В настоящем протоколе описана процедура создания модели остеосаркопении у крыс с использованием овариэктомии.

Остеосаркопения (ОС), сложное дегенеративное заболевание, характеризуется одновременным снижением массы скелетных мышц и минеральной плотности костей (МПК), что представляет огромную опасность для здоровья пожилых людей. Несмотря на клиническую значимость, патофизиологические механизмы, лежащие в основе ОВ, до конца не изучены, что подчеркивает необходимость более глубокого понимания ее этиологии для содействия эффективным стратегиям лечения. Разработка надежной модели животного является ключевым фактором в этом стремлении. В этом исследовании представлен усовершенствованный протокол индукции постменопаузальной остеосаркопении у крыс с помощью двусторонней овариэктомии, метода, который, как известно, ускоряет начало возрастной потери мышечной и костной массы. В этом исследовании крысы в возрасте 12 недель были стратифицированы по массе тела и случайным образом распределены либо в группу фиктивной операции, либо в группу овариэктомии (OVX). Образцы тканей четырехглавой мышцы и трехглавой мышцы левой задней конечности, а также левой бедренной кости систематически собирали через 4, 8 и 12 недель после операции. Такой методический подход обеспечивает всестороннюю оценку влияния овариэктомии на здоровье мышц и костей. Гистологическую оценку атрофии мышечных волокон и морфологии бедренной кости проводили с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (ПЭ), а минеральную плотность костной ткани количественно определяли с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ДЭРА). Временное прогрессирование ОВ тщательно контролировалось через вышеупомянутые интервалы, что позволило получить представление о динамическом взаимодействии между мышечной и костной дегенерацией. Эта модель не только точно отражает клинические проявления ОВ, но и служит надежной платформой для исследования новых терапевтических подходов и лежащих в их основе механизмов.

Остеосаркопения — это многогранное дегенеративное заболевание, которое включает в себя клинические проявления как остеопороза, так и саркопении 1,2,3,4. Остеопороз, распространенное заболевание скелета, характеризуется уменьшением костной массы, нарушенной микроархитектурой и повышенной восприимчивостью к переломам. Саркопения, часто называемая синдромом атрофии мышц, характеризуется снижением мышечной силы и массы ^5,6. ⁷ результатов исследования Марьям показали, что остеосаркопения увеличивает риск смерти на 30% только при саркопении и на 8% при низкой МПК. Исследования показали, что 16,4% проживающих в сообществе людей в возрасте 60 лет и старше страдают остеосаркопенией⁸. В Южной Корее заболеваемость остеосаркопенией среди пожилых людей в возрасте 60 лет и старше, получивших переломы бедра, составляет 27,2%⁹. Люди с ОВ сталкиваются с более высоким риском падений, переломов, госпитализации и институционализации, что ложится бременем на систему здравоохранения и общество^10,11. Учитывая тяжесть этих последствий, крайне важно разработать и внедрить эффективные меры по профилактике и лечению ОВ. Несмотря на срочность, исследования в этой области остаются в зачаточном состоянии, и продолжаются дебаты вокруг диагностических критериев и эффективности различных методов лечения. Таким образом, разработка надежных моделей на животных имеет важное значение для анализа патогенеза ОВ и раскрытия молекулярных основ, которые могли бы помочь в разработке более эффективных подходов к лечению.

В настоящее время обычно используемые модели для доклинических исследований остеосаркопении включают модель старения, которая имитирует процесс старения человека без лекарственного вмешательства. Такой подход ближе к естественному процессу и является экономически выгодным; Тем не менее, это требует значительных затрат времени на созревание¹². Метод инъекции химических препаратов имеет определенные преимущества, такие как короткий цикл моделирования, стабильные результаты и низкая стоимость. Тем не менее, это также создает проблемы, включая точное определение дозировки гормонов, технические навыки, необходимые для инъекций, и переменные эффекты гормональных вмешательств^13,14. Модели генной инженерии могут включать в себя генетически модифицированные организмы, которые могут быть как генетически дефектными, так и дорогостоящими. Хотя эти модели очень специфичны, они заметно сложнее и дороже в производстве¹⁵. Модели неиспользования моделируют влияние длительного постельного режима на клинических пациентов¹⁶. Модели неиспользования эффективны и экономичны для решения проблемы потери мышечной массы, но связаны с осложнениями, такими как образование тромбов и пролежни. Эти модели регулярно контролируются для предотвращения некроза конечностей^17,18 и моделей с дефицитом гормонов; В научном сообществе существует преобладающее мнение о том, что двусторонняя овариэктомия служит эффективным методом для создания животной модели остеопороза^19,20.

