Генерация сосудистых органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

В этом протоколе представлен метод получения сосудистых органоидов с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека.

Сосудистые органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), повторяют разнообразие типов клеток и сложную архитектуру сосудистых сетей человека. Эта трехмерная (3D) модель обладает значительным потенциалом для моделирования сосудистой патологии и скрининга лекарственных препаратов in vitro . Несмотря на последние достижения, ключевой технической проблемой остается воспроизводимое получение органоидов стабильного качества, что имеет решающее значение для последующих анализов и приложений. Здесь представлен модифицированный протокол, который улучшает как однородность, так и воспроизводимость генерации сосудистых органоидов. Модифицированный протокол включает в себя использование микролунок и коктейля CEPT (хроман 1, эмриказан, полиамины и интегрированный ингибитор реакции на стресс, транс-ISRIB) для улучшения формирования эмбриоидных тел и выживаемости клеток. Дифференцированные, зрелые сосудистые органоиды, полученные с использованием этого протокола, характеризуются 3D-иммунофлуоресцентной микроскопией для анализа их морфологии и сложной сосудистой системы. Этот протокол позволяет производить высококачественные сосудистые органоиды масштабируемым образом, потенциально облегчая их использование в моделировании заболеваний и скрининге лекарств.

Микрофизиологические модели in vitro, включая органоидные системы и системы «ткань на чипе», появились за последнее десятилетие ^1,2,3. Эти трехмерные (3D) системы, полученные из человеческих клеток, устраняют ограничения обычных двумерных (2D) клеточных культур и животных моделей, такие как отсутствие многих компонентов в физиологическом микроокружении и генетические различия между видами, соответственно. Они дают больше физиологических знаний и больше подходят для моделирования заболеваний и скрининга лекарств, чем обычные модели. Среди микрофизиологических моделей было доказано, что органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), эффективно повторяют архитектурные особенности нативных тканей человека и были разработаны для имитации различных органов человека, включая мозг ^4,5, почку⁶, печень ^7,8 и сетчатку 9. В этой статье мы уделяем особое внимание получению сосудистых органоидов из ИПСК и описываем оптимизированный протокол, направленный на минимизацию различий между различными образцами органоидов и партиями, тем самым улучшая общую воспроизводимость.

Сосудистая сеть играет решающую роль в поддержании физиологического гомеостаза во всех органах человека. Формирование сосудистой сети включает в себя процессы васкулогенеза и ангиогенеза, которые организуются посредством взаимодействия между эндотелиальными и пристеночными клетками (например, перицитами и гладкомышечными клетками сосудов) и под воздействием различных^{стимулов.} Пеннингер, Виммер и их коллеги разработали первый метод генерации сосудистых органоидов ^11,12, который имитирует эти два процесса. С помощью органоидов, полученных с помощью этого метода, их группа¹² и группа^13,14 продемонстрировали потенциал сосудистых органоидов для моделирования сосудистых нарушений при заболеваниях. Например, в наших последних работах^13,14 наблюдались различные фенотипы, такие как прорастание сосудов и вариации состава клеток стенки, между сосудистыми органоидами, имитирующими болезнь, и их аналогами дикого типа. Эти примеры показывают, что модель сосудистого органоида может служить платформой для скрининга лекарств, имитируя сосудистые сбои, связанные с заболеванием.

На основе первоначальных работ по генерации сосудистых органоидов^11,12 представлен пересмотренный протокол, который включает использование микролунки для облегчения формирования гомогенных эмбриоидных тел (БЭ), что является критическим фактором для минимизации вариаций, часто наблюдаемых в одной и той же партии генерации органоидов. Кроме того, коктейль CEPT, комбинация хромана 1, эмриказана, полиаминов и интегрированного ингибитора реакции на стресс (trans-ISRIB)¹⁵, используется для улучшения жизнеспособности ИПСК и дифференцированных клеток в процессе образования БЭ. Эта модификация в основном предназначена для уменьшения различий между различными образцами органоидов и партиями. Однородные сосудистые органоиды могут быть получены с помощью этого примерно двухнедельного протокола, в котором васкулогенез индуцируется, чтобы помочь эндотелию организоваться в примитивные канальцевые сети в 1-й день, а затем индукция ангиогенеза в 5-й день для развития сложных сосудистых сетей в органоидах. На 12-15-й день сгенерированные органоиды должны показать зрелые сосудистые сети, состоящие как из эндотелия, так и из мочковых клеток.

