Выделение ретиноидсодержащих клеток легких методом сортировки клеток

Описанный ниже протокол представляет собой простой и эффективный способ выделения ретиноидсодержащих клеток из высокогетерогенных популяций клеток легких с использованием специфической ретиноидной автофлуоресценции и сортировки флуоресцентно-активируемых клеток.

Ретиноиды (витамин А и его метаболиты) являются важным липидным компонентом альвеолярного микроокружения, и специфический для клеточного типа метаболизм ретиноидов необходим для поддержания функционального здоровья развивающихся и взрослых легких. Клетки легких используют специфические пути, что позволяет эффективно поглощать циркулирующие ретиноиды из крови в виде ретинола (ROH) с последующим внутриклеточным ступенчатым превращением ROH в транскрипционно активные виды ретиноидов, полностью транс-ретиноевую кислоту (ATRA). ATRA-опосредованная (или ретиноид-опосредованная) передача сигналов имеет решающее значение для регуляции альвеоляризации легких, продукции сурфактанта, ангиогенеза, проницаемости и иммунитета. Важно отметить, что специфические клетки легких, включая фибробласты, могут накапливать ретиноиды в форме ретиниловых эфиров (РЗ), которые могут храниться или дополнительно мобилизоваться в виде ООЗ для переноса в соседние клетки при необходимости. Клетки, содержащие ретиноиды легких, могут быть выделены и собраны из одноклеточной суспензии переваренных легких с использованием ретиноидной аутофлуоресценции (излучение при длине волны 455 нм при возбуждении при длине волны 350 нм) и с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Дополнительное клеточно-специфическое мечение клеток легких красным флуоресцентным белком in vivo позволяет выделять и собирать специфические популяции клеток легких, содержащие ретиноиды. Собранные клетки могут быть непосредственно проанализированы или культивированы для дальнейшего анализа морфологии клеток, экспрессии генов и реакции на фармакологические манипуляции. Этот метод выделения и применения важен для исследований здоровья легких и повреждения легких на животных моделях, чтобы получить более глубокое представление о клеточных аспектах метаболизма ретиноидов в легких и липид-опосредованных клеточных коммуникациях.

Ретиноиды (витамин А и его метаболиты) являются важным липидным компонентом альвеолярного микроокружения, и специфический для клеточного типа метаболизм ретиноидов и передача сигналов необходимы для поддержания функционального здоровья развивающихся и взрослых легких 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. Клетки легких используют специфические пути, позволяющие эффективно поглощать циркулирующие ретиноиды пищевого происхождения из крови в виде ретинола (ROH)15,16,17,18,19 с последующим внутриклеточным ступенчатым превращением ROH в транскрипционно активные виды ретиноидов, полностью транс-ретиноевую кислоту (ATRA)²⁰. ATRA-опосредованная (или ретиноид-опосредованная) передача сигналов достигается за счет взаимодействия ATRA с тремя различными родственными рецепторами ядерных гормонов, рецепторами ретиноевой кислоты (RARα, RARβ и RARγ^21,22), и имеет решающее значение для регуляции альвеоляризации легких 23,24,25,26,27,28,29, производства сурфактанта^30,31,32,33,34,35, ангиогенез³⁶, проницаемость³⁷ и иммунитет 38,39,40. Важно отметить, что специфические клетки легких, особенно легкие фибробласты, могут накапливать ретиноиды в форме ретиниловых эфиров (РЭ), которые могут сохраняться или далее мобилизоваться в виде ROH для переноса в соседние клетки при необходимости¹.

Сложность метаболизма ретиноидов и передачи сигналов, а также клеточная сложность легких затрудняют исследования, направленные на изучение метаболизма ретиноидов в легких in vivo . Мы описали простой и надежный протокол выделения ретиноидсодержащих клеток (рис. 1) из высокогетерогенных популяций клеток легких с использованием специфической ретиноидной аутофлуоресценции (излучение при длине волны 455 нм при возбуждении при длине волны 350 нм) и с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Протокол не требует дополнительной маркировки клеток, за исключением окрашивания на жизнеспособность, если целью исследования является выделение и характеристика первичных живых клеток легких на основе их способности хранить ретиноиды. Это значительно сокращает время подготовки к сортировке клеток, исключает необходимость в дополнительном окрашивании, позволяет выделять высокие выходы жизнеспособных первичных клеток. Однако, если целью исследования является выделение и характеристика конкретных популяций клеток легких (фибробластов, эндотелиальных, эпителиальных или иммунных клеток), дополнительная сортировка клеток может быть выполнена после мечения отсортированных ретиноидсодержащих клеток клеточно-специфическими антителами.

