Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Hücreler arası Ca ^{2 +}-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır ^{2 +}-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Hücreler arası iletişim, beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal içeren organlar ve dokular, çeşitli hücreler arasında fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Deneysel ayarlarında, hücreler arası Ca ^{2 +-dalgaları} tek bir hücreye mekanik bir uyaran uygulanarak elde edebilir. Bu hücre içi sinyal IP molekülleri ₃ ve Ca ² serbest bırakılması yol açar ⁺ komşu hücrelere mekanik uyarılmış hücreden ⁺ dalga eş Ca ² yayılma başlatmasını. Arası Ca ^{2 +-dalga} yayılımı kontrol ana moleküler yollar IP ₃ doğrudan transferi yoluyla ve ATP serbest bırakılması ile hemichannels tarafından gap junction kanalları tarafından sağlanmaktadır. Özellikleri ve farklı konneksin ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels olarak pannexin izoformlarının düzenlenmesi belirlenmesi ve karakterizasyonu quantificatio izin verdiğin arası Ca ^{2 +-dalga} siRNA ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels inhibitörlerinin kullanımının yayılması. Burada, bir sonucu olarak hücreler arası ^Ca2 hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyonu ile oluşturulan bir kontrollü ve lokalize mekanik uyarıcıya tepki olarak Fluo4-AM yüklendi primer endotel hücrelerinin mono tabakaları ⁺ dalga ölçmek için bir yöntem tarif az 1 mikron bir ipucu çaplı bir micromanipulator kontrollü cam mikropipet ile hücre zarının dokunmadan. Ayrıca birincil sığır kornea endotel hücreleri ve ⁺ dalgaları ATP serbest bırakılması ile arası Ca ² için tahrik güç olarak Cx43-hemichannel aktivite değerlendirmek için model sistem olarak kullanımı izolasyonu açıklar. Son olarak, kullanımı, avantajları, sınırlamalar ve boşluk kavşak kanal ve hemichannel araştırma bağlamında bu yöntemin alternatifleri tartışmak.

Hücreler arası iletişim ve sinyal doku ve tüm organ düzeyinde ^1,2 de hücre dışı agonistler yanıt olarak fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Hücreler arası iletişimin en doğrudan yolu boşluğu kavşak oluşumu tarafından oluşturulur. Gap junction ^3,4 komşu hücrelerin iki konneksin (Cx) hemichannels (Şekil 1) başkanı kafaya yerleştirme ile oluşan protein kanalları gap junction kanalları plaklar vardır. Ara bağlantılar neden olan ve modüle ^Ca2 komşu hücreler ⁶ (Şekil 2) arasında hücre içi mağazalarından ^+-serbest bırakma., ^{Ca2 +} veya IP ₃ ⁵ de dahil olmak üzere, en az 1.5 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip küçük sinyal moleküllerinin geçişine izin Boşluk birleşme kanalları sıkıca redoks modifikasyon ve benzeri gibi, intra-ve intermoleküler protein etkileşimleri ile ve hücresel sinyal süreçler ile düzenlenirfosforilasyon ^7. Gjs böylece kimyasal ve elektriksel syncytium olarak hareket eden, bağlı hücrelerin koordine cevabı sağlar. Örneğin, atriyal ve ventriküler kalp miyositleri arasında hareket potansiyelinin yayılmasını Cx-tabanlı GJ kanal ⁸⁵ aracılığıyla gerçekleşir. Cxs sadece gap junction kanalları olarak rol değil, aynı zamanda eşleşmemiş hemichannels oluşturmak, böylece düzenli iyon kanalları ^8-10 (Şekil 1) benzer zarlarında kanalları olarak çalışmıyor. Hemichannels hücre içi ve dışı çevre arasındaki iyon ve sinyal molekülleri değişimini kontrol ederek komşu hücreler arasında parakrin sinyal katılmak.