На рисунке 1 представлен обзор шагов, связанных с этим протоколом. Подробная информация о реагентах и материалах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов. Рекомендуется предварительно нагреть все носители до 37 °C перед использованием, если не указано иное. Все материалы и принадлежности для клеточных культур должны быть либо автоклавными, либо стерильными, а работа с клетками должна производиться в шкафу биобезопасности. Кроме того, значение pH смеси коллагена I должно быть тщательно отрегулировано до pH 7,3, чтобы избежать возможных проблем с затвердеванием.

1. Обслуживание ИПСК человека

1. Разморозьте экстракт матрицы базальной мембраны на льду, осторожно встряхните флакон, чтобы перемешать раствор, и внесите 0,5 мл аликвот в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки P1000 и предварительно охлажденных наконечников. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 1 года.
2. Разморозьте одну аликвоту матричного экстракта (0,5 мл) на льду. Смешайте с 49,5 мл предварительно охлажденной среды DMEM/F12 в пробирке объемом 50 мл. Распределите смесь по каждой лунке (1,5 мл/лунка) в 6-луночных планшетах, а затем осторожно встряхните пластину, чтобы жидкий раствор покрыл всю лунку. Заклейте пластины парафиновой пленкой и храните при температуре 4 °C до 1 недели.
3. Приготовьте расширяющую среду hiPSC, как описано в таблице 1. Изготовьте аликвоты из полной среды (40 мл/тюбик) и храните при -20 °C до 1 года.
4. Поместите предварительно покрытую пластину в инкубатор при температуре 37 °C на 1 час до культивирования гиПСК.
5. Предварительно подогрейте расширяющую среду hiPSC (40 мл) при 37 °C и приготовьте среду для посева hiPSC, как описано в таблице 2.
6. Перенесите пластину с покрытием из инкубатора с температурой 37 °C в шкаф биобезопасности. Замените среду в пластине с покрытием на среду для посева hiPSC (1 мл/лунка).
7. Разморозьте криоконсервированный флакон с ИПСК из криотанки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 минуты.
8. Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл, а затем добавьте 5 мл среды DMEM/F12, после чего центрифугируйте при 100 x g в течение 3 минут при комнатной температуре для сбора клеток.
9. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 1,5 мл посевной среды hiPSC. Аккуратно ресуспендируйте клетки в пробирке объемом 15 мл.
10. Аликвотировать 10 мкл клеточной суспензии и смешать с 10 мкл раствора трипанового синего. Переложите 10 мкл смеси на предметное стекло гемацитометра и накройте его покровным стеклом.
11. Установите предметное стекло на держатель и вставьте его в автоматический счетчик ячеек. Подождите, пока прибор найдет фокус, или вручную отрегулируйте фокус, нажав кнопку фокусировки +/- на экране. После этого используйте настройки по умолчанию и нажмите кнопку «Захват ». Используйте показания плотности живых клеток в качестве концентрации суспензии ИПСК приготовленной на шаге 1.9.
12. Засейте 2 × 10 по⁵ клеток в каждую лунку и следите за тем, чтобы ячейки равномерно распределились в лунке.
13. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2 и замените среду расширяющей средой hiPSC (1,5 мл/лунку) через 24 ч.
14. Меняйте среду ежедневно до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 80%. Регулярно проверяйте морфологию клеток и размер колонии, чтобы убедиться в отсутствии спонтанной дифференцировки. Откажитесь от культуры и возобновите прием новой партии ИПСК при обнаружении обширной (>5%) спонтанной дифференцировки.

