난소 절제술을 통한 골연감소증에 대한 쥐 모델 생성

이 현재 프로토콜은 난소 절제술을 사용하여 골근감소증의 쥐 모델을 만드는 절차를 간략하게 설명합니다.

복합 퇴행성 질환인 골연화증(OS)은 골격근량과 골밀도(BMD)가 동시에 감소하는 것이 특징이며, 이는 노인 인구에게 엄청난 건강 위험을 초래합니다. 임상적 관련성에도 불구하고 OS의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘은 완전히 이해되지 않았으며, 효과적인 치료 전략을 촉진하기 위해 병인에 대한 더 깊은 이해의 필요성을 강조합니다. 신뢰할 수 있는 동물 모델의 개발은 이러한 노력에서 중추적인 역할을 합니다. 이 연구는 노화와 관련된 근육 및 뼈 손실의 발병을 가속화하는 것으로 알려진 방법인 양측 난소 절제술을 통해 쥐의 폐경 후 골연감소증을 유도하기 위한 정교한 프로토콜을 제시합니다. 이 연구에서 12주 된 쥐는 체중에 따라 계층화되고 가짜 수술 그룹 또는 난소 절제술(OVX) 그룹에 무작위로 할당되었습니다. 왼쪽 뒷다리의 대퇴사두근 및 삼두근과 왼쪽 대퇴골의 조직 샘플을 수술 후 4주, 8주, 12주에 체계적으로 수집했습니다. 이 체계적인 접근 방식은 난소 절제술이 근육과 뼈 건강에 미치는 영향에 대한 포괄적인 평가를 보장합니다. 근육 섬유 위축 및 대퇴 형태에 대한 조직학적 평가는 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 사용하여 수행되었으며, 골 미네랄 밀도는 이중 에너지 X선 흡수 측정법(DXA)을 사용하여 정량화했습니다. OS의 시간적 진행은 앞서 언급한 간격으로 꼼꼼하게 모니터링되어 근육과 뼈 퇴행 사이의 역동적인 상호 작용에 대한 통찰력을 제공했습니다. 이 모델은 OS의 임상적 징후를 정확하게 반영할 뿐만 아니라 새로운 치료 접근법과 그 기본 메커니즘을 조사하기 위한 강력한 플랫폼 역할을 합니다.

골감소증(Osteosarcopenia)은 골다공증과 근감소증의 임상적 증상을 모두 요약하는 다면적인 퇴행성 질환입니다 1,2,3,4. 널리 퍼져 있는 골격계 질환인 골다공증은 뼈 질량이 감소하고, 미세 구조가 손상되며, 골절에 대한 민감성이 높아지는 것이 특징입니다. 종종 근육 소모 증후군(muscle wasting syndrome)이라고 불리는 근감소증(Sarcopenia)은 근력과 질량의 감소로 대표됩니다 ^5,6. Maryam의⁷가지 연구 결과에 따르면 골근감소증은 근감소증만 단독으로 사용했을 때보다 30%, 낮은 골밀도 검사만 했을 때보다 사망 위험을 8% 증가시켰습니다. 연구에 따르면 60세 이상 지역사회 거주자 중 16.4%가 골관절감소증의 영향을 받는다⁸. 한국에서는 고관절 골절을 입은 60세 이상 노인의 골절감소증 발병률이 27.2%로 보고되고 있습니다⁹. OS를 가진 개인은 낙상, 골절, 입원 및 시설화의 위험이 더 높으며, 이는 의료 시스템과 사회에 부담을 줍니다^10,11. 이러한 결과의 심각성을 감안할 때 OS의 예방 및 치료를 위한 효율적인 조치를 개발하고 구현하는 것이 중요합니다. 이러한 긴급성에도 불구하고 이 분야의 연구는 아직 초기 단계에 머물러 있으며, 진단 기준과 다양한 치료 방식의 효능을 둘러싼 논쟁이 계속되고 있습니다. 따라서 신뢰할 수 있는 동물 모델의 개발은 OS의 발병 기전을 해부하고 보다 효과적인 치료 접근 방식을 알려줄 수 있는 분자 토대를 밝히는 데 필수적입니다.