Bir çok hücre tipinde (epitel hücreleri, osteoblastik hücrelerin, astrositlerin, endotelyal hücreler, vb gibi) ve organların (beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal gibi), hücreler arası Ca ^{2 +} dalgalar hücreli yanıtların koordinasyonu için temel olan 11. Belirli bir hücrede hücre içi Ca ^{2 +} düzeylerinde artış bu hücre ile sınırlı, ama böylece bir hücreler arası Ca ^{2 +-dalga 12,13} kurulması, çevredeki komşu hücrelere yaymak değildir. Bu hücreler arası Ca ^{2 +} dalgaları syncytium ve düzensizliği patofizyolojik işlemleri ¹¹ ile ilişkili olduğu gibi hücre katmanları fizyolojik düzenlenmesi için önemlidir. Kornea endotel ve epitel, kendi ^25-33 gibi farklı grupları ^14-24, hücreler arası iletişim mekanizmaları ve rolleri okudu. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, kornea endotel hücreleri gibi, hücreler arası iletişim iki ayrı modu ^28,29, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim ortaya çıkar. Gap kavşak arası iletişim boşluğu kavşak ⁷ ile sinyal molekülleri doğrudan bir değişimi içerir. Gap junctional arası iletişim, doku dengesini korumak hücre çoğalması kontrol ve hücre dışı stres ^10,34,35 bir senkronize cevap kurmak için önemlidir. Patolojiler bir dizi, gap junction bağlantı nedeniyle hatalı CXS düşürüldü, ve burada boşluk kavşak arası iletişim ³⁶ etkiliyor. Bu çok hücreli organizmalarda boşluğu kavşak arası iletişimin önemini ve etkisini vurgular. Bu yayılabilir dışı haberciler (Şekil 2) sürümü içerdiğinden boşluğu kavşak arası iletişim aksine, parakrin hücreler arası iletişim, hücre-hücre apozisyon bağlı değildir. Sinyal moleküllerinin farklı hücre sinyalizasyon hücre dışı boşlukta serbest bırakılır. Molekül daha sonra belirli bir reseptör proteini ile tespit edilir, hedef hücreye taşınır. Daha sonra reseptör sinyal kompleksi olan bir hücresel yanıtı indüklersinyal, ya da etkisiz hale duyarsızlaştırma çıkarılması ile sonlandırılır. Çıkış lipofilik hücre dışı sinyal haberciler membran nüfuz ve hücre içi reseptörleri üzerinde hareket ederler. Buna karşılık, hidrofilik haberciler yanıt hücrenin plazma zarı çapraz değil, ama sonra hücre içi çevreye sinyal röle yüzey ifade reseptör proteinler, bağlanan bir ligand olarak hareket ederler. Iyon-kanalı-bağlantılı, enzim-bağlı ve G-protein-bağlantılı: hücre yüzeyi reseptör proteinlerinin üç önemli aile bu süreçte yer alırlar. Serbest haberci molekül yakın (parakrin) hedef hücreleri üzerinde, aynı hücre (otokrin) reseptörleri üzerinde hareket edebilir, ya da dolaşım sistemi (endokrin) gerektiren uzak hedef hücreler üzerinde.

Kornea endotel ^28,29 dahil olmak üzere birçok hücre tipi içinde, hücre içi ATP Ca ^{2 +} dalgalar ^37-40 yayılma sürücü büyük hidrofilik, parakrin faktörlerden biridir. DurÇeşitli maddeler olarak kaldırılması ile mekanik deformasyon, hipoksi, inflamasyon veya stimülasyon, ATP kayma gerilmesi, çekme ya da ozmotik ^44,45 şişme tepki olarak ^41-44 sağlıklı hücrelerden serbest bırakılabilir. Farklı ATP-serbest bırakma mekanizmaları veziküler ekzositozu ⁴⁴ ve bu, ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcılar, plasmalemmal voltaj bağımlı anyon kanalları ^46, P2X7 reseptör kanalı ^47,48 yanı sıra, ayrıca nakil mekanizması, bir bolluk da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür konneksin hemichannels ^49-52 ve pannexin hemichannels ^43,49,53. Hücre dışı ATP ADP, AMP hızla hidrolize olması ve hücre dışı ortamda mevcut ectonucleotidases ile ^54,55 adenozin olabilir. Ekstraselüler serbest ATP ve metaboliti ADP ⁵⁶ difüzyon yoluyla yayılacak. Komşu hücrelerde purinerjik reseptörleri ile bu nükleotidlerin işlemler daha sonra p rolü de ortaya konmuşturarası Ca ^{2 +-dalgaları 28,37,51} bir ropagation. Purinerjik reseptörlerinin iki farklı sınıflar mevcut: Her iki pürin (ATP, ADP) ve pirimidin (UTP, UDP) nükleotidler en P2-purinoceptors ⁵⁷ hareket ise adenozin, P1-purinoceptors için başlıca doğal ligand olduğunu.

Hücreler arası iletişim gibi kazıma yükleme, boya transferi, IP ₃ ve Ca ^{2 +,} mekanik uyaran, vb gibi agonistlerin yerel uncaging gibi farklı yöntemlerle incelenebilir. Burada ⁺ dalga yayılımı, tek bir hücrenin mekanik uyarılar ile ortaya çıkarılan Ca ² çalışma açıklar. Mekanik olarak uyarılmasıyla, Ca ^{2 +-dalga} yayılımı eğitim avantajı ⁺ dalga zamanla Ca ² yayılmasını ölçmek için kolay bir araç sağlar ve kantitatif olarak farklı hücre ön işlemleri karşılaştırarak izin vermektedir. Kornea endotel, bu hücreler arası Ca ^{2 +-dalgaları} eş izintek tabaka gelen koordine yanıt, burada göz içi ameliyat sırasında hücre dışı zorlamalara dayanıklı endotel yardımcı olmayan rejeneratif kornea endotel olası bir savunma mekanizması olarak hareket, ya da bağışıklık ret veya üveit ^58,59 sırasında inflamatuvar mediatörlerin maruz üzerine.

1. Kornea Endotel Hücre İzolasyonu

Başlamadan önce: göz enucleating sonra yerel bir mezbaha, en kısa zamanda elde edilen taze gözlerle, gelen hücreleri izole edin. Göz maksimum 18 aylık, beş dakika ölüm sonrası ve Earle Dengeli Tuz Çözüm korunmuş bir inek olarak çıkarıldı emin olun - 4% 1 iyot çözeltisi laboratuvara taşınması için ° C.