2. Формирование EB (день 0)

1. В день 0 приготовьте и подогрейте среду DMEM/F12, среду для посева hiPSC и раствор для отделения клеток при температуре 37 °C в течение 20-30 минут.
2. Снимите питательную среду с 6-луночного планшета и добавьте предварительно подогретый раствор для отслоения клеток (1,5 мл/лунка). Выдержать тарелку при температуре 37 °C в течение 5-7 минут.
3. Перенесите пластину в шкаф биобезопасности, постучите по пластине, чтобы отделить колонии ИПСК и разбить агрегаты.
4. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 4,5 мл среды DMEM/F12. Аккуратно переведите смесь вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл пять раз, чтобы диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию. Избегайте образования пузырей.
5. Центрифугируйте при 100 х г в течение 3 мин при комнатной температуре для сбора клеток.
6. Отсадите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клетки 1 мл затравочной среды hiPSC с помощью пипетки P1000.
7. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл раствора трипанового синего для подсчета клеток. Переложите 10 мкл смеси на предметное стекло гемацитометра и накройте его покровным стеклом. Установите предметное стекло на держатель и вставьте его в автоматический счетчик ячеек. После того, как прибор найдет фокус, нажмите кнопку Capture и используйте показания плотности клеток LIVE для определения концентрации суспензии hiPSC.
8. Засейте клетки в микролуночный планшет с круглым дном со сверхнизким уровнем крепления плотностью 2,7 ×^{10 5} клеток/лунку, чтобы получить 500-1000 клеток на EB.
9. Добавьте 2 мл посевной среды hiPSC в каждую лунку и аккуратно перемешайте раствор для равномерного распределения клеток.
10. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 ч.

3. Сосудистая дифференцировка (день 1 - 5)

1. В день 1 приготовьте среду для индукции мезодермы (MIM), как описано в Таблице 3 и Таблице 4 , и предварительно подогрейте ее при 37 °C в течение 20 минут. Среда MIM должна быть свежей.
2. С помощью пипетки P200 осторожно отсасывайте среду из микролуночного планшета, не повреждая БЭ на дне.
3. Медленно добавляйте 2,5 мл MIM с помощью пипетки P200. Культивируйте EBs в MIM при 37 °C с 5%_CO2 в течение 2 дней.
4. На 3-й день аккуратно замените среду на предварительно подогретые, только что приготовленные 2,5 мл среды для сосудистой дифференцировки 1 (VDM1, таблица 5), не нарушая БЭ на дне микролунки. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2 в течение еще 2 дней.

4. Заделка гидрогеля (день 5)

1. Приготовьте смесь коллагена I, как описано в таблице 6. Поместите пробирку объемом 50 мл на лед и добавьте раствор коллагена I, H₂O, среду 10× DMEM/F12, бикарбонат натрия и HEPES. Тщательно перемешайте, осторожно встряхивая тюбик. Добавьте 1 М раствор NaOH по каплям, встряхивая смешанный раствор, чтобы довести значение pH до 7,3, и проверьте значение pH смеси с помощью pH-метра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием все растворы должны быть предварительно охлаждены на льду. Выполняйте процедуру на льду в шкафу биобезопасности все время. Добавление раствора NaOH имеет решающее значение, а быстрое диспергирование для получения однородного раствора необходимо, чтобы избежать локального отверждения коллагена I. Объем NaOH может варьироваться в зависимости от количества используемой партии раствора коллагена I. Не пипетируйте энергично для смешивания, так как напряжение сдвига может привести к нежелательному предварительному отверждению.
2. Приготовьте смесь матрицы коллагеновой I-базальной мембраны, как описано в таблице 7. Добавьте 1,25 мл матрицы базальной мембраны к смеси коллагена I объемом 5 мл, приготовленной на шаге 4.1. Аккуратно перемешайте раствор, встряхивая тюбик.
3. Поместите 12-луночную тарелку на лед на 2 минуты.
4. Медленно добавьте смесь матрицы коллагеновой I-базальной мембраны в 12-луночный планшет (1,5 мл/лунку) с помощью широкопроходных наконечников. Следите за тем, чтобы смесь распределилась равномерно.
5. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 2 ч для застывания первого слоя гидрогеля.
6. Храните оставшуюся смесь коллагеновых матриц I-базальной мембраны на льду для последующего использования.
7. Перенесите ~60 клеточных агрегатов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и охладите пробирку на льду в течение 5 минут. Осторожно извлеките среду с помощью наконечника для дозатора P200.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начните этот шаг через 1,5 часа после шага 4.5.
8. По каплям добавьте к агрегатам 1,5 мл коллагеновой мембраны I-basement и аккуратно перемешайте их с помощью наконечников для пипеток P200 с широким отверстием.
9. Перенесите тарелку с первым слоем гидрогеля из инкубатора (шаг 4.5) в шкаф биобезопасности.
10. Добавьте 1,5 мл суспензии заполнителя на отвержденный слой. Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить агрегаты. Избегайте образования пузырей.
11. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение еще 2 часов.
12. Готовят среду для сосудистой дифференцировки 2 (VDM2; Таблица 8) и предварительно нагрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 минут перед использованием.
13. Добавьте 2 мл VDM2 в каждую лунку и культивируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2.
14. Меняйте среду каждые 3 дня с предварительно подогретым, свежеприготовленным VDM2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Сосудистые органоиды могут быть высвобождены из гелевой смеси путем удаления геля с помощью иглы шприца. Сосудистые органоиды, извлеченные из геля, можно поддерживать по отдельности в 96-луночном планшете с VDM2 (200 мкл/лунка). Меняйте средство каждые 2-3 дня.

