Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Les organoïdes vasculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent la diversité des types cellulaires et l’architecture complexe des réseaux vasculaires humains. Ce modèle tridimensionnel (3D) présente un potentiel substantiel pour la modélisation de pathologies vasculaires et le criblage de médicaments in vitro . Malgré les progrès récents, un défi technique majeur reste à relever pour générer des organoïdes de manière reproductible avec une qualité constante, ce qui est crucial pour les tests et les applications en aval. Ici, un protocole modifié est présenté qui améliore à la fois l’homogénéité et la reproductibilité de la génération d’organoïdes vasculaires. Le protocole modifié intègre l’utilisation de micropuits et du cocktail CEPT (chromane 1, emricasan, polyamines et l’inhibiteur intégré de la réponse au stress, trans-ISRIB) pour améliorer la formation du corps embryoïde et la survie cellulaire. Les organoïdes vasculaires différenciés et matures générés à l’aide de ce protocole sont caractérisés par une microscopie d’immunofluorescence 3D à montage entier pour analyser leur morphologie et leur système vasculaire complexe. Ce protocole permet la production d’organoïdes vasculaires de haute qualité de manière évolutive, ce qui facilite potentiellement leur utilisation dans les applications de modélisation de maladies et de criblage de médicaments.

Des modèles microphysiologiques in vitro, y compris des systèmes d’organoïdes et de tissus sur puce, ont émergé au cours de la dernière décennie ^1,2,3. Ces systèmes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules humaines répondent aux limites de la culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle (2D) et des modèles animaux, telles que l’absence de nombreux composants dans le microenvironnement physiologique et les différences génétiques entre les espèces, respectivement. Ils fournissent plus d’informations physiologiques et sont plus adaptés à la modélisation des maladies et au criblage de médicaments que les modèles conventionnels. Parmi les modèles microphysiologiques, il a été prouvé que les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent efficacement les caractéristiques architecturales des tissus humains natifs et ont été développés pour imiter différents organes humains, notamment le cerveau ^4,5, les reins⁶, le foie ^7,8 et la rétine⁹. Ici, nous nous concentrons particulièrement sur la génération d’organoïdes vasculaires à partir d’hiPSC et décrivons un protocole rationalisé qui vise à minimiser les variations entre différents échantillons et lots d’organoïdes, améliorant ainsi la reproductibilité globale.

La vascularisation joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie physiologique dans tous les organes humains. La formation de la vascularisation implique les processus de vasculogenèse et d’angiogenèse, orchestrés par les interactions entre les cellules endothéliales et murales (par exemple, les péricytes et les cellules musculaires lisses vasculaires) et influencés par divers stimuli¹⁰. Penninger, Wimmer et leurs collègues ont mis au point la première méthode de génération d’organoïdes vasculaires^11,12 qui imite ces deux processus. Avec les organoïdes générés par cette méthode, leur groupe¹² et nous^13,14 avons démontré le potentiel des organoïdes vasculaires pour modéliser les dysfonctionnements vasculaires dans les maladies. Par exemple, dans nos travaux récents ^13,14, des phénotypes distincts ont été observés, tels que la germination des vaisseaux et les variations de la composition cellulaire murale, entre les organoïdes vasculaires imitant la maladie et leurs homologues de type sauvage. Ces exemples mettent en évidence que le modèle d’organoïde vasculaire pourrait servir de plate-forme pour le criblage de médicaments en imitant les dysfonctionnements vasculaires liés à la maladie.