Исследования показывают, что костные и мышечные ткани также могут взаимодействовать друг с другом через аутокринные, эндокринные и паракринные механизмы^. Накопление жировой ткани в мышцах и костном мозге служит показателем снижения костной и мышечной массы на фоне остеосаркопении². Саркопения у пожилых людей напрямую связана со снижением плотности костной ткани и ухудшением микроархитектуры костей. Кроме того, уменьшенная мышечная масса служит независимым фактором риска деградации микроструктуры кости²². Эта методология была признана жизнеспособной стратегией для моделирования саркопении^23,24, которая потенциально может служить комбинированной моделью для обоих состояний²⁵. Несмотря на ограниченный объем исследований, касающихся применения овариэктомии в качестве средства индуцирования остеосаркопении, этот подход демонстрирует потенциальную эффективность. Преимущества использования овариэктомии в доклинических исследованиях включают в себя быстрый процесс моделирования, исключение фармакологических вмешательств, создание стабильной экспериментальной модели, простое внедрение и экономическую эффективность.

Целью настоящего исследования является описание процедуры создания доклинической модели у самок крыс путем удаления сегмента как фаллопиевых труб, так и яичников у небеременных особей. Этот подход служит ценным инструментом для исследования молекулярных основ ОВ и для оценки терапевтических преимуществ вмешательств в контролируемых экспериментальных условиях.

Самки крыс Sprague Dawley (n = 36) в возрасте 12 недель и массой около 200-240 г содержались индивидуально в вентилируемых клетках в помещении для животных, свободных от специфических патогенов (SPF) с 12-часовым циклом свет/темнота. Они имели свободный доступ к кормам с SPF и стерильной воде. Крысам дали акклиматизироваться к окружающей среде за неделю до экспериментов. Используя случайное распределение, крысы были разделены на овариэктомизированные (OVX) группы (каждая с 6 крысами) и фиктивные группы (каждая с 6 крысами) в течение 4, 8 и 12 недель после операции. Все процедуры на животных проводились в соответствии с утвержденными рекомендациями комитета по защите животных Ляонинского университета традиционной китайской медицины (No 21000042021040).

1. Овариоэктомия у крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический аппарат, используемый в этом протоколе, показан на рисунке 1.

