从人诱导多能干细胞生成血管类器官

该协议提出了一种使用人类多能干细胞生成血管类器官的方法。

源自人诱导多能干细胞 （hiPSC） 的血管类器官概括了人类血管网络的细胞类型多样性和复杂结构。这种三维 （3D） 模型在血管病理学建模和 体外 药物筛选方面具有巨大潜力。尽管最近取得了进展，但一个关键的技术挑战仍然是可重复地生成质量一致的类器官，这对于下游检测和应用至关重要。在这里，提出了一种改进的方案，可以提高血管类器官生成的均匀性和可重复性。修改后的方案结合了微孔和 CEPT 混合物（chroman 1、emricasan、多胺和集成应激反应抑制剂 trans-ISRIB）的使用，以改善胚状体的形成和细胞存活。使用该方案生成的分化成熟血管类器官通过整体 3D 免疫荧光显微镜进行表征，以分析其形态和复杂的脉管系统。该协议能够以可扩展的方式生产高质量的血管类器官，从而可能促进它们在疾病建模和药物筛选应用中的使用。

在过去十年中出现了体外微生理模型，包括类器官和组织芯片系统 ^1,2,3。这些三维 （3D） 人类细胞衍生系统分别解决了传统二维 （2D） 细胞培养和动物模型的局限性，例如生理微环境中缺乏许多成分和物种间的遗传差异。它们提供了更多的生理学见解，比传统模型更适合疾病建模和药物筛选。在微生理学模型中，源自人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 的类器官已被证明可以有效地概括天然人体组织的结构特征，并已被开发用于模拟不同的人体器官，包括大脑 ^4,5、肾脏⁶、肝脏 ^7,8 和视网膜⁹.在这里，我们特别关注从 hiPSC 生成血管类器官，并概述了一种简化的方案，旨在最大限度地减少不同类器官样品和批次之间的差异，从而提高整体可重复性。

脉管系统在维持所有人体器官的生理稳态方面起着至关重要的作用。脉管系统的形成涉及血管生成和血管生成过程，通过内皮细胞和壁细胞（例如，周细胞和血管平滑肌细胞）细胞之间的相互作用进行编排，并受到各种刺激的影响¹⁰。Penninger、Wimmer 及其同事开发了第一个模拟这两个过程的血管类器官生成方法 ^11,12。通过这种方法生成的类器官，他们的第¹² 组和第^13,14 组已经证明了血管类器官在模拟疾病中血管功能障碍的潜力。例如，在我们最近的工作^13,14 中，观察到了模拟疾病的血管类器官与其野生型类器官之间的不同表型，例如血管发芽和壁细胞组成变化。这些例子强调，血管类器官模型可以通过模拟疾病相关的血管功能障碍来作为药物筛选平台。

在最初的血管类器官生成工作^11,12 的基础上，提出了一种修订后的方案，其中包括使用微孔来促进同质胚状体 （EB） 的形成，这是最大限度地减少同一类器官生成批次中经常出现的变化的关键因素。此外，CEPT 混合物是 chroman 1、emricasan、多胺和集成应激反应抑制剂 （trans-ISRIB）¹⁵ 的组合，用于提高 EB 形成过程中 hiPSC 和分化细胞的活力。这种修改主要是为了减少不同类器官样品和批次之间的差异。这个大约为期两周的方案可以产生均匀的血管类器官，其中血管生成被诱导以帮助内皮组织成原始的管状网络在第 1 天，然后在第 5 天诱导血管生成以在类器官中形成复杂的血管网络。在第 12-15 天，生成的类器官应显示由内皮细胞和壁细胞组成的成熟血管网络。

图 1 概述了该协议中涉及的步骤。有关本协议中使用的试剂和材料的详细信息，请参见 材料表。除非另有说明，否则建议所有培养基在使用前都应在 37 °C 下预热。所有细胞培养材料和用品都应经过高压灭菌或无菌处理，并且细胞处理应在生物安全柜中进行。此外，应仔细将胶原蛋白 I 混合物的 pH 值调整至 pH 7.3，以避免可能的凝固问题。