S’appuyant sur les travaux initiaux de génération d’organoïdes vasculaires^11,12, un protocole révisé est présenté qui comprend l’utilisation de micropuits pour faciliter la formation homogène de corps embryoïdes (EB), un facteur critique pour minimiser les variations souvent observées au sein d’un même lot de génération d’organoïdes. De plus, le cocktail CEPT, une combinaison de chromane 1, d’emricasan, de polyamines et de l’inhibiteur intégré de la réponse au stress (trans-ISRIB)¹⁵, est utilisé pour améliorer la viabilité des hiPSC et des cellules différenciées au cours du processus de formation de l’EB. Cette modification vise principalement à réduire les variations entre les différents échantillons et lots d’organoïdes. Des organoïdes vasculaires uniformes peuvent être produits avec ce protocole d’environ deux semaines, où la vasculogenèse est induite pour aider l’endothélium à s’organiser en réseaux tubulaires primitifs le jour 1, suivie de l’induction de l’angiogenèse le jour 5 pour développer des réseaux vasculaires complexes dans les organoïdes. Du 12e au 15e jour, les organoïdes générés devraient montrer des réseaux vasculaires matures composés à la fois de cellules endothéliales et murales.

La figure 1 présente un aperçu des étapes de ce protocole. Des informations détaillées concernant les réactifs et les matériaux utilisés dans ce protocole sont fournies dans la table des matériaux. Il est recommandé de préchauffer tous les fluides à 37 °C avant utilisation, sauf indication contraire. Tout le matériel et les fournitures de culture cellulaire doivent être autoclavés ou stériles, et la manipulation des cellules doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité. De plus, la valeur du pH du mélange de collagène I doit être soigneusement ajustée à pH 7,3 pour éviter d’éventuels problèmes de solidification.

1. Maintenance humaine des iPSC

1. Décongelez l’extrait de matrice de la membrane basale sur de la glace, secouez doucement le flacon pour mélanger la solution et faites des aliquotes de 0,5 mL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts pré-réfrigérés. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 1 an.
2. Décongeler une aliquote d’extrait matriciel (0,5 mL) sur de la glace. Mélanger avec 49,5 ml de milieu DMEM/F12 pré-refroidi dans un tube de 50 ml. Répartissez le mélange dans chaque puits (1,5 ml/puits) dans des plaques à 6 puits, puis secouez doucement la plaque pour vous assurer que la solution liquide recouvre tout le puits. Scellez les plaques avec un film de paraffine et conservez-les à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
3. Préparez le milieu d’expansion hiPSC comme décrit dans le Tableau 1. Faites des aliquotes du milieu complet (40 mL/tube) et conservez-le à -20 °C jusqu’à 1 an.
4. Placez une plaque pré-enduite dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h avant la culture hiPSC.
5. Préchauffer le milieu d’expansion hiPSC (40 mL) à 37 °C et préparer le milieu d’ensemencement hiPSC comme décrit dans le tableau 2.
6. Transférez la plaque revêtue de l’incubateur à 37 °C dans l’enceinte de biosécurité. Remplacer le milieu de la plaque revêtue par un milieu de semis hiPSC (1 mL/puits).
7. Décongeler un flacon cryoconservé de cellules hiPSC du réservoir cryogénique dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 min.
8. Transférez les cellules dans un tube de 15 ml, puis ajoutez 5 ml de milieu DMEM/F12, suivi d’une centrifugation à 100 x g pendant 3 minutes à température ambiante pour recueillir les cellules.
9. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 1,5 mL de milieu d’ensemencement hiPSC. Remettez doucement les cellules en suspension dans le tube de 15 ml.
10. Aliquote 10 μL de la suspension cellulaire et mélanger avec 10 μL de solution de bleu de trypan. Transvasez 10 μL de mélange sur la lame de l’hémacytomètre et couvrez-la d’une lamelle.
11. Montez la glissière sur le support et insérez-la dans le compteur de cellules automatisé. Attendez que l’instrument trouve la mise au point ou ajustez manuellement la mise au point en appuyant sur le bouton de mise au point +/- à l’écran. Ensuite, utilisez le paramètre par défaut et appuyez sur le bouton Capturer . Utilisez la lecture de la densité cellulaire LIVE comme concentration de la suspension hiPSC préparée à partir de l’étape 1.9.
12. Ensemencez 2 × 10⁵ cellules dans chaque puits et assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans le puits.
13. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et remplacez le milieu par un milieu d’expansion hiPSC (1,5 mL/puits) après 24 h.
14. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 80%. Vérifiez régulièrement la morphologie cellulaire et la taille de la colonie pour vous assurer qu’il n’y a pas de différenciation spontanée. Jeter la culture et redémarrer avec un nouveau lot de hiPSC si une différenciation spontanée étendue (>5%) est observée.