1. Содержать крыс в помещении для животных с SPF и соблюдать все необходимые процедуры с использованием стерилизованного оборудования в стерильных условиях.
2. Смешайте пентобарбитал натрия, белый порошок, с дистиллированной водой или 0,9% обычным физиологическим раствором для создания обезболивающего раствора. Стандартная доза составляет 30 мг/кг; Наполните шприц соответствующим образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что раствор нестабилен и его следует использовать немедленно. Подготовьте необходимое количество для одного эксперимента за раз.
3. Поднимите брюшную полость крысы над головой, чтобы переместить внутренности к верхней части живота. Используя доминирующую руку, расположите шприц на расстоянии 1-1,5 см от левой (или правой) стороны средней линии живота и введите его под углом 45° в тело крысы. После того, как раствор препарата будет введен, следует повернуть иглу, а затем извлечь.
4. После введения анестезии внимательно следите за дыханием крысы и щипайте ее за пальцы ног, чтобы подтвердить, что она полностью обезболилась.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть какие-либо признаки спазмов или судорог, рекомендуется подождать дольше, прежде чем продолжить.
5. Расположите крысу на операционном столе, закрепите ее конечности и удалите шерсть с обеих сторон спины с помощью триммера (рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если эффект удаления волос не идеален, для удаления волос можно использовать крем для удаления волос.
6. Продезинфицируйте участок, где были удалены волосы, с помощью ватных шариков, смоченных в йоде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс хирургической дезинфекции включает в себя начало от центра и движение наружу по круговой схеме, обычно повторяемой три раза.
7. Сделайте надрез на спине, примерно в 1,0 см от центральной линии. Сделайте разрез близко к месту соединения между изгибом грудной клетки и границей позвоночного столба, немного ниже на 0,5-1 см, отделив кожу, фасцию и мышцу с обеих сторон (рисунок 2Б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для доступа к брюшной полости через более слабый мышечный слой задней брюшной стенки, разрез должен быть сведен к минимуму.
8. Поначалу найти яичник может быть непросто. Начните с определения местоположения яйцевода и проследите его до конечного конца яичника, который заключен в слой рыхлой жировой ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правый яичник расположен со стороны 4-5го поясничного позвонка, на 7-12 мм позади почки и на расстоянии 15 мм от центральной линии. Левый яичник расположен со стороны 5-6-го поясничного позвонков, в 3-5 мм позади почки и в 11 мм от центральной линии.
9. Осторожно поднимите яичник и конец яйцевода из тела (рисунок 2В). Наложите кровоостанавливающие щипцы на наиболее суженный участок между концом матки и яичником. С помощью хирургической нити перевяжите его, а затем полностью иссеките яичник ножницами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно быть осторожным при обращении с яйцеводом и маткой во время процедуры, избегая чрезмерного вытягивания. Лигатура, используемая перед овариэктомией, должна быть надежно закреплена, так как мягкая липидная ткань вокруг яичника может легко привести к ее ослаблению. Эта мера предосторожности необходима для предотвращения послеоперационного кровотечения, которое может привести к смерти крыс. В фиктивной группе жировая ткань равного объема и размера, прилегающая к яичнику, была иссечена с последующим наложением швов на мышцу и кожу.
10. Освободите кровоостанавливающие щипцы и аккуратно верните матку в брюшную полость.
11. Вводите пенициллин в раны брюшной полости, где яичники и фаллопиевы трубы перевязываются, чтобы избежать инфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте пенициллин 80 000 ЕД на крысу один раз в день в течение 3 дней подряд.
12. Индивидуально сшить (размер 3-0) кожу и мышечные слои (рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизацию следует проводить через 24-48 часов после операции с интервалом в 1-2 дня.
13. Поместите крысу обратно в продезинфицированную клетку и наблюдайте за ней до тех пор, пока она полностью не придет в сознание после анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте оказывать тепловую поддержку во время процедуры до тех пор, пока животное полностью не оправится от анестезии.
14. Чтобы избежать раневой инфекции, вводите крысам в каждой группе внутримышечную инъекцию пенициллина натрия 80 000 ЕД/крыса один раз в день в течение 3 дней подряд²⁶.

2. Забор костной ткани и мышечной ткани

Примечание: Крыс усыпляли с передозировкой пентобарбитала натрия (100-200 мг/кг) через 4, 8 и 12 недель после моделирующей операции. Всего было собрано 36 образцов.

1. Обнажите трехглавой мышцы плеча и четырехглавой мышцы левой икры. Тщательно определите и рассеките эти мышцы в точках их происхождения и конечных точек, чтобы сохранить их целостность. После этого запишите и рассчитайте среднее значение влажного веса мышц, чтобы определить коэффициенты влажного веса мышц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Масса тела животного и коэффициент влажного веса скелетных мышц = вес сырого веса мышц крысы/масса тела.
2. Полностью отделите бедренную кость, разрезав суставную капсулу вверх вдоль бедренной кости. Затем устраните близлежащую мышечную и связочную ткань.

3. Патологоанатомическое обследование

1. Погрузите мышечные ткани в сосуд, содержащий 10% нейтральный буферный раствор формалина, на продолжительность 24 ч. После этого тщательно промойте мышечные ткани под проточной водой, чтобы удалить фиксатор.
2. Поместите левую бедренную кость в 4% раствор параформальдегида на 1 неделю, затем замочите ее в достаточном количестве раствора для декальцинации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для удаления отложений кальция, при этом буфер следует менять ежедневно.
3. Измерьте значения минеральной плотности костной ткани с помощью двухэнергетического рентгеновского абсорбциометрического (DXA) костного денситометра. Поместите бедренную кость в двухэнергетическую рентгеновскую проекцию. Установите точность измерения на Тонкая, регулируя режим на Режим для мелких животных, и проанализируйте МПК бедренных костей крыс с помощью прилагаемого программного обеспечения для анализа МПК.
4. Поместите образец в парафин. Срез образцов для рутинного гистологического исследования²⁷.