1. 人类 iPSC 维持

1. 在冰上解冻基底膜基质提取物，轻轻摇动瓶子以混合溶液，然后使用 P1000 移液器和预冷藏吸头在 1.5 mL 微量离心管中制备 0.5 mL 等分试样。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 1 年。
2. 在冰上解冻一份基质提取物 （0.5 mL）。在 50 mL 试管中与 49.5 mL 预冷的 DMEM/F12 培养基混合。将混合物分配到 6 孔板中的每个孔 （1.5 mL/孔） 中，然后轻轻摇动板以确保液体溶液覆盖整个孔。用石蜡膜密封板，并在 4 °C 下储存长达 1 周。
3. 如 表 1 所述准备 hiPSC 扩增培养基。将完全培养基（40 mL/管）等分试样，并在 -20 °C 下储存长达 1 年。
4. 在hiPSC培养之前，将预涂板放入37°C培养箱中1小时。
5. 在 37 °C 下预热 hiPSC 扩增培养基 （40 mL），并按照 表 2 中的说明制备 hiPSC 接种培养基。
6. 将涂层板从 37 °C 培养箱转移到生物安全柜中。用 hiPSC 接种培养基 （1 mL/孔） 替换包被板中的培养基。
7. 将冷冻罐中冷冻保存的 hiPSC 小瓶在 37 °C 水浴中解冻 1 分钟。
8. 将细胞转移至 15 mL 试管中，然后加入 5 mL DMEM/F12 培养基，然后在室温下以 100 x g 离心 3 分钟以收集细胞。
9. 吸出上清液，并用 1.5 mL hiPSC 接种培养基重悬细胞。轻轻重悬 15 mL 试管中的细胞。
10. 分装 10 μL 细胞悬液，并与 10 μL 台盼蓝溶液混合。将 10 μL 混合物转移到血细胞计数器载玻片上，并用盖玻片盖住。
11. 将玻片安装在支架上，并将其插入自动细胞计数仪中。等待仪器找到焦点或通过按下屏幕上的 焦点 +/- 按钮手动调整焦点。之后，使用默认设置并按 Capture 按钮。使用 LIVE 细胞密度读数 作为从步骤 1.9 制备的 hiPSC 悬液的浓度。
12. 在每个孔中接种 2 × 10⁵ 个细胞，并确保细胞在孔中均匀分布。
13. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养细胞，并在 24 小时后用 hiPSC 扩增培养基（1.5 mL/孔）替换培养基。
14. 每天更换培养基，直到细胞达到 80% 的汇合度。定期检查细胞形态和集落大小，以确保没有自发分化。如果观察到广泛 （>5%） 自发分化，则丢弃培养物并用新批次的 hiPSC 重新开始。

2. EB 形成（第 0 天）

1. 在第 0 天，在 37 °C 下准备并预热 DMEM/F12 培养基、hiPSC 接种培养基和细胞分离溶液 20-30 分钟。
2. 从 6 孔板中取出培养基，加入预热的细胞分离溶液 （1.5 mL/孔）。将板在 37 °C 下孵育 5-7 分钟。
3. 将板转移到生物安全柜中，轻敲板以分离 hiPSC 集落，并打碎聚集体。
4. 将细胞悬液转移到 15 mL 试管中。加入 4.5 mL DMEM/F12 培养基。使用 10 mL 血清移液管轻轻上下吹打混合物 5 次，将细胞解离成单细胞悬液。避免产生气泡。
5. 在室温下以 100 x g 离心 3 分钟以收集细胞。
6. 吸出上清液，并使用 P1000 移液器用 1 mL hiPSC 接种培养基轻轻重悬细胞。
7. 将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝溶液混合，用于细胞计数。将 10 μL 混合物转移到血细胞计数器载玻片上，并用盖玻片盖住。将玻片安装在支架上，并将其插入自动细胞计数仪中。仪器找到焦点后，按下 Capture（捕获 ）按钮并使用 LIVE 细胞密度读数 来确定 hiPSC 悬液的浓度。
8. 将细胞接种在密度为 2.7 × 10⁵ 个细胞/孔的超低附着圆底微孔板中，以产生每个 EB 500-1,000 个细胞。
9. 向每个孔中加入 2 mL hiPSC 接种培养基，轻轻混合溶液以均匀分布细胞。
10. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养 24 小时。