2. Formation de l’EB (Jour 0)

1. Le jour 0, préparer et préchauffer le milieu DMEM/F12, le milieu d’ensemencement hiPSC et la solution de détachement cellulaire à 37 °C pendant 20 à 30 min.
2. Retirer le milieu de culture de la plaque à 6 puits et ajouter la solution de détachement cellulaire préchauffée (1,5 ml/puits). Incuber la plaque à 37 °C pendant 5 à 7 min.
3. Transférez la plaque dans l’enceinte de biosécurité, tapotez la plaque pour détacher les colonies de hiPSC et brisez les agrégats.
4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml. Ajouter 4,5 ml de DMEM/F12 de milieu. Pipeter doucement le mélange de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL cinq fois pour dissocier les cellules en une suspension unicellulaire. Évitez de générer des bulles.
5. Centrifuger à 100 x g pendant 3 min à température ambiante pour recueillir les cellules.
6. Aspirer le surnageant et remettre doucement les cellules en suspension avec 1 mL de milieu d’ensemencement hiPSC à l’aide d’une pipette P1000.
7. Mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de solution de bleu de trypan pour le comptage cellulaire. Transférez 10 μL du mélange sur la lame de l’hémacytomètre et couvrez-la d’une lamelle. Montez la glissière sur le support et insérez-la dans le compteur de cellules automatisé. Une fois que l’instrument a trouvé la mise au point, appuyez sur le bouton Capture et utilisez la lecture de la densité cellulaire LIVE pour déterminer la concentration de la suspension hiPSC.
8. Ensemencez les cellules dans la plaque de micropuits à fond rond à très faible fixation d’une densité de 2,7 × 10⁵ cellules/puits pour obtenir un rendement de 500 à 1 000 cellules par EB.
9. Ajouter 2 mL de milieu d’ensemencement hiPSC dans chaque puits et mélanger doucement la solution pour répartir uniformément les cellules.
10. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 24 h.

3. Différenciation vasculaire (jours 1 à 5)

1. Le jour 1, préparer le milieu d’induction du mésoderme (MIM) comme décrit dans le tableau 3 et le tableau 4 et le préchauffer à 37 °C pendant 20 min. Le support MIM doit être fabriqué récemment.
2. À l’aide d’une pipette P200, aspirez soigneusement le fluide de la plaque de micropuits sans perturber les EB au fond.
3. Ajouter lentement 2,5 mL de MIM à l’aide d’une pipette P200. Cultiver les EB dans MIM à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 2 jours.
4. Le jour 3, remplacer délicatement le milieu par 2,5 mL du milieu de différenciation vasculaire 1 (VDM1, tableau 5) préchauffé et fraîchement préparé, sans perturber les EB au fond du micropuits. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant encore 2 jours.