4. Статистический анализ

1. Представьте непрерывные переменные в виде среднего ±± стандартного отклонения (SD) и сравните две группы с помощью независимой выборки t-критерия. Все статистические анализы проводились на основе двустороннего подхода, при этом статистическая значимость была установлена на уровне P < 0,05. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных для выполнения анализа данных.

Этот протокол содержит подробное описание процедуры двусторонней овариэктомии для установления модели остеосаркопении у крыс. На рисунке 3 показано снижение коэффициента влажной массы четырехглавой мышцы в группе OVX по сравнению с симуляционной группой. Несмотря на то, что не было статистически значимой разницы в МПК между двумя группами через 4 недели после операции, МПК в группе OVX была значительно ниже, чем в группе симуляции операции, через 8 и 12 недель после операции.

На рисунке 4 значительная атрофия трехглавой мышцы плеча наблюдается в группе OVX, с более широким разрывом мышечных волокон по сравнению с фиктивной группой через 12 недель после моделирования. На рисунке 5 показано, что через 4 недели после операции трабекулярная плотность головки бедренной кости как в группе OVX, так и в группе симуляции операции была одинаковой, демонстрируя регулярное и плотное расположение с хорошей связностью. Тем не менее, через 8 недель после операции трабекулы в группе OVX начали уменьшаться в количестве, становясь редко расположенными с увеличенной площадью полости костного мозга. Количество адипоцитов в полости костного мозга было выше, чем в фиктивной группе. На 12-й неделе после операции трабекулы в OVX продемонстрировали заметное уменьшение, демонстрируя неполные взаимосвязи, заметное расширение в области полости костного мозга и значительно повышенное количество адипоцитов по сравнению с фиктивной группой.

Рисунок 1: Хирургические инструменты. (A) Прямой иглодержатель. (Б) Прямые ножницы Майо. (C) Одноразовый лоток для переодевания лекарств. (D) Стерильные ватные шарики (E) Шприцы. (f) Йод. (G) Игла для наложения швов. (H) Линия наложения швов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Создание модели OVX. (А) Эпиляция. (B) Хирургическое отверстие длиной 1 см было сделано от кожи до подкожного слоя. (В) Лигирование с удалением яичников и части фаллопиевых труб. (D) Закрытая рана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Четырехглавая мышца/масса тела и минеральная плотность костей. (А) Коэффициент влажного веса четырехглавых мышц. (B) Минеральная плотность костной ткани (по сравнению с фиктивной группой, * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: HE-окрашивание участков тканей из мышечных волокон икроножной трехглавой мышцы. (А) Морфология мышц через 4 недели после процедуры моделирования в фиктивной группе. (B) Морфология мышц через 8 недель после процедуры моделирования в фиктивной группе. (C) Морфология мышц 12 после процедуры моделирования в фиктивной группе. (D) Морфология мышц через 4 недели после моделирования в группе OVX. (E) Морфология мышц через 8 недель после моделирования в группе OVX. (F) Морфология мышц через 12 недель после моделирования в группе OVX. Масштабные линейки: 1000 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Окрашивание HE срезов тканей головки бедренной кости. (A) Морфология бедренной кости через 4 недели после моделирования в фиктивной группе. (Б) Морфология бедренной кости через 8 недель после моделирования в фиктивной группе. (В) Бедренная кость через 12 недель после моделирования в фиктивной группе. (D) Морфология бедренной кости через 4 недели после моделирования в группе OVX. (E) Морфология бедренной кости через 8 недель после моделирования в группе OVX. (F) Морфология бедренной кости через 12 недель после моделирования в группе OVX. Масштабные линейки: 1000 мкм. (G) Количественная площадь ожирения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Двусторонняя овариэктомическая модель на животных играет важную роль в выяснении механизмов, лежащих в основе остеосаркопении, и оценке потенциальных терапевтических вмешательств. Остеопороз, вызванный овариоэктомией у крыс, который отражает резкое снижение уровня эстрогена, наблюдаемое у женщин в постменопаузе, обычно используется в качестве модели для исследований остеопороза. Кроме того, исследования выявили значительную связь между остеопорозом и саркопенией у пожилых людей, при этом часто наблюдается одновременная потеря мышечной и костной массы. Следовательно, в многочисленных исследованиях использовалась эта модель для изучения саркопении^28,29. В результате, в настоящем исследовании успешно установлена животная модель остеосаркопении.