현재 골근감소증에 대한 전임상 연구에 일반적으로 사용되는 모델에는 약물 개입 없이 인간의 노화 과정을 시뮬레이션하는 노화 모델이 포함됩니다. 이 접근 방식은 자연적인 프로세스에 더 가깝고 비용 효율적입니다. 그러나 숙성을 위해 상당한 시간을 투자해야 합니다¹². 화학 약물 주입 방법은 짧은 모델링 주기, 안정적인 결과 및 저렴한 비용과 같은 특정 이점을 제공합니다. 그러나, 그것은 또한 도전을 제시한다, 호르몬 복용량의 정확한 결정, 주사를 위해 요구된 기술, 및 호르몬 중재의 가변적인 효력^13,14. 유전 공학 모델에는 유전적으로 결함이 있고 비용이 많이 들 수 있는 유전자 변형 유기체가 포함될 수 있습니다. 이러한 모델은 매우 구체적이지만 생산하는 데 훨씬 더 복잡하고 비용이 많이 듭니다¹⁵. 불사용 모델은 임상 환자에 대한 장시간의 침상 안정 효과를 시뮬레이션한다¹⁶. Disuse 모델은 근육 손실을 해결하는 데 효과적이고 비용 효율적이지만 혈전 및 욕창과 같은 합병증과 관련이 있습니다. 이러한 모델은 사지 괴사^17,18 및 호르몬 결핍 모델을 예방하기 위해 정기적으로 모니터링됩니다. 과학계에서는 양측 난소 절제술이 골다공증의 동물 모델을 확립하는 효과적인 방법이라는 데 의견이 일치하고 있다^19,20.

연구에 따르면 뼈와 근육 조직은 자가분비, 내분비, 부분비 메커니즘을 통해 서로 상호 작용할 수 있습니다²¹. 근육과 골수에 지방 조직이 축적되는 것은 골연감소증(osteosarcopenia)의 맥락에서 뼈와 근육량이 감소하는 지표 역할을 한다². 노인의 근감소증은 골밀도 감소 및 뼈 미세구조의 악화와 직접적인 관련이 있습니다. 또한, 감소된 근육량은 뼈 미세구조의 저하에 대한 독립적인 위험 요인으로 작용한다²². 이 방법론은 근감소증^23,24의 모델링을 위한 실행 가능한 전략으로 인식되었으며, 이는 잠재적으로 두 조건²⁵에 대한 결합 모델 역할을 할 수 있습니다. 골근감소증을 유발하는 수단으로 난소 절제술을 적용하는 것에 관한 연구는 제한적이지만, 이 접근법은 잠재적인 효능을 입증합니다. 전임상 연구에서 난소 절제술을 활용하면 신속한 모델링 프로세스, 약리학적 중재 제거, 안정적인 실험 모델 생성, 간단한 구현 및 비용 효율성이 포함됩니다.

본 연구는 임신하지 않은 개인의 나팔관과 난소의 일부를 모두 제거하여 암컷 쥐에서 전임상 모델을 만드는 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법은 OS의 분자적 토대를 조사하고 통제된 실험 환경에서 중재의 치료 이점을 평가하는 데 유용한 도구 역할을 합니다.

생후 12주, 체중 약 200-240g인 암컷 Sprague Dawley 쥐(n = 36)를 12시간 라이트/다크 주기의 SPF(Specific-Pathogen-Free) 동물실의 환기가 잘 되는 케이지에 개별적으로 수용했습니다. 그들은 SPF 사료와 멸균수를 무료로 이용할 수 있었습니다. 쥐들은 실험 전 일주일 동안 환경에 적응할 수 있었다. 무작위 할당을 사용하여 쥐를 수술 후 4주, 8주, 12주 동안 난소 절제술(OVX) 그룹(각각 6마리의 쥐)과 가짜 그룹(각각 6마리)으로 나누었습니다. 모든 동물 시술은 랴오닝 중국 전통 의학 대학 동물 복지 위원회(No. 21000042021040)의 승인된 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 쥐의 난소 절제술