Ретиноидная аутофлуоресценция использовалась в опубликованных исследованиях для установления идентичности ретиноидсодержащих клеток и/или для количественной оценки численности этих клеток в печени 41,42,43,44, поджелудочной железе ^45,46, почках^41,47 и легких⁴¹. Кроме того, несколько исследовательских групп сообщили об использовании флуоресценции ретиноидов для выделения с помощью FACS и изучения первичных ретиноидсодержащих клеток из живых тканей, включая печень 44,48,49,50,51,52,53 и легкое 1. В текущем протоколе мы показываем, как конкретные клеточные популяции могут быть помечены in vivo перед выделением клеток, содержащих ретиноиды, с помощью tdTomato (красный флуоресцентный белок). Спектральные характеристики tdTomato's (излучение на длине волны 581 нм при возбуждении на длине волны^{554 нм 54}) и яркость не влияют на автофлуоресценцию ретиноидов и, следовательно, позволяют удобно добиваться специфичности клеток при сортировке. Учитывая критическую роль ненарушенного метаболизма ретиноидов и передачи сигналов в нормальном альвеолярном^{микроокружении1}, описанный метод выделения клеток легких является полезным инструментом в исследованиях здоровья и заболеваний легких на животных моделях для получения более глубокого понимания клеточных аспектов метаболизма ретиноидов в легких и липид-опосредованных клеточных коммуникаций in vivo.

Все описанные процедуры и эксперименты с участием мышей были проведены с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Рутгерса (IACUC ID: PROTO202200111) в соответствии с критериями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленном Национальной академией наук⁵⁵.