4. Enrobage d’hydrogel (Jour 5)

1. Préparez le mélange de collagène I comme décrit dans le tableau 6. Placez un tube de 50 ml sur de la glace et ajoutez ensuite la solution de collagène I, le H₂O, le milieu 10× DMEM/F12, le bicarbonate de sodium et HEPES. Bien mélanger en secouant doucement le tube. Ajoutez 1 M de solution de NaOH goutte à goutte tout en secouant la solution mélangée pour ajuster la valeur du pH à 7,3 et vérifiez la valeur du pH du mélange avec un pH-mètre.
   REMARQUE : Toutes les solutions doivent être pré-refroidies sur de la glace avant utilisation. Effectuez la procédure sur de la glace dans l’enceinte de biosécurité en tout temps. L’ajout de la solution de NaOH est essentiel, et une dispersion rapide pour obtenir une solution homogène est nécessaire pour éviter le durcissement local du collagène I. Le volume de NaOH peut varier en fonction du numéro de lot de la solution de collagène I utilisée. Ne pipetez pas vigoureusement pour le mélange, car la contrainte de cisaillement pourrait provoquer un pré-durcissement indésirable.
2. Préparez le mélange de matrice de collagène I-membrane basale comme décrit dans le tableau 7. Ajouter 1,25 ml de matrice de membrane basale au mélange de collagène I de 5 ml préparé à partir de l’étape 4.1. Mélangez doucement la solution en secouant le tube.
3. Placer une assiette à 12 puits sur de la glace pendant 2 min.
4. Ajouter lentement le mélange de matrice de collagène I-membrane basale dans la plaque à 12 puits (1,5 ml/puits) à l’aide des pointes à large diamètre. Assurez-vous que le mélange est réparti uniformément.
5. Mettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 2 h pour solidifier la première couche d’hydrogel.
6. Conservez le reste du mélange de matrice de collagène I-membrane basale sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
7. Transférez ~60 agrégats de cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et refroidissez le tube sur de la glace pendant 5 min. Retirez délicatement le fluide à l’aide d’une pointe de pipette P200.
   REMARQUE : Commencez cette étape 1.5h après l’étape 4.5.
8. Dans le sens des gouttes, ajoutez 1,5 ml de mélange de membrane basale de collagène I aux agrégats et mélangez-les doucement à l’aide d’embouts de pipette P200 à large calibre.
9. Transférez la plaque avec la première couche d’hydrogel de l’incubateur (étape 4.5) dans l’enceinte de biosécurité.
10. Ajouter 1,5 mL de la suspension d’agrégats sur la couche durcie. Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les agrégats. Évitez de générer des bulles.
11. Incuber la plaque à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant encore 2 h.
12. Préparer le milieu de différenciation vasculaire 2 (VDM2 ; Tableau 8) et préchauffez le milieu dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 minutes avant de l’utiliser.
13. Ajouter 2 mL de VDM2 dans chaque puits et cultiver les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂.
14. Changez le milieu tous les 3 jours avec du VDM2 préchauffé et fraîchement préparé.
    REMARQUE : (Facultatif) Les organoïdes vasculaires peuvent être libérés du mélange de gel en retirant le gel avec une aiguille de seringue. Les organoïdes vasculaires extraits du gel peuvent être maintenus individuellement dans une plaque de 96 puits avec VDM2 (200 μL/puits). Changez de milieu tous les 2-3 jours.