참고: 이 프로토콜에 사용된 수술 기구는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 쥐를 SPF 동물실에 보관하고 멸균 환경에서 살균된 장비를 사용하여 필요한 모든 절차를 따르십시오.
2. 백색 분말인 펜토바르비탈 나트륨을 증류수 또는 0.9% 생리식염수와 혼합하여 마취액을 만듭니다. 표준 복용량은 30mg/kg입니다. 그에 따라 주사기를 채웁니다.
   참고: 솔루션이 불안정하므로 즉시 사용해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 한 번에 하나의 실험에 필요한 양을 준비합니다.
3. 쥐의 복부를 머리 위로 들어 올려 내장을 상복부로 이동시킵니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 복부 정중선의 왼쪽(또는 오른쪽)에서 1-1.5cm 떨어진 곳에 주사기를 놓고 쥐의 몸에 45° 각도로 삽입합니다. 약물 용액을 투여한 후 바늘을 회전시킨 다음 빼냅니다.
4. 마취 투여 후 쥐의 호흡을 주의 깊게 모니터링하고 발가락을 꼬집어 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
   참고: 경련이나 경련의 징후가 있는 경우 진행하기 전에 더 오래 기다리는 것이 좋습니다.
5. 쥐를 수술대에 올려놓고 팔다리를 고정한 다음 트리머를 사용하여 등 양쪽의 털을 제거합니다(그림 2A).
   참고: 제모 효과가 이상적이지 않은 경우 제모에 제모 크림을 사용할 수 있습니다.
6. 머리카락이 제거된 부위는 요오드를 적신 면봉을 사용하여 소독합니다.
   참고: 외과적 소독 과정에는 중앙에서 시작하여 일반적으로 세 번 반복되는 원형 패턴으로 바깥쪽으로 이동하는 것이 포함됩니다.
7. 중심선에서 약 1.0cm 떨어진 뒤쪽을 절개합니다. 흉곽 곡률과 척추 경계 사이의 접합부에 가깝게 절개 부위를 0.5-1cm 약간 낮추고 양쪽의 피부, 근막 및 근육을 분리합니다(그림 2B).
   참고: 후복벽의 약한 근육층을 통해 복강에 접근하기 위해 절개 부위는 가능한 한 최소한으로 유지됩니다.
8. 난소를 찾는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다. 먼저 난관을 찾아 느슨한 지방 조직층으로 둘러싸인 난소의 말단 말단을 추적하는 것으로 시작합니다.
   참고: 오른쪽 난소는 4-5번째 요추 측면에 위치하며 신장 뒤쪽 7-12mm, 중심선에서 15mm 떨어져 있습니다. 왼쪽 난소는 5-6번째 요추 쪽, 신장 뒤쪽 3-5mm, 중심선에서 11mm 떨어진 곳에 있습니다.
9. 난소와 난관 끝을 몸에서 조심스럽게 들어 올립니다(그림 2C). 지혈 겸자는 자궁 말단과 난소 사이의 가장 수축된 부위에 바릅니다. 수술용 실을 사용하여 묶은 다음 가위로 난소를 완전히 절제합니다.
   참고: 시술 중 난관과 자궁을 부드럽게 다룰 때 과도하게 당기지 않도록 하는 것이 중요합니다. 난소 절제술 전에 사용하는 결찰은 난소 주변의 부드러운 지질 조직으로 인해 난소가 쉽게 헐거워질 수 있으므로 단단히 고정해야 합니다. 이 예방 조치는 쥐를 죽일 수 있는 수술 후 출혈을 예방하는 데 필요합니다. 가짜 그룹에서는 난소에 인접한 동일한 부피와 크기의 지방 조직을 절제한 다음 근육과 피부를 봉합했습니다.
10. 지혈 겸자를 풀고 자궁을 부드럽게 복강으로 되돌립니다.
11. 감염을 피하기 위해 난소와 나팔관이 결찰되어 있는 복부 상처에 페니실린을 투여합니다.
    참고: 페니실린 80,000 단위/쥐를 하루에 한 번 연속 3일 동안 투여합니다.
12. 피부와 근육층을 개별적으로 봉합합니다(크기 3-0).
    참고: 살균은 수술 후 24-48시간 동안 1-2일 간격으로 수행해야 합니다.
13. 쥐를 소독된 우리에 다시 넣고 마취에서 완전히 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다.
    참고: 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지 절차 중에 열 지원을 계속 제공하십시오.
14. 상처 감염을 피하기 위해, 각 그룹의 쥐에게 페니실린 나트륨 80,000 단위/쥐를 3일 연속으로 하루에 한 번 근육 주사로 투여한다²⁶.