1. Соображения и подготовка к эксперименту

1. Животноводство и манипуляции
   ПРИМЕЧАНИЕ: В исследованиях могут использоваться трехмесячные (10-12 недель) самцы и самки мышей. В описанных экспериментах использовали мышей с дефицитом лецитина-ацилтрансферазы (Lrat-дефицитные, Lrat^-/- мыши⁵⁶) на генетическом фоне C57BL/6J и однопометников соответствующего возраста (дикий тип, мыши Lrat^+/+). Мышей, экспрессирующих ген tdTomato в фибробластах (мышей F-tdT), получали путем скрещивания мышей, у которых была репортерная кассета tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, штамм Jackson Lab #007914) с мышами Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, штамм Jackson Lab #029567).
   1. Используйте мышиную модель с экспрессией Cre, один из многих доступных вариантов для мечения популяции клеток-мишеней in vivo.
      Примечание: В зависимости от выбора клетки-мишени, экспрессии Cre, эффективности Cre-опосредованной рекомбинации и специфичности клеток, исследователи могут использовать любую надежную мышиную модель Cre-экспрессии.
   2. Используйте экспрессию трансгена tdTomato (после лечения тамоксифеном, как описано ниже) для мечения фибробластов Col1a2⁺ с последующим их выделением из суспензий одиночных клеток переваренного легкого, как описано ниже.
2. Кре-опосредованная рекомбинация и активация трансгена in vivo
   1. Индуцирование экспрессии Cre у мышей F-tdT путем внутрибрюшинного (IP) введения 2 мг тамоксифена один раз в 24 ч в течение 5 дней подряд.
   2. Перед инъекцией продезинфицируйте место инъекции 70% этанолом. Используйте мышей для экспериментов через 1 месяц после последней инъекции тамоксифена.
   3. Проверьте эффективность Cre-рекомбинации перед проведением экспериментов по сортировке. Подтвердите эффективную рекомбинацию Cre и экспрессию tdTomato путем выделения популяции клеток-мишеней фибробластов легких от мышей, получавших F-tdT, получавших тамоксифен, с использованием анти-Pdgfrα магнитных шариков и магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS).
3. Приготовление растворов, пластиковой и стеклянной посуды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедур, описанных ниже, следует придерживаться асептических методов. Процедуры, включающие приготовление раствора, переваривание тканей и выделение клеток, должны проводиться под ламинарным колпаком. Растворы должны быть стерилизованы путем фильтрации с помощью фильтра 0,2 мкм; Хирургические инструменты, а также лабораторная посуда должны быть стерилизованы автоклавированием.
   1. Под ламинарным колпаком приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), не содержащий кальция и магния (HBSS без Ca²⁺/Mg²⁺, содержащий 5,3 мМ KCl, 0,4 мМ KH₂PO₄, 4,2 мМ NaHCO₃, 137,9 мМ NaCl, 0,3 мМ Na₂HPO₄, 5,6 мМ D-глюкозу) для перфузии легких (5 мл на мышь). Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и наполните раствором шприц.
   2. Под ламинарным колпаком приготовьте сбалансированный раствор соли Хэнкса с кальцием и магнием (HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺, содержащий 1,3 мМ CaCl₂, 0,5 MgCl_2·6H₂O, 0,4 мМ MgSO_4·7H₂O, 5,3 мМ KCl, 0,4 мМ KH₂PO₄, 4,2 мМ NaHCO₃, 137,9 мМ NaCl, 0,3 мМ Na₂HPO₄, 5,6 мМ D-глюкоза), содержащие 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа и 1 мг/мл диспазы для перфузии легких (10 мл на мышь). Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и наполните раствором шприц.
   3. Под ламинарным колпаком приготовьте HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺, содержащим 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I для переваривания легких (10 мл на мышь). Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и наполните раствором шприц.
   4. Под ламинарным колпаком заполните чашку для клеточных культур (35 мм 10 мм, одна чашка на собранное легкое от одной мыши) 2 мл стерильного HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺. Поставьте тарелку (тарелки), содержащую HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺ , на лед.

2. Перфузия легких, сбраживание и сбор одноклеточной суспензии

1. Обезболите мышь путем введения коктейля для анестезии, содержащего 10 мг/мл кетамина и 2 мг/мл ксилазина в дозе 0,01 мл/г массы тела, путем инъекции IP.
2. Убедитесь, что мышь находится в глубоком бессознательном состоянии, оценив реакцию на щипот пальца ноги. Удалите выпавшие волосы и видимую грязь / мусор с места операции, подстригите и протрите место операции, используя 70% спирт для дезинфекции.
3. С помощью стерильных хирургических инструментов вскрыть брюшную и грудную полости. Разрежьте ребра и диафрагму, чтобы обнажить легкие и сердце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит мгновенную смерть, так как торакотомия приведет к остановке дыхания во время анестезии мыши; При правильном выполнении эта часть процедуры займет до 3 минут от начала процедуры до грудной клетки, за которой последует смерть животного.
4. Разрежьте нижнюю полую вену и приложите абсорбирующую прокладку для впитывания выделившейся крови.
5. Перфузируйте легкие in situ через правый желудочек сердца с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 25 г x 1 дюйм, заполненной 5 мл стерильного HBSS без Ca²⁺/Mg²⁺. Если перфузия прошла успешно, легочная ткань станет белой.
6. Перфузируйте легкие in situ с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 25 г X 1 дюйм, заполненной 10 мл стерильного HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺, содержащего коллагеназу IV типа (0,3 мг/мл) и диспазу (1 мг/мл).
7. Извлеките легкие и перенесите их в чашку для клеточных культур (35 мм X 10 мм) с 2 мл стерильного HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺.
8. Под ламинарным капюшоном промойте легкие и измельчите их на мелкие кусочки с помощью стерильного хирургического лезвия (#20, подходит для ручки #4). Перенесите измельченное легкое в пробирку объемом 15 мл, добавив первые 5 мл HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺ , содержащим 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I, в фарш и перенесите его с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Соберите и перенесите оставшиеся остатки измельченной ткани, промыв чашку для клеточной культуры оставшимися 5 мл HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺ , содержащими 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I.
9. Инкубируйте измельченную легочную ткань в HBSS с Ca²⁺/Mg²⁺ , содержащим 0,3 мг/мл коллагеназы IV типа, 1 мг/мл диспазы и 5 мг/мл ДНКазы I, на вращающемся шейкере, поддерживаемом при температуре 37 °C в течение 45 минут. С каждым из трех 15-минутных интервалов под ламинарным капюшоном пропустите измельченную ткань 10 раз через серологическую пипетку объемом 10 мл для лучшей диссоциации клеток.
10. Полученную клеточную суспензию пропустите через ситечко 100 мкм, чтобы собрать отдельные клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток (физиологический раствор, содержащий 20 мМ HEPES, pH 7,4), содержащего менее 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Соберите клетки центрифугированием при 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
11. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера для лизирования эритроцитов и оставьте пробирку на 5 минут при комнатной температуре (ОТ) для элиминации эритроцитов. Добавьте 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Соберите клетки центрифугированием при 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
12. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Полученную клеточную суспензию пропустите через ситечко 40 мкм, чтобы собрать отдельные клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Соберите клетки центрифугированием при 500 г в течение 10 мин при 4 °C.
13. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл холодного раствора для визуализации живых клеток, содержащего менее 5% FBS. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до ~5-10 x 10⁶ клеток/мл.