5. 3D Dosage immunofluorescent

1. Les organoïdes vasculaires devraient devenir matures vers le 13e jour. Pour les organoïdes noyés dans l’hydrogel, aspirez soigneusement le milieu et lavez-le avec 2 mL de PBS trois fois (10 min à chaque fois). Pour les organoïdes prélevés du gel (après l’étape 4.14), prélever 6 à 10 organoïdes dans un tube de microcentrifugation de 2 ml, aspirer le milieu et laver avec 2 mL de PBS trois fois (10 min chacune).
2. Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à l’échantillon et incuber à 4 °C pendant la nuit avec une pellicule de paraffine.
3. Retirer la solution de PFA et laver l’échantillon avec 2 mL de PBS quatre fois (15 min à chaque fois).
4. Ajouter 2 mL de tampon de blocage (tableau 9) et incuber à température ambiante pendant 2 h.
5. Retirer le tampon bloquant et ajouter 1,5 mL d’anticorps primaires (voir la Table des matériaux pour plus d’informations sur les anticorps ; les anticorps doivent être dilués dans le tampon bloquant). Incuber l’échantillon avec des anticorps primaires à 4 °C pendant 2 jours en agitant doucement.
   REMARQUE : Il est recommandé de diluer l’anticorps primaire (CD31, PDGFRβ et ERG1) dans le tampon de blocage dans un rapport de 1:400 (voir le tableau des matériaux pour plus d’informations).
6. Retirer la solution d’anticorps primaires et laver avec 2 mL de PBST pendant 1 h six fois.
7. Ajouter 2 mL d’anticorps secondaires (voir la Table des matériaux pour l’information sur les anticorps ; les anticorps doivent être dilués dans du PBST) à l’échantillon. Enveloppez la plaque de papier d’aluminium et incubez à 4 °C pendant 2 jours en secouant doucement.
   REMARQUE : Il est recommandé de diluer l’anticorps secondaire dans du PBST dans un rapport de 1:1000 (voir le tableau des matériaux pour plus d’informations). Gardez l’assiette à l’abri de la lumière pendant l’incubation et lavez-la à partir de cette étape par la suite.
8. Retirer la solution d’anticorps secondaire et laver avec 2 mL de TBST six fois (1 h à chaque fois). Ajouter du DAPI (1 μg/mL) dans le tampon de lavage utilisé pour la dernière étape de lavage si une coloration des noyaux est nécessaire.
9. Pour ces organoïdes enrobés de gel, coupez le gel en 4 morceaux et transférez-les soigneusement dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml à l’aide d’une spatule. Pour les organoïdes récupérés, retirez le tampon de lavage.
10. Utilisez des lingettes pour absorber la solution restante sans toucher le gel ou les organoïdes.
11. Ajouter 2 mL de réactif soluble dans l’eau (indice de réfraction = 1,49) dans chaque tube. Incuber les échantillons avec un réactif de clarification à température ambiante dans l’obscurité jusqu’à ce que les organoïdes deviennent clairs (généralement pendant la nuit). Ne secouez pas les échantillons.
12. Transférez soigneusement les organoïdes avec le réactif de clarification au centre du plat à fond de verre à l’aide d’une spatule.
13. Couvrez les organoïdes ou le morceau de gel avec une lamelle de 24 mm × 24 mm.
14. Poussez doucement la lamelle vers le bas jusqu’à ce qu’elle repose à plat, et prenez les échantillons en sandwich avec le fond en verre.
15. Retirez le réactif de clarification redondant dans le plat et scellez la lamelle avec du vernis à ongles.
16. Pour l’imagerie 3D, utilisez un microscope confocal avec un objectif de 10×. Utilisez le balayage de tuiles et le balayage Z-stack pour obtenir des images montées entières d’organoïdes.

La figure 1A présente le schéma de ce protocole, y compris les composants clés utilisés dans chaque étape. La différenciation a commencé avec la formation de l’EB, suivie de l’induction du mésoderme et de la spécification de la lignée vasculaire (Figure 1B-D). Les agrégats sont devenus plus grands et moins sphériques au fil du temps. Les organoïdes ont commencé à montrer des bords rugueux le jour 5. Après avoir été intégrées dans le mélange de matrice de collagène I-membrane basale, les cellules endothéliales vasculaires et les péricytes ont germé et dépassé pour former des réseaux vasculaires complexes dès le 7e jour (Figure 1E). Comme l’objectif principal de cette méthode modifiée est de minimiser les variations entre les différents lots de génération, nous avons mesuré la taille de l’EB à partir de deux lots indépendants, et les mesures de taille et l’analyse statistique ont confirmé la cohérence et l’uniformité de cette méthode (Figure 1F).

Pour valider la différenciation vasculaire, des organoïdes ont été collectés le jour 5 avant l’enrobage et colorés avec des marqueurs vasculaires, notamment CD31, ERG1 et PDGFRβ. Les organoïdes expriment CD31, ERG1 et PDGFRβ (Figure 2), indiquant la présence de cellules endothéliales vasculaires et de péricytes.

Après l’éclaircissement des tissus, les réseaux vasculaires ont été analysés par microscopie d’immunofluorescence à monture entière (Figure 3A). Les organoïdes matures ont été colorés avec CD31, ERG1 et PDGFRβ le jour 17 (figure 3B, échantillon dans le bloc de gel) et le jour 28 (figure 3C, l’échantillon a été extrait du bloc de gel et cultivé individuellement dans une plaque de 96 puits ; notez que le réseau vasculaire sur les bords enveloppait les sphéroïdes au lieu de se dilater radialement après avoir été récupéré du bloc de gel).