3. 血管分化（第 1 - 5 天）

1. 在第 1 天，如 表 3 和 表 4 所述制备中胚层诱导培养基 （MIM），并在 37 °C 下预热 20 分钟。MIM 培养基必须是新鲜制备的。
2. 使用 P200 移液器小心地从微孔板中吸出培养基，而不会干扰底部的 EB。
3. 使用 P200 移液器缓慢加入 2.5 mL MIM。在 37 °C 和 5% CO₂ 的 MIM 中培养 EB 2 天
4. 第 3 天，用预热的、新鲜制备的 2.5 mL 血管分化培养基 1（VDM1， 表 5）轻轻更换培养基，而不会干扰微孔底部的 EB。在 37 °C 和 5% CO₂ 下将细胞再培养 2 天。

4. 水凝胶包埋（第 5 天）

1. 如 表 6 所述制备胶原蛋白 I 混合物。将 50 mL 试管置于冰上，随后加入胶原蛋白 I 溶液、H₂O、10× DMEM/F12 培养基、碳酸氢钠和 HEPES。轻轻摇动试管，充分混合。在摇动混合溶液的同时滴加 1 M NaOH 溶液，将 pH 值调节至 7.3，并用 pH 计检查混合物的 pH 值。
   注意:所有溶液在使用前都应在冰上预冷。始终在生物安全柜中的冰上执行该程序。添加 NaOH 溶液至关重要，需要快速分散以形成均匀的溶液，以避免 I 型胶原蛋白的局部固化。NaOH 的体积可能会根据所用胶原蛋白 I 溶液的批号而变化。不要用力移液进行混合，因为剪切应力可能会导致意外的预固化。
2. 如 表 7 所述制备胶原 I 基底膜基质混合物。将 1.25 mL 基底膜基质添加到步骤 4.1 制备的 5 mL 胶原蛋白 I 混合物中。通过摇动试管轻轻混合溶液。
3. 将 12 孔板置于冰上 2 分钟。
4. 使用大口径吸头将胶原蛋白 I 基底膜基质混合物缓慢添加到 12 孔板 （1.5 mL/孔） 中。确保混合物分布均匀。
5. 将板放入 37 °C 培养箱中 2 小时以固化第一层水凝胶。
6. 将剩余的胶原蛋白 I 基底膜基质混合物保存在冰上以备后用。
7. 将 ~60 个细胞聚集体转移到 1.5 mL 微量离心管中，并在冰上冷却管 5 分钟。用 P200 移液器吸头小心去除培养基。
   注意:在步骤 4.5 之后的 1.5 小时开始此步骤。
8. 滴加 1.5 mL 胶原蛋白 I 基底膜混合物到聚集体中，并使用大口径 P200 移液器吸头轻轻混合。
9. 将带有第一层水凝胶的板从培养箱（步骤 4.5）转移到生物安全柜中。
10. 将 1.5 mL 聚集体悬浮液添加到固化层上。轻轻摇动板，使聚集体均匀分布。避免产生任何气泡。
11. 将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下再孵育 2 小时。
12. 制备血管分化培养基 2 （VDM2; 表 8）并在使用前将培养基在 37 °C 水浴中预热 20 分钟。
13. 向每个孔中加入 2 mL VDM2，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养细胞。
14. 每 3 天更换一次培养基，加入预热的新鲜 VDM2。
    注:（可选）可以通过用注射器针头去除凝胶来从凝胶混合物中释放血管类器官。从凝胶中取出的血管类器官可以单独保存在含有 VDM2 （200 μL/孔） 的 96 孔板中。每 2-3 天更换一次培养基。