3. Выделение ретиноидсодержащих клеток легких с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS)

1. Возьмите аликвоту клеточной суспензии и отложите ее в сторону, чтобы использовать ее в качестве неокрашенного средства для контроля стробирования. Добавьте к оставшейся клеточной суспензии краситель для жизнеспособности SYTOX Green (разведение 1:1000, конечная концентрация 30 нМ).
2. Пропустите клеточные суспензии через фильтр, прикрепленный к сборной трубке из полистирола объемом 5 мл (12 х 75 мм).
3. Продолжайте выделение клеток FACS путем сортировки живых отдельных ретиноидсодержащих клеток на основе их излучения с длиной волны 455 нм. Выполните последовательную дискриминацию синглетов с помощью графика прямого рассеяния (высота прямого рассеяния/FSC-H в сравнении с прямой областью рассеяния/FSC-A). Исключение мертвых клеток по характеристикам разброса (боковой разброс) и окрашиванию с помощью SYTOX Green.
4. Забирайте, сортируйте и собирайте одиночные, живые, содержащие ретиноиды клетки, используя излучение с длиной волны 455 нм при возбуждении на длине волны 350 нм.
   Примечание: Используя описанную процедуру, из одного легкого мыши можно собрать около 5,10⁵ ретиноидсодержащих клеток легких.
5. Выполняйте анализ данных FACS с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии.

Выделение ретиноидсодержащих клеток легких
Легкие мышей (от мышей Lrat^+/+ и Lrat^-/-) ферментативно расщепляли, а суспензии одиночных клеток готовили и подвергали FACS в соответствии с описанной выше процедурой. Сортировка клеток и сбор данных выполнялись на сортировочной системе Cytek Aurora™ Cell Sorter System под управлением программного обеспечения SpectroFlo CS версии 1.3.0 с использованием сопла 100 мкм и давления 15 фунтов на квадратный дюйм. Сначала были применены графики для прямого рассеяния (высота прямого рассеяния/FSC-H в сравнении с областью прямого рассеяния/FSC-A) для выбора и гейтинга одиночных клеток (синглетов), после чего была проведена дискриминация мертвых клеток с помощью бокового рассеивания и окрашивания SYTOX Green (рис. 2). Наконец, для сортировки целевой популяции ретиноидсодержащих клеток была выбрана отдельная популяция живых одиночных клеток с высокой автофлуоресценцией при λ = 455 нм (рис. 2A). Для подтверждения специфичности применяемой походки и общего подхода в качестве отрицательного контроля для корректировки гейтинга ретиноидной автофлуоресценции использовали суспензию клеток легких от мышей Lrat^-/-. Мыши Lrat^-/- не способны синтезировать РЭ и не могут накапливать ретиноиды в легких¹. Примечательно, что при использовании идентичной стратегии гейтирования FACS в суспензии одиночных клеток из легких Lrat^-/- не может быть обнаружена отдельная клеточная популяция с высокой аутофлуоресценцией при λ = 455 нм (рис. 2B).