2. 뼈 조직 및 근육 조직의 수집

참고: 쥐는 모델링 수술 후 4주, 8주, 12주에 펜토바르비탈나트륨(100-200mg/kg)을 과다 투여하여 안락사시켰다. 총 36개의 샘플이 수집되었습니다.

1. 왼쪽 종아리의 상완삼두근과 대퇴사두근을 노출시킵니다. 이러한 근육의 원점과 종점 지점을 주의 깊게 식별하고 해부하여 무결성을 보존하십시오. 그런 다음 근육의 젖은 무게의 평균을 기록하고 계산하여 근육의 젖은 무게 계수를 결정합니다.
   참고: 동물의 체중 및 골격근 습윤 체중 계수 = 쥐 근육 습윤 체중/체중.
2. 대퇴골을 따라 관절낭을 위쪽으로 잘라 대퇴골을 완전히 분리합니다. 그런 다음 주변 근육과 인대 조직을 제거합니다.

3. 병리학적 검사

1. 근육 조직을 10% 중성 완충 포르말린 용액이 들어 있는 용기에 24시간 동안 담그십시오. 그런 다음 흐르는 물에 근육 조직을 광범위하게 헹구어 고정액을 제거합니다.
2. 왼쪽 대퇴골을 4% 파라포름알데히드 용액에 1주일 동안 넣은 다음 충분한 양의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 석회질 제거 용액에 담그고 완충액을 매일 교체합니다.
3. 이중 에너지 X선 흡수계(DXA) 골밀도계를 사용하여 골밀도 값을 측정합니다. 대퇴골을 이중 에너지 X-ray에 놓습니다. 측정 정확도를 Fine으로 설정하고 모드를 Small Animal-Specific Mode로 조정한 다음 함께 제공되는 BMD 분석 소프트웨어를 사용하여 쥐 대퇴골의 BMD를 분석합니다.
4. 샘플을 파라핀 왁스에 넣습니다. 정기 조직학적 검사를 위한 표본 섹션²⁷.

4. 통계 분석

1. 계량형 변수를 평균 ±± 표준 편차(SD)로 제시하고 독립 표본 t-검정을 사용하여 두 그룹을 비교합니다. 모든 통계 분석은 양측 접근법을 따랐으며, 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었다. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.

이 프로토콜은 골연감소증의 랫트 모델을 확립하기 위한 양측 난소 절제술 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 그림 3 은 가짜 그룹에 비해 OVX 그룹에서 대퇴사두근의 습윤 중량 계수가 감소한 것을 보여줍니다. 수술 4주 후 두 그룹 간의 골밀도(BMD)에는 통계적으로 유의미한 차이가 없었지만, OVX 그룹의 골밀도(BMD)는 수술 후 8주와 12주에 가짜 수술 그룹보다 유의하게 낮았습니다.