При создании надежной модели необходимо принять во внимание несколько важных факторов. Подходящая животная модель должна характеризоваться удобством, актуальностью и специфичностью. Крысы SD являются наиболее часто используемыми животными при моделировании остеопороза. После удаления яичников этот механизм трансформации, происходящий в костях крыс, очень напоминает процесс потери костной массы в постменопаузе, наблюдаемый у человека^31,32. Исследования показывают, что крысы в возрасте от 11 до 36 недель являются оптимальными для репликации моделей остеопороза или саркопении 33,34,35,36. С точки зрения пола, распространенность остеосаркопении среди женщин была выше и составила 28%, чем среди мужчин (14%²¹); Поэтому мы отобрали самок крыс. Крысы становятся половозрелыми примерно в возрасте 6 недель в возрасте³⁷ лет, поэтому мы выбрали 12-недельных крыс. Исследование показало, что объемы четырехглавых мышц были значительно уменьшены у пожилых людей по сравнению с молодыми людьми, что позволяет предположить, что старение оказывает более пагубное влияние на^38-й объем четырехглавой мышцы. Остеопороз использует минеральную плотность бедренной кости в качестве золотого стандарта³². Итак, мы выбрали четырехглавую мышцу и бедренную кость.

Последовательность хирургической техники имеет решающее значение, при этом рекомендуется, чтобы один и тот же человек выполнял все процедуры для обеспечения единообразия локализации и размера разреза. Вся процедура состоит из нескольких ответственных этапов. Во-первых, внутрибрюшинное введение анестетика должно избегать прокола внутренних органов. Перед введением препарата важно провести аспирацию, чтобы убедиться, что игла не попала в кровеносный сосуд, точно надавить на поршень шприца, а также сохранить стабильность и скорость на протяжении всего процесса. Во-вторых, быстрая идентификация яичника после разрезания брюшины может быть сложной задачей, требующей всестороннего понимания анатомии крысы оператором. После того, как яичник найден, перевязка и удаление части яйцевода и яичника является жизненно важным шагом для послеоперационного выживания крысы. Из-за мягкой жировой ткани рядом с яичником шов может легко ослабнуть после перевязки, что приведет к кровотечению и, возможно, смерти после операции. Наконец, перед наложением швов рекомендуется нанесение пенициллина на операционное поле с дополнительным внутримышечным введением через 3 дня после операции в качестве профилактической меры против инфекции.

В результате хирургических процедур и введения анестезии крысы могут испытывать сильную боль или даже смерть, что требует их помещения в теплое, гигиеничное и хорошо проветриваемое помещение до тех пор, пока они не придут в сознание. Бдительный мониторинг является обязательным в течение начальной послеоперационной недели, с вниманием к поведенческой активности крыс на протяжении всего исследования.

К преимуществам этой модели относятся ее удобство для пользователя, эффективные возможности моделирования, экономичность и способность имитировать естественное развитие остеопороза и потерю мышечной массы. Тем не менее, существуют определенные ограничения, связанные с этой моделью, такие как быстрое снижение уровня эстрогена после операции по удалению яичников, при этом эстроген не признан прямым фактором саркопении. Настоящий эксперимент проводился на самках крыс и не включал самцов крыс. Несмотря на эти ограничения, модель двусторонней овариэктомии на животных стала ценным ресурсом для изучения ОВ и изучения путей развития заболевания.

Каждый автор заявляет об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Эта работа поддерживается грантами (1) Национального фонда наук о природе (82305275). (2) Программа Фонда естественных наук провинции Ляонин (2022-YGJC-80 и 2022-YGJC-79). (3) Проект по построению ключевых дисциплин китайской медицины высокого уровня Национальной администрации ТКМ (zyyzdxk-2023040).