1. Earle Dengeli Tuz Çözeltisi dışında göz atın - 1% iyot çözeltisi ve bir Petri kabı (100 x 20 mm) yerleştirin.
2. % 70 etanol ihtiva eden bir çözelti ile göz sterilize ve% 1 iyot içeren Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile durulayın.
3. Bu adım, steril bir kaput çalışır. Dikkatlice gözden kornea incelemek ve yukarı gelecek şekilde epitel hücre tabakası ile Earle Dengeli Tuz Çözeltisi içeren bir Petri kabı (35 x 10 mm), yerleştirin. Dikkatlice kalan iris dokusu sti kaldırmakGerekirse kornea bağlanmış ll.
4. Yukarı endotel hücre tabakası ile petri içeren başka bir Earle Dengeli Tuz Çözeltisi için kornea aktarın ve Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın.
5. Bir fincan şeklinde yemektir bir kum saati, yukarı bakacak şekilde endotel tabakası ile kornea aktarın ve büyüme ortamı ile örtün. Büyüme ortamı, 25 mM glukoz,% 10 fetal sığır serumu,% 6.6 L-glutamin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve% 1 antibiyotik-antimikotik karışım 10,000 birim ihtiva / ml penisilin, 10,000 ug içeren Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı oluşmaktadır streptomisin / ml ve 25 ug / ml amfoterisin B
6. Bir emme pipet ile ortam çıkarın.
7. Korneanın endotel tabakası (tripsin içeren tüm adımları aynı konsantrasyon ile yapılan) bir tripsin solüsyonu (0.5 g / L) 300 ul uygulayın.
8. Kapalı bir Petri kabındaki kornea içeren kum saati yerleştirin ve inc koydum37, 30 dakika boyunca ubator ° C ve% 5 _CO2.
9. Yavaşça steril bir başlık bir yangın cilalı kanca şeklindeki cam Pasteur pipeti ile kornea uzak endotel hücreleri kazıyın.
10. Endotel hücreleri ihtiva eden çözelti emmek ve kültür ortamı 4 ml'lik kültür şişeleri (25 ^cm2) ekleyin.
11. Kornea büyüme ortamı 300 ul uygulayın ve kazıma tekrar ve kültürü şişesi endotel hücreleri içeren çözeltisi ekleyin.
12. Bir kez daha bu son adım (1.11) tekrarlayın.
13. Kültür yerleştirin 37 inkübatör büyüme ortamı ° C ve% 5 _CO2 'de endotel hücreleri içeren şişeler.
14. İki gün sonra, kültür ortamı içinde 6 ml eklenir.
15. Iki günde bir büyüme ortamı yenileyin.

2. Hücre Kültürü

1. Kültür ortamı çıkarın ve ulaşıldığında konfluent Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (Abou içinde olan hücreler iki kez yıkayınizolasyon sonra t 10 gün).
2. Bunları ayırmak ve inkübatör şişesi yerleştirmek için hücrelere 1.5 ml tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 _CO2) 3-4 dakika karıştırıldı.
3. Büyüme ortamı 12 ml ilave edilir. Hücreleri dağıtmak ve hücreleri saymak için içinde ve dışında orta üç kez pipetle.
4. Hücre yoğunluğu ve inkübatör koyun bağlı olarak değişken bir kısmı ile tohum hücreleri. 165.000 hücre hücre sayısı (cm ² başına hücre yoğunluğu 39.286) ile iki iyi odacıklı slaytlar (4.2 cm ² bir alana sahip) hazırlayın. ^Cm2 başına 6250 bir yoğunlukta yeni bir pasaj boyunca 80 ^cm2 kültürü şişeleri hazırlayın ve 25 ml'lik bir toplam hacme taze kültür ortamı ile toplayın.
5. Her iki günde orta yenileyin.
6. Hücre tabakası birleşene 3-4 gün sonra ulaşılır. Deneyler için hücreler kullanır.
7. Şişeler, hücre tabakasının konfluent ulaşıldığında, 2.6 'dan 2.1 adımları tekrarlayın. 2 pasaj kadar hücre kültürleri kullanılan f edilebilirveya deneyler.