그림 4에서는 OVX 그룹에서 상완삼두근의 현저한 위축이 관찰되었으며, 모델링 후 12주에 가짜 그룹에 비해 근섬유 격차가 더 넓었습니다. 그림 5는 수술 후 4주가 되었을 때 OVX와 가짜 수술 그룹 모두에서 대퇴골두의 섬유주 밀도가 비슷하여 연결성이 양호한 규칙적이고 조밀한 배열을 보여주었음을 보여줍니다. 그러나 수술 후 8주가 지나자 OVX 그룹의 섬유주(trabeculae)의 수가 감소하기 시작했고, 골수강 면적이 증가하면서 드문드문 배열되었습니다. 골수강 내 지방세포의 양은 가짜 그룹보다 많았다. 수술 후 12주에서 OVX의 섬유주(trabeculae)는 불완전한 상호 연결, 골수 영역의 현저한 확장, 가짜 그룹에 비해 현저히 높은 지방 세포 수를 나타내는 현저한 감소를 보였습니다.

그림 1: 수술 기구. (A) 직선 바늘 홀더. (B) 스트레이트 마요네즈 가위. (C) 일회용 약물 교환 트레이. (D) 멸균 면봉 (E) 주사기. (F) 요오드. (G) 봉합 바늘. (H) 봉합 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: OVX 모델 수립. (A) 제모. (B) 피부에서 피하층까지 1cm 길이의 수술 구멍을 만들었습니다. (C) 난소 및 나팔관의 일부를 제거하는 것과 관련된 결찰술. (D) 폐쇄 상처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 대퇴사두근 근육/체중 및 뼈 미네랄 밀도. (A) 대퇴사두근 습윤 중량 계수. (B) 골밀도 (가짜 그룹과 비교, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 종아리 삼두근의 근육 섬유에서 조직 단면의 HE 염색. (A) 가짜 그룹에서 모델링 절차 후 4주 후의 근육 형태. (B) 가짜 그룹의 모델링 절차 후 8주 후의 근육 형태. (C) 가짜 그룹의 모델링 절차에 따른 근육 형태 12. (D) OVX 그룹에서 모델링한 후 4주 후의 근육 형태. (E) OVX 그룹에서 모델링한 후 8주 후의 근육 형태. (F) OVX 그룹에서 모델링한 후 12주 후의 근육 형태. 스케일 바: 1000μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 대퇴골두의 조직 절편에 대한 HE 염색. (A) 가짜 그룹에서 모델링 후 4주 후의 대퇴골 형태. (B) 가짜 그룹에서 모델링한 후 8주 후의 대퇴골 형태. (C) 가짜 그룹에서 모델링한 후 12주 후의 대퇴골. (D) OVX 그룹에서 모델링한 후 4주 후의 대퇴골 형태. (E) OVX 그룹에서 모델링한 후 8주 후의 대퇴골 형태. (F) OVX 그룹에서 모델링한 후 12주 후의 대퇴골 형태. 스케일 바 : 1000 μm. (G) 정량화 된 비만 면적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

양측 난소 절제술 동물 모델은 골연감소증의 기전을 밝히고 잠재적인 치료 개입을 평가하는 데 중요한 역할을 합니다. 폐경 후 여성에서 볼 수 있는 에스트로겐 수치의 급격한 감소를 반영하는 쥐의 난소 절제술에 의한 골다공증은 일반적으로 골다공증 연구의 모델로 사용됩니다. 또한, 연구는 노인의 골다공증과 근감소증 사이에 상당한 연관성이 있음을 강조했으며, 근육과 뼈 손실이 동시에 관찰되는 경우가 많습니다. 결과적으로, 수많은 연구에서 이 모델을 사용하여 근감소증을 조사했습니다^28,29. 그 결과, 본 연구는 골연감소증의 동물모델을 성공적으로 확립하였다.