5. 3D Иммунофлуоресцентный анализ

1. Сосудистые органоиды должны стать зрелыми примерно на 13-й день. Для органоидов, встроенных в гидрогель, тщательно отсадите среду и промойте 2 мл PBS три раза (каждый раз по 10 минут). Для органоидов, извлеченных из геля (после шага 4.14), соберите 6-10 органоидов в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, отасуньте среду и промойте 2 мл PBS три раза (по 10 мин каждый).
2. Добавьте в образец 2 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте при 4 °C в течение ночи с герметизацией парафиновой пленки.
3. Удалите раствор PFA и промойте образец 2 мл PBS четыре раза (каждый раз по 15 минут).
4. Добавьте 2 мл блокирующего буфера (Таблица 9) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч.
5. Удалите блокирующий буфер и добавьте 1,5 мл первичных антител (информацию об антителах см. в Таблице материалов ; антитела следует разводить в блокирующем буфере). Инкубируйте образец с первичными антителами при 4 °C в течение 2 дней с легким встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичное антитело (CD31, PDGFRβ и ERG1) рекомендуется разводить в блокирующем буфере в соотношении 1:400 (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации).
6. Удалите первичный раствор антител и промойте 2 мл PBST в течение 1 ч шесть раз.
7. Добавьте в образец 2 мл вторичных антител (информацию об антителах см. в Таблице материалов ; антитела следует разводить в PBST). Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 2 дней, осторожно встряхивая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное антитело рекомендуется разводить в PBST в соотношении 1:1000 (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации). Держите тарелку от света во время инкубации и мойте после этого этапа.
8. Удалите вторичный раствор антитела и смойте 2 мл TBST шесть раз (каждый раз по 1 часу). Добавьте DAPI (1 мкг/мл) в буфер для промывки, используемый для последнего этапа промывки, если необходимо окрашивание ядер.
9. Для этих органоидов, залитых гелем, разрежьте гель на 4 части и осторожно перенесите их в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл с помощью шпателя. Для извлеченных органоидов снимите буфер для промывки.
10. Используйте салфетки, чтобы впитать остатки раствора, не прикасаясь к гелю или органоидам.
11. Добавьте 2 мл водорастворимого реагента для очищения тканей (показатель преломления = 1,49) в каждую пробирку. Инкубируйте образцы с очищающим реагентом при комнатной температуре в темноте до тех пор, пока органоиды не станут прозрачными (обычно на ночь). Не встряхивайте образцы.
12. Осторожно перенесите органоиды с очищающим реагентом в центр посуды со стеклянным дном с помощью шпателя.
13. Накройте органоиды или гелевую часть покровным стеклом диаметром 24 мм × 24 мм.
14. Осторожно надавите на покровную крышку, пока она не ляжет ровно, и прижмите образцы к стеклянному дну.
15. Удалите излишний очищающий реагент из чашки и заклейте покровное стекло лаком для ногтей.
16. Для 3D-визуализации используйте конфокальный микроскоп с объективом 10×. Используйте сканирование листов и сканирование Z-стека для получения изображений органоидов целиком.

На рисунке 1А представлена схема этого протокола, включая ключевые компоненты, используемые на каждом этапе. Дифференцировка началась с формирования БЭ, за которой последовала индукция мезодермы и уточнение сосудистой линии (Рисунок 1B-D). Со временем агрегаты становились больше и менее сферическими. Органоиды начали показывать шероховатости на 5-й день. После встраивания в матричную смесь коллагеновых I-базальных мембран клетки эндотелия сосудов и перициты прорастали и перерастали, образуя сложные сосудистые сети уже на 7-й день (рис. 1E). Поскольку основной целью этого модифицированного метода является минимизация различий между партиями разных поколений, мы измерили размер EB из двух независимых партий, и как измерения размера, так и статистический анализ подтвердили согласованность и однородность с этим методом (рис. 1F).