3. Indükleyen Kalsiyum Wave için mekanik Uyarım

1. 10 uM Fluo-4 ile odacıklı slayt hücreleri yük AM 37, 30 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz ° C'de hafifçe çalkalandı.
2. Fluo-4 AM çözeltisi çıkarın, fosfat tamponlu tuz ile hücreler beş defa yıkanır, fosfat tamponlu tuz ile hücre inkübasyon ve ölçümden önce, oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca hücreler bırakın.
3. Argon lazer ve kullanım ışın ayırıcı HFT 488 ile 488 nm de Excite, bir uzun geçiş emisyon filtresi LP 505 ile 530 nm floresan emisyon toplamak en azından iğne deliği ayarlayın. Bir yağ daldırma 40X objektif (Hava, 1.2 NA) kullanın. ARL-67156 ile deneylerde, bir 10X objektif kullanın (Hava, 0.3 NA).
4. Hücreleri konfokal mikroskop birleşik olduğu bir alan arayın.
5. Pozisyon, 45 odacıklı slayta açıdan ° ve-hücre membranı dokunmadan üstünde olacak şekilde pipet.Tek bir hücreye kısa (≈ 1 sn) mekanik stimülasyon kışkırtmak. Mekanik uyarma kısa olan bir amplifikatör aracılığıyla çalıştırılabilir bir piezoelektrik kristal nanopositioner birleştirilmiş bir cam mikropipet (uç çapı <1 mm) ile, hücre zarının% 1'den daha az dokunarak hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyon oluşmaktadır bir mikro-manipülatör monte. Cam mikropipet çekici bir mikroelektrot ile yapılır. Nanopositioner mekanik uyarılması sırasında 0,2 ve 1,5 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun. 1,5 V daha bir gerilim yüksek hücre hasarına neden olabilir. Her hücre tipi ve durumu için, hücre zarar vermeden mekanik uyarılması için en uygun voltaj dikkatli yüksek (1,5 V) gerilimi (0,2 V) düşük başlayarak gerilim bir dizi uygulanarak belirlenmelidir. Bu voltaj, hücre zarı uygulanan mekanik stres ve gerginlik belirlediği için gerilim uyarım kuvveti için bir ölçüdür.Mekanik uyarı kuvveti alanı ile mekanik strese çarpılarak hesaplanabilir. Alanı (<3.14 mikron ²⁾ ve mekanik gerilme hem de çok düşük olduğu için, mekanik uyarma gücü düşüktür. (Bir hücre hasar görmesi durumunda, hücre ve hücre dışına floresan sızıntıları karanlık döner unutmayın.)
6. Mekansal değişiklikleri ölçmek [Ca ^{2 +]} konfokal mikroskop ile mekanik stimülasyon takip _i.
7. Görüntü toplama ve depolama.
8. Konfokal mikroskop yazılımı kullanarak duyarlı hücreleri (aktif alan, AA) toplam yüzey alanı tanımlamak için ilgi bir çokgen bölge çizin.

Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür ve ortaya olan protokol KU Leuven hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır.

Sığır kornea endotel hücreleri (BCEC) olarak, fonksiyonel gap junction ifade ve boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de interaktif bir şekilde hücreler arası iletişim önemli katkı, ancak ana yol aracılık parakrin hücreler arası iletişim yolu olduğu gösterilmiştir vardır Cx43 tabanlı hemichannels ^28,29 ile ATP serbest. ATP ve ADP ectonucleotidase e-NTPD1 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase) tarafından monofosfat (AMP) adenozin hidrolize edilmiş, ve daha sonra 5'-ectonucleotidase CD73 ^28,29 adenozin. ATP ve ADP katkıdaP2Y1 ve P2Y2 reseptörleri ^28,29 bağlanarak Ca ^{2 +-dalga} yayılımı. Reseptörleri Gq ile PLC için çift ve böylece IP uyandırmak hem _3-kaynaklı Ca ^{2 +-serbest} (Şekil 2). BCEC yılında hızlı bir artış purinerjik P2Y reseptörleri sonuçlarının uyarılması [Ca ^{2 +]} [Ca ^{2 +]} _o ⁶⁰ çıkarılması duyarsız _i,. [Ca ^{2 +]} agonist stimülasyon tarafından uyarılmış _i zirveleri istikrarlı, agonist bağımlı yükselmesine yol açabilir [Ca ^{2 +]} _i düşüş tarafından takip edilmektedir, [Ca ^{2 +]} _o bağımlı salınımlı dalgalanmalar veya başlangıca dönüş ^60-62. BCEC olarak, Ca ^{2 +-serbest} PLC ve IP ₃ ²⁹ içeren bir yol ile oluşur kanıt olmuştur. IP _3-duyarlı stoklar boşaltılması bir başlangıç ​​zirve noktası yol açan bir ca ile ^{[Ca2 +]} _i, ardmdanpacitative Ca ^{2 +-akını} plato fazı ⁶³ başlangıcı yol açar.

Mekanik uyarma Ca ² hızlı bir başlangıç ​​yükselmesine neden olur ⁺ stimülasyon noktasından kaynaklanır ve daha sonra mekanik olarak uyarılmış hücre boyunca yayılır. Son olarak, hücre içi Ca ^{2 +-seviyeleri} yavaş yavaş temel seviyesine azaltmak. Hücre sınırları ulaştıktan sonra, bazal seviyesi (Şekil 3) çürükleri bir Ca ^{2 +-geçici} olarak bir dalga gibi bir şekilde çevreleyen komşu hücreleri (NB), için hücreler arası Ca ^{2 +-dalga} yayar. Kontrol koşullarda, ^{Ca2 +-geçici} uzak mekanik olarak uyarılmış hücre (Şekil 3) yaklaşık 4-8 hücre tabakaları kadar gözlenmiştir. Çizgi grafiği (Şekil 3 panellerin sağ tarafında) Ca ² zaman ders gösterir ^+-geçici (normalize floresan (NF) değerleri olarak temsil) olarakmekanik uyarılmış hücre ve komşu hücre katmanları bir ila beş (NB1, NB2, NB3, NB4 ve NB5). Şekil 3, çok açıktır ki normalize floresan azalır, süre başlangıcı için zaman gecikmesini [Ca ^{2 +]} mekanik uyarılmış hücreden artan mesafe ile _i katlı artar. Mekanik uyarılmış hücrede maksimum normalize floresan 0.95 ulaşıldı ± 0.04 sn. Bir maksimum normalize floresan değeri ulaştıktan sonra, normalize floresan bazal değeri 152 dönen ± 6 sn uyaran ²⁵ uygulandıktan sonra, çok kademeli ve yavaş bir düşüş gösterdi.