Figure 1 : Génération d’organoïdes vasculaires. (A) Schéma des étapes et chronologie de la génération d’organoïdes vasculaires. (B-E) Images représentatives en champ clair d’organoïdes vasculaires à différents stades. Barres d’échelle : 100 μm. (F) Analyse statistique en taille EB à partir de deux lots de génération EB différents à l’aide de la méthode des micropuits présentée dans ce travail. Pour la génération d’EB, 1 000 cellules par micropuits ont été utilisées, et pour les lots 1 et 2, n = 42 et n = 40, respectivement. La signification est présentée par ns, et non significative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Immunomarquage des organoïdes vasculaires avant l’enrobage du gel. Images fluorescentes représentatives d’organoïdes colorés avec les marqueurs endothéliales (A) CD31 (vert) et (B) ERG1 (vert) ainsi que (C) le marqueur péricytaire, PDGFRβ (vert), respectivement. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisations immunofluorescentes du réseau vasculaire dans les organoïdes vasculaires. (A) Une image représentative montre des organoïdes vasculaires enrobés de gel dans la boîte de verre après le nettoyage des tissus. Les organoïdes étaient transparents mais visibles sous une lumière UV de 385 nm. (B) Une image 3D représentative de l’organoïde vasculaire au jour 17. L’organoïde vasculaire a été coloré avec du DAPI (bleu), le marqueur de la cellule endothéliale vasculaire, CD31 (vert) et le marqueur du péricyte, PDGFRβ (magenta). (C) Une imagerie 3D représentative de l’ensemble d’un organoïde vasculaire récupéré au jour 28, coloré avec les marqueurs endothéliales CD31 (rouge) et ERG1 (vert). Barres d’échelle : 150 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition du milieu d’expansion hiPSC.

Tableau 2 : Composition du milieu d’ensemencement hiPSC.

Tableau 3 : Composition du milieu N2B27.

Tableau 4 : Composition du milieu d’induction du mésoderme (MIM).

Tableau 5 : Composition du milieu de différenciation vasculaire 1 (VDM1).

Tableau 6 : Composition du mélange de collagène I.

Tableau 7 : Composition du mélange de matrice de collagène I-membrane basale.

Tableau 8 : Composition du milieu de différenciation vasculaire 2 (VDM2).

Tableau 9 : Composition du tampon de blocage pour l’immunomarquage.

Le protocole décrit comprend deux modifications clés pour la génération homogène et reproductible d’organoïdes vasculaires de haute qualité. La première modification est l’utilisation d’une plaque à micropuits pour permettre un meilleur contrôle de l’uniformité de l’EB. En tant que point de départ de la différenciation vasculaire, la taille des EB est essentielle car elle régule le destin des cellules souches et l’efficacité de la différenciation envers différentes lignées. Les variations de la taille de l’EB conduisent généralement à des organoïdes hétérogènes avec une structure et une organisation incohérentes^16,17. La méthode conventionnelle de génération d’EB en soulevant les colonies d’hiPSC^11,12 rend difficile le contrôle du nombre de cellules pour les EB individuels et entraîne généralement la formation hétérogène d’EB. Dans ce protocole, les hiPSC sont dissociés en suspension unicellulaire et réagrégés dans des micropuits^16,18. En ajustant le nombre de cellules d’ensemencement, la taille des EB peut être optimisée pour assurer une différenciation mésodermique cohérente et efficace. Pour l’ensemencement de micropuits, 500 à 1 000 cellules sont utilisées, ce qui permet d’obtenir des EB relativement petits (d’un diamètre de 100 à 200 μm). Cette méthode a permis de générer de manière reproductible des EB uniformes avec les tailles souhaitées d’un lot à l’autre (Figure 1F) et parmi diverses lignées cellulaires¹³. Depuis le jour 0, la morphologie de l’EB a changé au fil du temps lors de la différenciation : la forme devient moins sphérique, et la surface devient plus rugueuse (Figure 1), mais le volume n’augmente pas significativement. La morphologie vasculaire 3D dépend de la densité d’enrobage et de la taille des organoïdes intégrés. Des organoïdes trop grands (> 500 μm) entraînent généralement une différenciation insuffisante des cellules vasculaires, tandis que des organoïdes trop petits ont tendance à avoir une vascularisation sous-développée.