신뢰할 수 있는 모델을 설정할 때 몇 가지 중요한 요소를 고려해야 합니다. 적합한 동물 모델은 편의성, 관련성 및 특이성을 특징으로 해야 한다³⁰. SD 쥐는 골다공증 모델링에서 가장 일반적으로 사용되는 동물입니다. 난소를 제거한 후 쥐의 뼈에서 발생하는 이러한 변형 메커니즘은 인간에서 관찰된 폐경 후 뼈 손실 과정과 매우 유사합니다^31,32. 연구에 따르면 11주에서 36주 사이의 쥐는 골다공증 또는 근감소증 모델을 복제하는 데 최적입니다 ^33,34,35,36. 성별 측면에서는 여성의 골관절감소증 유병률이 28%로 남성의 14%보다 높았다²¹. 따라서 우리는 암컷 쥐를 선택했습니다. 쥐는³⁷세가 되면 약 6주가 되면 성적으로 성숙해지므로 12주 된 쥐를 선택했습니다. 한 연구에 따르면 대퇴사두근의 부피는 젊은 사람에 비해 노인에서 현저히 감소했으며, 이는 노화가 대퇴사두근^{부피 38}에 더 해로운 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 골다공증은 대퇴골 미네랄 밀도를 황금 표준으로 사용합니다³². 그래서 우리는 대퇴사두근과 대퇴골을 선택했습니다.

수술 기법의 일관성은 매우 중요하며, 절개 부위의 위치 파악 및 크기의 균일성을 보장하기 위해 동일한 개인이 모든 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 전체 절차는 몇 가지 중요한 단계로 구성됩니다. 첫째, 복강내 마취제 주사는 내부 장기에 구멍을 뚫지 않아야 합니다. 약물을 투여하기 전에 바늘이 혈관에 들어가지 않았는지 확인하고, 주사기 플런저를 정확하게 누르고, 프로세스 전반에 걸쳐 안정성과 속도를 유지하기 위해 흡입하는 것이 중요합니다. 둘째, 복막을 절단한 후 난소를 신속하게 식별하는 것은 어려울 수 있으므로 작업자가 쥐의 해부학적 구조에 대한 포괄적인 이해가 필요합니다. 일단 난소를 찾으면 난관과 난소의 일부를 결찰하고 제거하는 것이 쥐의 수술 후 생존을 위한 중요한 단계입니다. 난소 근처의 부드러운 지방 조직으로 인해 봉합사가 묶인 후 쉽게 헐거워져 출혈이 발생하고 수술 후 사망할 수 있습니다. 마지막으로, 봉합 전에 수술 부위에 페니실린을 도포하는 것이 권장되며, 감염 예방 조치로 수술 3일 후 추가 근육 투여가 권장됩니다.

외과적 절차와 마취 투여의 결과로 쥐는 심한 통증이나 죽음을 경험할 수 있으므로 의식을 회복할 때까지 따뜻하고 위생적이며 통풍이 잘 되는 환경에 배치해야 합니다. 수술 후 초기 주간에는 주의 깊은 모니터링이 필수적이며, 연구 전반에 걸쳐 쥐의 행동 활동에 주의를 기울입니다.

이 모델의 이점에는 사용자 친화적인 특성, 효율적인 모델링 기능, 비용 효율성, 골다공증 및 근육 손실의 자연스러운 발달을 모방할 수 있는 능력이 포함됩니다. 그럼에도 불구하고, 이 모델에는 난소 제거 수술 후 에스트로겐 수치의 급격한 감소와 같은 특정 제약 조건이 있으며, 에스트로겐은 근감소증의 직접적인 원인으로 인식되지 않습니다. 본 실험은 암컷 쥐를 대상으로 수행되었으며 수컷 쥐를 포함하지 않았습니다. 이러한 한계에도 불구하고 양측 난소 절제술 동물 모델은 OS를 조사하고 질병 진행을 위한 방법을 모색하는 데 유용한 자원으로 부상했습니다.

각 저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 연구는 (1) National Nature Science Foundation(82305275)의 보조금으로 지원됩니다. (2) 랴오닝성 자연과학재단 프로그램(2022-YGJC-80 및 2022-YGJC-79). (3) 국가한의학관리국 고위급 한의학 핵심규율 구축 사업(zyyzdxk-2023040).