Eksojen apyrase VI (30 dakika boyunca 5 U ​​/ ml) ve apyrase VII (30 dakika boyunca 5 U ​​/ ml) bir kombinasyonu ile parakrin arası iletişim yolunun inhibe ^Ca2 kapsadığı alan içinde bir 7.5-kat azalmaya neden ^+-dalgası, sözde aktif bir bölge (AA, p <0.001, n = 7N = 35) (Şekil 4A). Apyrase ATP ve ADP hidrolize bilinmektedir. Apyrase VI yüksek ATPaz / ADPase oranı ve apyrase VII tercihen hidroliz ADP ⁵⁶ vardır.

Kornea endotel içinde parakrin hücreler arası iletişim büyük ölçüde ATP sürüm, ^28,29 ile oluşur ve ATP kornea endotel ifade olduğu bilinen ectonucleotidases,, ^29,64,65 ile hücre dışı ortamda hidrolize olduğu için biz koşullarında AA üzerindeki etkisi araştırıldı nerede ATP hidroliz ectonucleotidase inhibitörleri ile inhibe edilir. ARL-67156 (ARL, 30 dakika boyunca 100 uM) ile ectonucleotidases inhibisyonu BCEC ^25,26,28,29, daha önce gösterilmiş olduğu gibi, ⁺ dalga yayılımı ^Ca2 güçlü geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. (Şekil 4B); ARL için BCEC maruz kalma koşulları (N = 12, n = 60 P <0.001) kontrole göre AA bir 3,5 kat artışa neden olmuştur.

ÖncesiLaboratuvarımızda, konneksin mimetik peptidler (Gap26 ve Gap27, Tablo 2) öncekine çalışmaları etkin olmayan bir peptid (mekanik stimülasyonu takiben arası Ca ^{2 +-dalga} yayılımı, için boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim göreceli katkıları ayırt etmek için kullanılmıştır Bir kontrol olarak ^28,29 Tablo 2).

Gap27 ile boşluk kavşak kanal inhibisyonu anlamlı ⁺ dalga BCEC ³⁰ Ca ² yayılma azalmıştır. AA anlamlı Gap27 (30 dakika boyunca 300 uM) ile ön tedavi üzerine azaltılmıştır (p <0.001, n = 8, n = 40), ²⁵ (Tablo 1). Konneksin-mimetik peptid Gap26 ^28,30 ile konneksin hemichannels inhibisyonu önemli ölçüde ⁺ dalga BCEC ²⁸ Ca ² yayılma azalır. AA anlamlı Gap26 (30 dakika boyunca 300 uM) ile ön tedavi üzerine indirilmiştir(P <0.001, n = 8, n = 40), ²⁵ (Tablo 1).

Ayrıca 43-kDa Cx izoformunun arası Ca ^{2 +-dalgaları} kışkırtır hemichannel-aracılı ATP sürümü altında yatan bir ana bileşeni olduğunu gösterdi. Cx43 hedefleyen iki bağımsız tasarlanmış siRNA molekülleri kullanarak, AA 65 yaklaşık% ³³ (Tablo 1) azalmıştır bulundu. Bu da TAT-L2 (100 uM, 30 dk), AA önemli bir azalma (p <0.001 tahrik Cx43 hücre içi döngünün ikinci yarısında (Tablo 2), karşılık gelen bir hücre-geçirgen bir peptid kullanılarak yapılan deneyler ile desteklenmiştir , K = 3, n = 30) (Tablo 1). Önemli olarak, TAT-L2 inkübasyon tarafından AA bu azalma, TAT-L2 seçici Cx43 tabanlı hemichannels ancak boşluk kavşak kanallar ³³ inhibe ettiği kavramını destekleyen, parakrin sinyal yokluğunda gözlenmedi. Ayrıca, aktif olmayan bir TAT-L2 mutantı (TAT-L2 ^H126K/I130N) bir kontrol (Tablo 2) olarak kullanılabilir.

Şekil 1. Şematik: gap junction kanalları ve hemichannels oluşumu. Dört transmembran alan içeren proteinlerdir altı connexins veya pannexins, radyal merkezi bir gözenek etrafında düzenlenmiş zaman A. konneksin veya pannexin hemichannel oluşur. Hemichannels plazma membranında bulunmaktadır. Bunlar aynı proteini alt tip üzerindeki (homomerik hemichannels) oluşabilir ya da iki ya da daha fazla izoformu, aynı hücre (heteromerik hemichannels) olarak ifade edilmiştir farklı bir protein alt, oluşabilir. Bir homotipik gap junction kanal iki özdeş homomerik veya heteromerik hemichannels ve yerleştirme kaynaklanır. D bir heterotipik gap junction kanal sonuçlarıiki farklı homomerik veya heteromerik kanallar ocking. konneksin ve iki komşu hücreler ve hemichannels bağlantı pannexin boşluk kavşak kanal B. şematik yapısı.