После сбора первичные ретиноидные клетки легких могут быть непосредственно проанализированы или культивированы для дальнейшего анализа концентраций ретиноидов, морфологии клеток, экспрессии генов и реакции на фармакологические манипуляции (рис. 1).

Используя эту процедуру, мы смогли ранее показать, что среди ретиноидсодержащих клеток легких присутствуют различные клеточные популяции¹. В частности, проведя секвенирование РНК одиночных клеток ретиноидсодержащих клеток, собранных методом FACS, мы показали, что среди этих клеток наиболее распространена группа стромальных клеток (83% от общего числа собранных клеток), за ней следуют эндотелиальные (7% от общего числа собранных клеток), эпителиальные (5% от общего числа собранных клеток) и миелоидные клетки (около 5% от общего числа собранных клеток)¹. Данные о гетерогенности выделенных ретиноидсодержащих клеток легких не снижают специфичности описываемой процедуры; Скорее, эти данные подчеркивают ранее неизвестную сложность метаболизма ретиноидов в легких взрослого человека, который включает в себя фенотипически разнообразные клетки и обширную ретиноидно-опосредованную клеточную коммуникацию.

Выделение ретиноидсодержащих клеток легкого Col1a2⁺
Учитывая наличие гетерогенных клеточных популяций среди изолированных клеток, содержащих ретиноиды, исследователи, возможно, захотят сосредоточиться на изучении конкретного типа клеток легких, участвующих в метаболизме ретиноидов. С этой целью может быть выполнена дополнительная in vivo клеточно-специфическая маркировка популяции клеток-мишеней.

Среди высокогетерогенных популяций клеток легких субпопуляция мезенхимальных стромальных клеток легких с фибробластическими характеристиками, называемая легочными липидными интерстициальными клетками или липофибробластами легких, является преобладающим типом клеток, способных накапливать ретиноиды ^1,57,58. Чтобы пометить субпопуляцию легочных фибробластов in vivo, мышей, экспрессирующих ген tdTomato в фибробластах (мыши F-tdT), получали путем скрещивания мышей, у которых была репортерная кассета tdTomato, с мышами Col1a2-CreER. Экспрессия Cre у мышей F-tdT индуцировалась путем ip-инъекции 2 мг тамоксифена один раз в 24 ч в общей сложности 5 дней подряд; Через месяц после последней инъекции тамоксифена мышей использовали для экспериментов. Такой подход позволил мечать фибробласты Col1a2⁺ белком tdTomato и выделять их из суспензий одиночных клеток переваренного легкого с помощью описанной выше процедуры. Подход позволяет захватывать живые (SYTOX Green negative), одиночные клетки tdTomato⁺ (рис. 3). Затем субпопуляция клеток, содержащих ретиноиды, может быть отделена от всех захваченных клеток tdTomato⁺ с использованием стратегии гейтирования, основанной на автофлуоресценции ретиноидов (рис. 3), как описано выше. Кроме того, эта процедура позволяет проводить последующую сортировку и раздельный сбор различных популяций клеток tdTomato⁺ на основе интенсивности сигнала флуоресценции ретиноидов на субпопуляции клеток с высоким, промежуточным и низким содержанием ретиноидов.

Эффективная рекомбинация Cre и экспрессия tdTomato были подтверждены путем выделения популяции клеток-мишеней фибробластов легких от мышей, получавших F-tdT, получавших тамоксифен (рис. 4A) с использованием анти-Pdgfrα магнитных шариков и магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS). Кроме того, был проведен анализ ВЭЖХ для подтверждения наличия ретиноидов в отсортированных ретиноидсодержащих клетках (рис. 4В).