Для подтверждения сосудистой дифференцировки органоиды собирали на 5-й день перед встраиванием и окрашивали сосудистыми маркерами, включая CD31, ERG1 и PDGFRβ. Органоиды экспрессировали CD31, ERG1 и PDGFRβ (рис. 2), что указывает на присутствие сосудистых эндотелиальных клеток и перицитов.

После очищения тканей сосудистые сетки были проанализированы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии полного монта (рис. 3A). Зрелые органоиды окрашивали CD31, ERG1 и PDGFRβ на 17-й день (рис. 3B, образец в гелевом блоке) и 28-й день (рис. 3C, образец был извлечен из гелевого блока и культуре по отдельности в 96-луночном планшете; обратите внимание, что сосудистая сетка по краям оборачивала сфероиды, а не расширялась радиально после извлечения из гелевого блока).

Рисунок 1: Генерация сосудистых органоидов. (A) Схема этапов и временная шкала генерации сосудистых органоидов. (В-Е) Репрезентативные яркопольные изображения сосудистых органоидов на разных стадиях. Масштабные линейки: 100 мкм. (F) Статистический анализ размера ЭБ из двух различных партий генерации ЭБ с использованием метода микролунок, представленного в данной работе. Для генерации EB использовали 1000 клеток на микролунку, а для партий 1 и 2 n = 42 и n = 40 соответственно. Значимость представлена в виде ns, а не значима. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Иммуноокрашивание сосудистых органоидов перед заделкой геля. Репрезентативные флуоресцентные изображения органоидов, окрашенных эндотелиальными маркерами (A) CD31 (зеленый) и (B) ERG1 (зеленый), а также (C) маркером перицитов, PDGFRβ (зеленый) соответственно. Ядра были компенсированы DAPI (синий). Масштабные линейки: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Иммунофлуоресцентная характеристика сосудистой сети в сосудистых органоидах. (А) Репрезентативное изображение показывает сосудистые органоиды, встроенные в гель, в стеклянной чашке после очищения тканей. Органоиды были прозрачными, но видимыми под ультрафиолетовым светом с длиной волны 385 нм. (B) Репрезентативное 3D-изображение сосудистого органоида на 17-й день. Сосудистый органоид окрашивали DAPI (синий), маркер эндотелиальных клеток сосудов CD31 (зеленый цвет) и маркер перицитов PDGFRβ (пурпурный). (C) Репрезентативная 3D-визуализация полученного сосудистого органоида на 28-й день, окрашенного эндотелиальными маркерами CD31 (красный) и ERG1 (зеленый). Масштабные линейки: 150 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав расширяющей среды hiPSC.

Таблица 2: Состав посевной среды hiPSC.

Таблица 3: Состав среды N2B27.

Таблица 4: Состав мезодермовой индукционной среды (MIM).

Таблица 5: Состав среды для сосудистой дифференцировки 1 (VDM1).

Таблица 6: Состав коллагена I смеси.

Таблица 7: Состав коллагеновой I-базальной мембранной матричной смеси.

Таблица 8: Состав среды для сосудистой дифференцировки 2 (VDM2).

Таблица 9: Состав блокирующего буфера для иммуноокрашивания.