(Kısmen ⁶⁶ değiştirilmiş)

Bu rakam aslında BioEssays yayımlandı. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Smedt, Geert Bultynck, ve Bernard Himpens De Humbert. Pannexins, spesifik hücresel fonksiyonları ile konneksin ailenin uzak akrabaları. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, intercellular Ca ^{2 +-dalga} yayılımı boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de içerir. tek bir hücre, ⁺ katlı Ca ² ile mekanik uyarılmış hücre (MS) oluşan bir Ca ² mekanik uyarılması üzerine ^+-akını ve / veya Ca ^{2 +-serbest.} Daha sonra, ikinci Ca ^{2 +} artış husule mekanik bir hücreler arası ^{Ca2 +-dalgası} gibi komşu hücreler (NB) ile uyarılır. Arası yayılma iki mekanizma, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişimi içerir. Boşluk kavşak arası iletişimde, bir arabulucu doğrudan bir değişim (IP ₃ ve / veya Ca ^{2 +)} gap junction (GJS) ile komşu hücrelerin sitoplazmalarında arasında oluşur. Parakrin hücreler arası iletişim, bir haberci (örneğin ATP) böylece inci bulunan reseptörleri hareket, hücre dışı uzaya salınırKomşu hücrelerin E yüzeyi. Hemichannels (HCS) veya diğer mekanizmalar (metin) bu ATP sürüm aracılık. ADP ve AMP Ectonucleotidases hidrolize ATP. ATP ve P2Y ve / veya komşu hücreler üzerinde P2X reseptörleri üzerinde ADP hareket. ⁽⁶⁶ alınmıştır.)

Bu rakam aslında BioEssays yayımlandı. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Smedt, Geert Bultynck, ve Bernard Himpens De Humbert. Spesifik hücresel fonksiyonları ile konneksin ailesinin Pannexins, uzak akrabalar. BioEssays. 2.009. 31 953-974 (2009). BioEssays.

Şekil 3,. BCEC kontrol koşullarda kalsiyum dalga yayılımı. Mekanik stimülasyonu neden kalsiyum geçici temsilcisi sözde renkli floresan görüntüleri BCEC kontrol koşullarda zaman noktalarında farklı gösterilmektedir. FluoreUyarı öncesi scence yoğunlukları ilk görüntü gösterilir. İkinci görüntüde beyaz ok mekanik uyarılmış hücre tanımlar. 62.870 mikron ^2: Kalsiyum dalga dalga (AA aktif alan) ulaştığı hücrelerin toplam alana sahip altı komşu hücre tabakaları için yayar.

Çizgi grafikler ile doğru paneli mekanik uyarılmış hücrede normalize floresan değeri (NF) (MS) ve komşu hücrelerde NF ortalama değeri (NB) katmanları 1 ila 5 (NB1 için NB5) zamanında ders gösterir. (Kısmen ²⁵ değiştirilmiş.)

Bu rakam aslında Soruşturma Göz Hastalıkları ve Görsel Bilim yayınlandı. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, ve Bernard Himpens. Trombin hemichannels ve boşluk kavşak modülasyonu ile kornea endotel hücrelerinde arası kalsiyum dalga yayılımı engeller. Yatırım. Ophthalmol. Vis. Bilim. 2.007. 48 (1), 120-33 (2007). Soruşturma Oftalmoloji ve Görsel Bilim.

Şekil 4. ^+-Dalgaları eksojen nucleotidases (solda) ile tedavi sonrası ve BCEC içinde ectonucleotidase inhibitörleri (sağda) ile hücreler arası Ca ² yayılmasında önemli değişiklikler. ATP ve ADP hidrolize eksojen apyrases (apyrase VI (5 U / ml) ve apyrase VII (5 U / ml), 30 dakika süreyle), burada inhibe parakrin arası iletişim yolu ile (BCEC tedavisi sonrasında AA A. önemli azalma K = 7, n = 35). * P apyrase varlığı vs yokluğunda <0.001 anlamına seçici bir ectonucleotidase inhibitörü ARL-67156 (ARL, 30 dakika için 100 mcM) ile BCEC tedavisi sonrası AA B. belirgin artış., Otlu enhancing parakrin hücreler arası iletişim yolu (N = 12, n = 60). * ARL varlığında genel yokluğunda p <0.001 anlamına gelir.

Tablo 1. (AA) BCEC normalleştirilen aktif alanda Cx43, konneksin mimetik peptidler ve hücre-geçirgen peptid TAT-L2 siRNA hedef moleküllerin etkisi.
Mevcut deneyler gün sayısını temsil eder, n mekanik uyarılarla sayısını temsil eder. * Anlamına P kontrol koşullarına göre <0.001.

Tablo 2'de. Kullanılan peptidlerin amino asit dizileri.