La deuxième modification consiste à incorporer le cocktail CEPT pour améliorer la viabilité des hiPSC pendant la formation de l’EB. La viabilité cellulaire est cruciale en plus de la qualité des colonies hiPSC au cours de ce processus. Lorsque les hiPSC sont dissociées en une suspension unicellulaire, l’inhibiteur de ROCK Y27632 est généralement ajouté pour améliorer la viabilité cellulaire. Cependant, Y27632 s’est avéré sous-optimal pour les hiPSC à faible densité et peut provoquer un stress membranaire indésirable, tandis que le cocktail CEPT (composé de chromane 1, d’emricasan, de polyamines et de trans-ISRIB) pourrait réduire considérablement le stress cellulaire et améliorer la viabilité au cours de ce processus de formation d’EB avec des hiPSC dans une densité plus faible¹⁵.

Avant l’intégration des organoïdes dans le gel, les organoïdes sont maintenus dans la plaque de micropuits, et le changement de milieu doit être doux pour éviter toute perturbation possible. Il serait préférable d’utiliser une pipette de 200 μL pour changer de milieu pendant les 5 premiers jours. Tous les milieux utilisés pour la génération d’organoïdes vasculaires doivent être préchauffés avant utilisation. En particulier après l’enrobage de gel, l’utilisation de milieux froids pourrait liquéfier partiellement la matrice de la membrane basale et affecter la niche de l’hydrogel 3D pour la formation du réseau vasculaire. L’intégration, la densité et la distribution uniforme des organoïdes sont également des facteurs critiques pour la formation du réseau vasculaire. Un encastrement organoïde dense pourrait potentiellement conduire à une fusion excessive des réseaux vasculaires, tandis qu’une faible densité d’encastrement pourrait conduire à une formation insuffisante du réseau. L’ensemencement de 60 à 80 organoïdes par puits et le déplacement doux de la plaque d’avant en arrière immédiatement après les avoir ajoutés à la première couche de gel 3D peuvent mieux répartir ces organoïdes.

Ce protocole peut être modifié pour différentes applications. Par exemple, des signaux de barrière hémato-encéphalique (BHE) peuvent être appliqués pour restreindre davantage les cellules endothéliales vasculaires de la formation de l’interface BHE 19,20,21,22,23,24,25. La composition de l’hydrogel 3D peut également être ajustée. Par exemple, la fibrine et la vitronectine sont couramment utilisées pour la formation de réseaux vasculaires in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. La matrice de membrane basale sans collagène I peut être utilisée pour l’encastrement, ce qui peut simplifier le processus d’enrobage et fournir différents stimuli mécaniques.

Bien que les organoïdes vasculaires générés à partir de ce protocole puissent potentiellement être utilisés pour des applications de modélisation de maladies ou de criblage de médicaments, l’une des limites est que ces organoïdes ne récapitulent principalement que le système vasculaire capillaire avec peu de vaisseaux plus gros. Pour les recherches portant sur des vaisseaux plus grands, la génération d’organoïdes peut nécessiter des stimuli mécaniques supplémentaires 24,31,32,33. Relier les organoïdes vasculaires à la recirculation, comme la transplantation chez l’animal³⁴ ou les dispositifs micro-/macro-fluidiques avec des pompes à perfusion^33, pourrait potentiellement résoudre ce problème.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Nous tenons à souligner le soutien technique de la ressource partagée en microscopie confocale et spécialisée du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia, financée en partie par le NIH Center Grant (P30CA013696). Ce travail est soutenu par NIH (R21NS133635, Y.-H.L. ; UH3TR002151, K. W. L.). La figure 1A a été créée à l’aide de BioRender.