Описанный протокол включает в себя две ключевые модификации для гомогенной и воспроизводимой генерации высококачественных сосудистых органоидов. Первая модификация заключается в использовании микролуночного планшета для лучшего контроля однородности EB. В качестве отправной точки для сосудистой дифференцировки размер БЭ имеет решающее значение, поскольку он регулирует судьбу стволовых клеток и эффективность дифференцировки в отношении различных линий. Вариации в размерах БЭ обычно приводят к образованию гетерогенных органоидов с непоследовательной структурой и организацией^16,17. Традиционный метод генерации БЭ путем поднятия колоний ИПСК^11,12 затрудняет контроль количества клеток для отдельных БЭ и обычно приводит к образованию гетерогенных БЭ. В этом протоколе ИПСК диссоциируют в суспензию одиночных клеток и реагрегируют в микролунках^16,18. Регулируя количество посевных клеток, можно оптимизировать размер БЭ для обеспечения последовательной и эффективной мезодермальной дифференцировки. Для засева микролунок используется 500-1000 ячеек, и это позволяет получить относительно небольшие БЭ (диаметром 100-200 мкм). Этот метод может воспроизводимо генерировать однородные EB с желаемыми размерами от партии к партии (рисунок 1F) и среди различных клеточных линий¹³. Начиная с 0-го дня, морфология БЭ со временем меняется в ходе дифференцировки: форма становится менее сферической, а поверхность – более шероховатой (рис. 1), но объем существенно не увеличивается. Морфология 3D-сосудистой сети зависит от плотности встраивания и размеров встраиваемых органоидов. Слишком крупные (>500 мкм) органоиды обычно приводят к недостаточной дифференцировке сосудистых клеток, в то время как слишком мелкие органоиды, как правило, имеют недоразвитую сосудистую сеть.

Вторая модификация включает в себя коктейль CEPT для повышения жизнеспособности hiPSC во время формирования EB. Жизнеспособность клеток имеет решающее значение в дополнение к качеству колоний hiPSC во время этого процесса. Когда ИПСК диссоциируют в одноклеточную суспензию, обычно добавляют ингибитор ROCK Y27632 для улучшения жизнеспособности клеток. Тем не менее, было показано, что Y27632 неоптимален для ИПСК при низкой плотности и может вызывать нежелательное напряжение мембраны, в то время как коктейль CEPT (состоящий из хромана 1, эмриказана, полиаминов и транс-ISRIB) может значительно снизить клеточный стресс и улучшить жизнеспособность во время этого процесса образования БЭ с ИПСК в более низкой плотности¹⁵.

Перед внедрением органоидов в гель органоиды поддерживаются в микролуночном планшете, и смена среды должна быть осторожной, чтобы избежать возможного разрушения. Для смены среды в течение первых 5 дней лучше использовать пипетку объемом 200 μл. Все среды, используемые для генерации сосудистых органоидов, должны быть предварительно подогреты перед использованием. Особенно после встраивания геля, использование холодных сред может частично разжижать матрицу базальной мембраны и влиять на 3D-гидрогелевую нишу для формирования сосудистой сети. Плотность встраивания и равномерное распределение органоидов также являются критическими факторами для формирования сосудистой сети. Плотное встраивание органоидов потенциально может привести к чрезмерному слиянию сосудистых сетей, в то время как низкая плотность встраивания может привести к недостаточному образованию сети. Посев 60-80 органоидов в лунку и осторожное перемещение пластины вперед и назад сразу после добавления их в первый слой 3D геля может лучше распределить эти органоиды.

Этот протокол может быть дополнительно модифицирован для различных приложений. Например, сигналы гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) могут быть применены для дальнейшего сдерживания эндотелиальных клеток сосудов от образования интерфейса ГЭБ 19,20,21,22,23,24,25. Состав 3D гидрогеля также можно регулировать. Например, фибрин и витронектин обычно используются для формирования сосудистой сети in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. Матрица базальной мембраны без коллагена I может быть использована для встраивания, что может упростить процесс встраивания и обеспечить различные механические стимулы.

Хотя сосудистые органоиды, полученные с помощью этого протокола, потенциально могут быть использованы для моделирования заболеваний или скрининга лекарств, одним из ограничений является то, что эти органоиды в основном повторяют только капиллярную сосудистую сеть с несколькими более крупными сосудами. Для исследований, сосредоточенных на более крупных сосудах, для генерации органоидов могут потребоваться дополнительные механические стимулы 24,31,32,33. Соединение сосудистых органоидов с рециркуляцией, такое как трансплантация животным³⁴ или микро-/макрофлюидные устройства с перфузионными насосами³³, потенциально может решить эту проблему.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Мы хотели бы выразить признательность за техническую поддержку со стороны совместного ресурса по конфокальной и специализированной микроскопии Комплексного онкологического центра Герберта Ирвинга при Колумбийском университете, частично финансируемой за счет гранта Центра NIH (P30CA013696). Эта работа поддержана NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Рисунок 1А был создан с помощью BioRender.