После сбора первичные ретиноиды-содержащие фибробласты легких могут быть непосредственно проанализированы или культивированы для дальнейшего анализа концентрации ретиноидов, морфологии клеток, экспрессии генов и реакции на фармакологические манипуляции. Например, одной из характерных особенностей легочных ретиноидсодержащих фибробластов, выделенных от животного дикого типа (Lrat^+/+), является наличие липидных капель, которые можно визуализировать в культивируемых клетках с помощью стандартных иммуноцитохимических методов (рис. 4В).

Рисунок 1: Схематическое изображение описанного экспериментального рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

(Создано с помощью Biorender.com)

Рисунок 2: Выделение с помощью FACS ретиноидсодержащих клеток легких. (A) Стратегия стробирования для сортировки одиночных, живых клеток, содержащих ретиноиды (определяемых замкнутой областью) с использованием излучения при λ = 455 нм при возбуждении при λ = 350 нм из суспензий клеток легких, выделенных от мыши дикого типа C57Bl6/J (Lrat^+/+). (B) Стратегия стробирования для сортировки одиночных, живых, содержащих ретиноиды клеток с использованием излучения при λ = 455 нм при возбуждении при λ = 350 нм, применяемая к суспензиям клеток легких, выделенным от мыши Lrat^-/- ; на закрытой территории не обнаружено ретиноидсодержащих клеток в легких Lrat^-/- ; Цифры указывают на процент закрытых ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Выделение с помощью FACS ретиноидсодержащих ретиноидов легких фибробластов Col1a2⁺ . (A) Стратегия стробирования для сортировки одиночных, живых, содержащих ретиноиды tdTomato⁺ (определяемых замкнутой областью) с использованием излучения при λ = 455 нм при возбуждении при λ = 350 нм из суспензий клеток легких, выделенных от мыши F-TdTom на генетическом фоне дикого типа (C57Bl6/J). Панель (B) Стратегия стробирования для сортировки одиночных, живых клеток, содержащих ретиноиды tdTomato⁺ (определяемых замкнутой областью) с использованием излучения при λ = 455 нм при возбуждении при λ = 350 нм, примененная к суспензиям клеток легких, выделенным из мыши F-TdTom на фоне Lrat^-/- (C57Bl6/J); на закрытой территории не обнаружено ретиноидсодержащих клеток в легких мышей F-TdTom на фоне Lrat^-/- . (C) Стратегия гейтирования для сортировки одиночных, живых tdTomato+ ретиноидсодержащих клеток (определяемых замкнутой областью) с использованием излучения при λ = 455 нм при возбуждении при λ = 350 нм, применяемая к суспензиям клеток легких, выделенным из мыши tdTomato^; на закрытой территории не обнаружено ^tdTomato+; Цифры указывают на процент закрытых ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Ретиноидсодержащие фибробласты Col1a2⁺ / tdTomato⁺. (A) Репрезентативная микрофотография выделенных MACS клеток легких дикого типа (Lrat^+/+) Col1a2⁺ / tdTomato⁺ в культуре; культивируемые клетки с характерной флуоресценцией tdTomato захватывали с помощью фильтра TX Red и 20-кратного увеличения; масштабная линейка составляет 150 мкм. (B) Профиль ВЭЖХ (со вставленным увеличением), показывающий характерные пики и времена удержания ретиноидных соединений (ретинола и ретиниловых эфиров), выделенных из 1,10⁵ отсортированных ретиноидсодержащих клеток. (C) репрезентативная микрофотография выделенных FACS клеток легких дикого типа (Lrat^+/+) Col1a2⁺ / tdTomato⁺ в культуре, окрашенной на жирный белок, ассоциированный с дифференцировкой липидных капель (Adrp/Perilipin 2); окрашенные клетки были захвачены с помощью фильтра GFP и 40-кратного увеличения; масштабная линейка составляет 75 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

О способности обнаруживать витамин А в тканях человека и животных и его гистологической визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии впервые сообщалось еще в 1940-х годах. Феномен ретиноидной аутофлуоресценции был затем успешно применен в исследованиях, направленных на обнаружение высоких концентраций витамина А в тканях in vitro⁶¹ и характеристику морфогенеза эмбриональных тканей животных⁶² с помощью флуоресцентной микроскопии. Позже было замечено и экспериментально подтверждено, что отличительная автофлуоресценция клеточных ретиноидов (возбуждение при λ = 350 нм с характерным сине-зеленым излучением при λ = 455 нм) связана с конкретными типами клеток и, следовательно, может быть применена для выделения и характеристики этих клеток 63,64,65.