Bu yazıda, bir mikropipet kullanarak lokalize ve kontrollü mekanik stimülasyon sağlayarak birincil sığır kornea endotel hücrelerinin tek katmanlarını içinde hücreler arası Ca ^{2 +-dalga} yayılımı ölçmek için basit bir yöntem tarif. Mekanik olarak uyarılmış hücreleri ^+, her ikisi de arası Ca ^{2 +} dalga yayılımının ^11,67 sürücü gerekli hücre içi sinyal molekülleri, hücre içi IP ₃ ve Ca ² yerel bir artış ile yanıt verir. Ca ^{2 +} hemichannels açılması ve G-proteine ​​bağlı P2 aktivasyonu ile komşu hücrelerde Ca ^{2 +} sinyalleri tetikler ATP ^68,69, serbest bırakılması kışkırtır ise IP ₃ doğrudan, gap junction kanalları ⁵ ile komşu hücrelere aktarılır reseptörleri ^37-40. Boşluk kavşak kanal ve bu süreçte hemichannels nispi katkısının Cx-mimetik kullanılması ile karakterize edilebilirpeptidler, ATP-bozundurucu enzim (ectonucleotidases) ve ectonucleotisdases inhibitörleri. Sığır endotel hücrelerde mekanik stimülasyonu ile oluşturulan hücreler arası Ca ^{2 +} dalga yayılımının özellikleri iyice laboratuarımızda ^25-33 olarak karakterize edilmiştir. Sonuçlarımız arası Ca ^{2 +-dalga} yayılımı esas olarak önemli bir rol oynayan Cx43 ile ATP bir Cx-hemichannel-aracılı serbest, tahrik olduğunu gösterir. Bu nedenle, primer sığır endotel hücrelere uygulanan bu yöntem, doğal hücrelerde endojen düzeyde Cx43 hemichannels düzenlenmesinde tanımlamak veya karakterize etmek için özellikle uygundur. Bu yöntemi kullanarak, Cx43 hemichannels faaliyeti kritik aktomizin endojen bir aşırı fren önleyici olarak hizmet edebilir hücre iskeleti ve bu nedenle, zararlı, Cx43 hemichannel açma ^25,31,32 tarafından kontrol edildiğini bulduk. Biz daha bu yönetmelik altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak ve bulmakCx43 hemichannels ³³ açılması için gerekli olan moleküller arası döngü / kuyruk etkileşim önemli bir rol.

Açıktır ki, bu sistem Cx ve Panx tabanlı bir boşluk kavşak kanalları ve hemichannels fonksiyonu incelemek için çok uygundur ve kesinlikle sığır endotel hücreleri ile sınırlı değildir, fakat hemen hemen herhangi bir hücre tipi hem de daha kompleks dokuların uyarlanabilir olarak gösterilmiştir mekanik stimülasyonu büyük arası Ca ^{2 +-dalgaları} tüm yarımkürede kapsayan ⁷⁰ tetikleyen beyinde. Farklı araçlar CX-mimetik peptidler, ATP-aşağılayıcı enzimler, ectonucleotidases inhibitörleri ve karbenoksolon ve ¹⁰ Panx1 (Tablo 2) ^49,50 gibi farmakolojik bileşikler dahil olmak üzere gap junction kanalları ve hemichannels, katkısını değerlendirmek için mevcuttur. , Bu süreçte belli bir Cx veya Panx izoformunun katkısını belirlemek dikkatle tasarlanmış siRNA probları için tmRNA ve karıştırılmış bir kontrol iki bağımsız argeting bölge kullanılmalıdır. Demonte ölçüde Batı-blot deneyleri ve floresan mikroskopi kullanılarak tek hücre düzeyinde kullanarak total protein düzeyinde belirlenmelidir. Deney hücre mono tabakaları, siRNA probların transfeksiyon etkinliği fluoresan mikroskobu ile değerlendirilmelidir. Bunun için, tek bir floresan etiket sense ipliği 3 'ucunda dahil edildiği bir çift yönlü siRNA gelişebilir. Bu dikkat etmek önemlidir doğru analizi için, ya da Cx Panx izoform (>% 90 azalma) arasında önemli bir azalma, hem de hücre mono tabakasında siRNA dubleks (>% 90 hücre siRNA ile transfekte edilmiş bir homojen transfeksiyon prob) elde edilmelidir. Hedefe doğru tasarlanmış siRNA prob seçicilik ⁷¹ değerlendirilmelidir. Kısacası, bu araçlar, diğer Cx veya Panx izoformlarını veya diğer önemli com ifadesi etkilemez böylece valide edilmelidirarası Ca ² sürüş batıklardan ^{+-dalgaları,} P2X veya P2Y reseptörleri gibi. Cx43 hemichannels katkısını değerlendirmek için, bir seçici, güçlü bir inhibitörü olarak görev Cx43 (TAT-L2) hücre içi döngünün ikinci yarısına karşılık gelen bir hücre geçirgen peptid gelişmekte olan Dr Leybaert en laboratuvar ile işbirliği var Cx43 hemichannels Cx43-gap junction kanal aktivitesini ³³ korurken. Bizim çalışmalarda, biz Cx43 hemichannels bir tam inhibisyon elde etmek için 100 uM TAT-L2 kullanılır, ancak daha düşük konsantrasyonlarda ⁷² yeterli olabilir. TAT-L2H126K/I130N bir negatif kontrol ⁷³ olarak tavsiye edilir. Panx1 kanalların katkısının değerlendirmek için, 10Panx1 peptid uygulanabilir. Bu araçlar (m gibi plazma zarı bozulması (aşağıya bakınız) hariç için değil, aynı zamanda hemichannels tarafından değil, diğer mekanizmalarla bu parakrin ATP sinyal aracılık arası Ca ^{2 +-dalga} yayılımının mekanizmaları göstermek için sadece önemli olanaks-anyon kanal ya da ATP içeren veziküller bırakılması). Sonuç olarak, birincil hücreler kullanan tüm çalışmalarda olduğu gibi, hücre kültürü koşulları ve geçişlerinin sayısının hücrelerinin biyolojik özellikleri gibi, standart olmalı ve bu nedenle, farklı Cx ve Panx izoformlarının ifade profili süre ²⁶ içinde değişebilir.

