızı) onaylanmıştır. (C), bir farklı olarak düzenlenmiş bir protein için bir aday olarak 01:05 arasında iyon yoğunluğu oranı ile bir peptidin tam tarama spektrumu. (D ) Ayrıca, ters faz kromatografi 1:1 co-Elüe farklı oranlarda proteinler. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Bu çalışmada sunulan protokolün birçok adımları içerir ve hepsi deterjan dayanıklı membranlar ve deterjan çözünebilen fraksiyonlara bitki plazma zarı saf ve temsilci damıtılmalarının elde etmek için çok önemlidir. Bu nedenle, talimat olarak her adımı takip etmek önemlidir.

Iyonik olmayan deterjanın (aşama 3.2) ile birlikte, plazma membran fraksiyonunun tedavisi membran mikro bölge fraksiyonasyon kalitesi üzerinde güçlü bir etkisi vardır. Farklı preparatlar arasında yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için, ve aynı deneyden farklı örnekleri üzerinde karşılaştırma yapabilmek için, tam da plazma membran protein konsantrasyonunu değerlendirmek ve protein içeriği ile ilgili olarak her zaman aynı oranda deterjan uygulamak için çok önemlidir ve her zaman aynı nihai konsantrasyona kadar. Pratik olarak, bazen yüksek protein konsantrasyonuna sahip numuneler seyreltilmesi veya farklı konsantrasyon stokları kullanmak için gerekli olduğu anlamına gelirTriton X-100.

Biyokimyasal çalışmalarda, son zamanlarda membran microdomains ^28-30 izolasyonu için deterjan içermeyen yöntemi kullanmak için araştırmacılar arasında bir eğilim olmuştur. Bu yöntemler, Fransız basınçlı hücre presi benzer şekilde çok küçük bir iğne ile kesilmesi ile, plazma zarının bir mekanik parçalama dayanmaktadır. Bu işlemler başarılı zar mikro bölgeleri açısından zengin memeli hücre kültürlerine uygulandı, ancak organizmalar (maya, bitki hücreleri) ihtiva eden hücre duvarına uygulama bildirilmemiştir. Örneğin, metil-beta-siklodekstrin gibi sterol-bozan maddeler ile birlikte niceliksel proteomik kullanarak, bitki plazma zarından hazırlanan DRM fraksiyonlar zar mikro bölgeleri ¹¹ için belirteçler olan proteinleri içeriyor olduğu gösterilmiştir.

Kitle spektrometrik miktarının nihai sonuçlar ile ilgili olarak, Şekil 6'da gösterilen sonuçlar, tipik ideal bir durumu temsiletiketlenmiş ve etiketlenmemiş peptidlerin çoğunluğu için iyon yoğunluğu aynıdır yakın olan. Bununla birlikte, bazı durumlarda, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücre kültürlerinin setleri arasında biyolojik varyasyon belirli bir ölçüde gözlenebilir. Dolayısı ile de, biyolojik tedavi öncesi etiketli veya etiketsiz hücre kültürü, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş kontrol hücrelerinin bir karışımının analizi gerçekleştirilir ya da, her ikisi de herhangi bir tedavi olmaksızın, tek bir durumlar için ideal bir birinden farklı bir oranlarına sahip peptidlerin tanımlanmasına izin verir. Farklı oranlarda Bu proteinler biyolojik çeşitliliği için göstergeleridir. Biyolojik çeşitliliği ayırt tedavi etkilerinin zorluğun üstesinden gelebilmek için, biz bu nedenle eşleştirilmiş deneylerde ²⁰ karşılıklı etiketleme kullanmayı öneriyoruz. Karşılıklı deney düzeneği, Şekil 1 'de önerildiği gibi deney iki varyantları gerçekleştirilir ve tarif edildiği gibi protokol aşamaları takip edilmektedir. Daha sonra, p iyon yoğunluğu oranını karşılaştırarakiyon yoğunluk oranları arasındaki fark biyolojik varyasyon ya da uygulanan tedavinin bir etkisi olarak bağlı ise karşılıklı deneyler hem roteins, bir ayırt edebilir.

Tedavi etkileri ve biyolojik değişimi arasındaki ayrım sorunu ele için diğer bir yöntem, tüm tedavilerin ³¹ için bir referans olarak etiketlenmiş bir iç standart kullanılmasıdır. Bu yaklaşımda, etiketlenmemiş kontrol ve biyolojik tedavi geçmesi etiketlenmemiş hücreler aynı partiden gelen ağır etiketli kontrol hücrelerinin aynı miktarı ile karıştırılır. Bu, ¹⁴ N-kontrol / ^{15 N-14} kontrol ve N-muamele / ¹⁵ N-kontrol iyon yoğunluğu oranları önemli derecede farklı olduğu takdirde proteinler, önemli olarak kabul edilmektedir, çünkü, peptit oranı biyolojik varyasyonun etkisi ortadan kaldırarak izin verir. Etiketlenmiş standart her durumda aynı olduğu için bu mümkündür.

Dr biriBurada tanımlanan DRM zenginleştirme prosedürün awbacks deterjan dayanıklı zar fraksiyonu içinde tespit edilebilir ko-temizleme proteinlerdir. Düşük yoğunluklu deterjan dayanıklı zar fraksiyondan tanımlanan proteinlerin listesinde, düzenli ribozomal proteinler, çok sayıda gözlemleyebiliriz. Nedeniyle ribozomal proteinlerin nispeten düşük yoğunluğu, bu sakroz gradyanı içinde sterol bağlı zar proteini ile aynı fraksiyonunda yer değiştirmektedir. Bu ribozomal proteinlerin açıkça membran microdomains ¹¹ bileşenleri olmayan herhangi bir şüphe olmadan gösterildi. Bu aslında deterjan dirençli düşük yoğunluklu membran fraksiyonları ile ilişkili olmayan başka bir ko-protein arıtma hariç tutmak için, aynı zamanda, iki-dan daha düşük dekstran fazdan elde edilebilir hücre içi zarlar (IM) proteomik bileşiminin analiz edilmesi için teklif fazlı sistem ve iç membran ve DRM arasında farazi kirleticilerin bolluğu oranlarını karşılaştırmafraksiyon (Şekil 5'de örneklere bakınız). DRM-co-arındırıcı proteinler hem fraksiyonları (IM ve DRM) benzer zengindi olmalıdır.

Hücre ekstreleri ve membran mikro bölgesini Fraksiyonu proteomik analizi ³² için bir örnek olarak karmaşıklığını azaltmak için yaygın bir stratejidir. Bu nedenle, burada tarif edilen protokol, bitki hücrelerinin plazma membranında işlemleri sinyal her çalışmaları için yararlıdır. Biyolojik uygulamaları stres tepkisi hem de plazma membran kompozisyonu ve membran proteinlerinin ^14,15 modifikasyonu değişikliklere neden büyük ölçüde bütün patojen enfeksiyonların eğitim içindedir. Stres yanıtlarını eğitim yanı sıra farklı membran fraksiyonları protein bolluk miktarlandınlması büyük ölçüde henüz bilinmeyen proteinlerin ^{33 34,35} arasında şerhi yardımcı olabilir.

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Yazar, Witold Szymanski, Moleküler Bitki Fizyolojisi Max Planck Enstitüsü'nün bir çalışanıdır. Yazar, Waltraud Schulze Hohenheim Üniversitesi, Almanya'da bir çalışanıdır.