Ретиноидная аутофлуоресценция использовалась в опубликованных исследованиях для установления идентичности ретиноидсодержащих клеток и/или для количественной оценки численности этих клеток в печени 41,42,43,44, поджелудочной железе ^45,46, почках^41,47 и легких⁴¹. Кроме того, несколько исследовательских групп сообщили об использовании флуоресценции ретиноидов для выделения с помощью FACS и изучения первичных ретиноидсодержащих клеток из живых тканей, включая печень 44,48,49,50,51,52,53 и легкое 1.

Здесь мы описываем протокол, в котором ретиноидная аутофлуоресценция может быть использована в качестве основного признака для идентификации и сортировки клеток, содержащих ретиноиды легких, с помощью FACS. Обнаруженные флуоресцентные ретиноиды включают только ретинол и ретиниловые эфиры. Таким образом, сортировать можно только клетки, содержащие эти производные витамина А (в первую очередь ретиниловые эфиры). Кроме того, мы обеспечиваем дополнительное усовершенствование протокола, в рамках которого исследователи могут использовать дополнительные клеточно-специфические подходы к мечению для сужения клеточной специфичности. Это может быть достигнуто путем мечения ретиноидсодержащих клеток легких флюорохром-конъюгированными антителами и дополнительной сортировки¹. В качестве альтернативы, дополнительная клеточно-специфическая маркировка клеток легких может быть достигнута in vivo путем экспрессии репортерных флуоресцентных белков с использованием клеточно-специфических Cre-рекомбиназных животных моделей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу, после проверки эффективности экспрессии Cre и клеточной специфичности. Описанный здесь протокол подчеркивает использование экспрессии белка tdTomato в легочных фибробластах с помощью CO1a2 в качестве одного из многих вариантов этого подхода. Тем не менее, этот подход может быть применен к другим типам клеток легких, включая эндотелиальные, эпителиальные и миелоидные клетки, когда используется соответствующая модель экспрессии Cre.

Описанный протокол также может быть применен к выделениям клеток из поврежденных (воспаленных, фиброзных и т.д.) легких; Однако в этом случае следует учитывать несколько ограничений. Повреждения легких связаны с прогрессирующим снижением концентрации ретиноидов¹, что, следовательно, может ограничивать применение данного протокола и снижать выход клеток. С другой стороны, повреждения легких связаны с активацией фибробластов и повышенной экспрессией белков внеклеточного матрикса, включая Col1a2. Учитывая, что экспрессия Cre управляется промотором Col1a2, экспрессия tdTomato может быть усилена, что влияет на количество клеток, экспрессирующих tdTomato, а также на интенсивность сигнала tdTomato в легких мышей F-tdT, которые использовались в нашем исследовании.

В совокупности описанный здесь протокол представляет собой конкретный и мощный инструмент для более глубокого понимания клеточных аспектов метаболизма ретиноидов в легких и липид-опосредованных клеточных коммуникаций in vivo.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была профинансирована грантом Национальных институтов здравоохранения/Национальным институтом сердца, легких и крови (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (для I.S.), премией за развитие карьеры (для I.S.) от Центра Рутгерса по воздействию окружающей среды и болезням, финансируемым Национальными институтами здравоохранения/Национальным институтом наук об окружающей среде (NIH/NIEHS) P30 ES005022, и стартовые фонды от Ратгерса, Государственного университета Нью-Джерси (до I.S.). Авторы выражают признательность сотрудникам Общего ресурса иммунного мониторинга и проточной цитометрии в Институте рака Рутгерса (частично при финансовой поддержке NCI-CCSG P30CA072770-5920) за их вклад в работу, представленную в данной рукописи.