Bununla birlikte, bu yöntem için bir takım mahsurları vardır. Yönteme büyük bir dezavantajı mekanik stimülasyon ekstraselüler Ca ² girişi artar, plazma zarı bozulma tetikleyebilir ⁺ ve iyi niyetli arası Ca ^{2 +-dalga} yayılımı ¹¹ altında yatan her ikisi de ATP gibi sinyal molekülleri serbest bırakılması. Bu kesinlikle arası Ca ^{2 +-dalga} (kantitatif) analizi zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, son derece bir) uygun kontrolleri, Cx veya Panx izoformlarının ifade eksikliği yani hücre hatları ve araçları ben kullanması gerektiğini tavsiye edilir entegregap junction kanalları ve / veya hemichannels ve ii olarak Cx ve Panx fonksiyonu ile rfere) (mekanik uyaran sırasında nanopositioner 0,5 ve 2 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun) mekanik stimülasyon prosedürü standart.

Ayrıca, bu yöntem tek başına durmazsa dikkat etmek önemlidir, ama Cx ve Panx kanalları incelemek için ek deneysel yaklaşımlarla desteklenmelidir. Bu hücre içi IP ₃ ya da ^{Ca2 + 11,74} arasında Uncaging gibi, mekanik uyarma-aracılı hücre içi ^{Ca2 +-dalga} yayılımının katılma hücre içi haberci moleküllerinin bir yerel bir artış kullanılarak elde edilebilir. Arası ^Ca2 mekanik uyarı bağımsız ^+-dalgası, bir tampon ^+-dışı yerel bir düşüşe neden olur diazo-2 gibi bu tür rekombinant pro-apoptotik Bax ^11,75 ve foto-etkin hale ^Ca2 gibi mikro-enjeksiyon, kullanabilir başlatmak için ^{[Ca2 +} ] ^76, hemichannel açılması için bilinen bir tetikleyici. Alternatif olarak, bir hücre içi Ca ² tetikleyen hücre geçirmez sinyal molekülleri yerinde elektroporasyon kullanabileceğiniz ^+-yayın ve hücreler arası Ca ² gibi IP ₃ ^67,68 olarak ^+-dalgalar,. Bahsedilen teknik, aynı zamanda, hücre ölümü ^5,77 yayılmasını araştırmak için kullanılır. Bu mekanik olmayan uyaranlara uyaran yoğunluğu-yanıt daha iyi bir değerlendirmesini sağlar. Bu Ca ^{2 +} dalga üretme yöntemleri ek olarak, bu hidrofilik boya alımı belirlenmesi (Lucifer sarının gibi) ⁷⁸ ve ATP serbest değil, sadece dahil olmak üzere diğer yöntemler kullanılarak ya da Cx Panx kanallarının aktivitesini belirlemek için önemlidir aynı zamanda hücre dışı Ca ^{2 +-tamponlar} (EGTA gibi) ve hücre içi Ca ^{2 +-serbest} moleküller (Ca ^{2 +-iyonofor} A23187 gibi) ^11,74 yanıt olarak mekanik uyarılara yanıt. Buna ek olarak, to kanal düzeyinde düzenlenmesi için en iyi kanıtı elektrofizyolojik deneyler, çift voltaj kelepçe sistemleri ya veya ektopik GFP gibi bir işaretleyici ile birlikte Cx izoformlarını ifade Cx veya Panx mRNA veya HeLa hücre enjekte Xenopus oosit tam hücreli yolu kelepçe tarafından sağlanmaktadır ^79-84.

Sonuç olarak, hücreler arası Ca ² uyaran için mekanik stimülasyon kullanımı ^+-dalgaları hücre içi iletişim araştırmak ve Cx ve Panx kanallarının katkı ve özelliklerini incelemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Laboratuvarda yapılan araştırma Araştırma Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir - Flanders (FWO; hibe numaraları G.0545.08 ve G.0298.11), Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı (Belçika Bilim Politikası; hibe sayısı P6/28 ve P7/13) ve FWO destekli araştırma topluluğu yerleştirilmiştir. Flanders (FWO) - CDH Araştırma Vakfı bir doktora sonrası adam olduğunu. Yazarlar çok Moleküler ve Hücresel Sinyal (KU Leuven), Dr SP Srinivas (Optometri Indiana Üniversitesi, ABD), Dr Leybaert en laboratuvar (Ghent Üniversitesi) Laboratuvarı tüm mevcut ve eski üyelerine minnettar ve vardır yararlı tartışmalar sağlanan Dr Vinken (VUB), prosedürler optimize veya konneksin hemichannels çalışma için araçlar geliştirilmesi dahil edildi.