5. 3D 免疫荧光检测

1. 血管类器官应该大约在第 13 天成熟。对于嵌入水凝胶中的类器官，小心吸出培养基并用 2 mL PBS 洗涤 3 次（每次 10 分钟）。对于从凝胶中回收的类器官（步骤 4.14 后），在 2 mL 微量离心管中收集 6-10 个类器官，吸出培养基，然后用 2 mL PBS 洗涤 3 次（每次 10 分钟）。
2. 向样品中加入 2 mL 4% 多聚甲醛 （PFA），并在 4 °C 下用石蜡膜密封孵育过夜。
3. 取出 PFA 溶液，用 2 mL PBS 洗涤样品四次（每次 15 分钟）。
4. 加入 2 mL 封闭缓冲液（表 9）并在室温下孵育 2 小时。
5. 去除封闭缓冲液并加入 1.5 mL 一抗（抗体信息参见 材料表 ;抗体应在封闭缓冲液中稀释）。将样品与一抗在 4 °C 下轻轻摇动孵育 2 天。
   注:建议将一抗（CD31、PDGFRβ 和 ERG1）在封闭缓冲液中以 1:400 的比例稀释（有关更多信息 ，请参阅材料表 ）。
6. 取出一抗溶液，用 2 mL PBST 洗涤 1 小时 6 次。
7. 向样品中加入 2 mL 二抗（抗体信息参见 材料表 ;抗体应在 PBST 中稀释）。用铝箔包裹板，并在 4 °C 下轻轻摇动孵育 2 天。
   注:建议将二抗在 PBST 中以 1:1000 的比例稀释（有关更多信息 ，请参阅材料表 ）。在孵育过程中让板避光，然后从此步骤中清洗。
8. 去除二抗溶液，用 2 mL TBST 洗涤 6 次（每次 1 小时）。如果需要细胞核染色，请在用于最后一个洗涤步骤的洗涤缓冲液中加入 DAPI （1 μg/mL）。
9. 对于这些凝胶包埋的类器官，将凝胶切成 4 块，然后用刮刀小心地将它们转移到 2 mL 微量离心管中。对于检索到的类器官，去除洗涤缓冲液。
10. 使用湿巾吸收剩余的溶液，而无需接触凝胶或类器官。
11. 向每个试管中加入 2 mL 水溶性组织透明化试剂（折射指数 = 1.49）。在室温下避光孵育样品与透明试剂，直到类器官变得透明（通常过夜）。不要摇晃样品。
12. 使用刮刀小心地将带有透明试剂的类器官转移到玻璃底培养皿的中心。
13. 用 24 mm × 24 mm 盖玻片覆盖类器官或凝胶片。
14. 轻轻向下推盖玻片，直到其平放，然后将样品与玻璃底部夹在一起。
15. 去除培养皿中多余的清除试剂，并用指甲油密封盖玻片。
16. 对于 3D 成像，请使用物镜为 10× 的共聚焦显微镜。使用平铺扫描和 Z 堆栈扫描来获得类器官的整体安装图像。

图 1A 显示了该协议的方案，包括每个阶段使用的关键组件。分化从 EB 形成开始，然后是中胚层诱导和血管谱系规范（图 1B-D）。随着时间的推移，聚集体变得更大，球形越来越小。类器官在第 5 天开始出现粗糙的边缘。包埋在胶原蛋白 I 基底膜基质混合物中后，血管内皮细胞和周细胞早在第 7 天就发芽并生长形成复杂的血管网络（图 1E）。由于这种修改后的方法的主要目的是最大限度地减少不同世代批次之间的差异，我们测量了两个独立批次的 EB 大小，尺寸测量和统计分析都证实了该方法的一致性和均匀性（图 1F）。

为了验证血管分化，在包埋前第 5 天收集类器官，并用血管标志物染色，包括 CD31 、 ERG1 和 PDGFRβ。类器官表达 CD31 、 ERG1 和 PDGFRβ （图 2），表明存在血管内皮细胞和周细胞。

组织透明化后，用整座免疫荧光显微镜分析血管网络（图 3A）。在第 17 天（图 3B，凝胶块中的样品）和第 28 天（图 3C，从凝胶块中取出样品并在 96 孔板中单独培养;请注意，边缘的血管网络包裹着球状体，而不是在从凝胶块中取出后径向膨胀）。

图 1:血管类器官生成。（A） 血管类器官生成的步骤和时间表图。（B-E）不同阶段血管类器官的代表性明场图像。比例尺:100 μm。（F） 使用本研究中介绍的微孔方法对两个不同 EB 生成批次的 EB 大小进行统计分析。对于 EB 生成，每个微孔使用 1,000 个细胞，对于批次 1 和 2，分别为 n = 42 和 n = 40。显著性以 ns 表示，而不是显著性。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:凝胶包埋前血管类器官的免疫染色。 分别用内皮标志物 （A） CD31（绿色）和 （B） ERG1（绿色）以及 （C） 周细胞标志物 PDGFRβ（绿色）染色的类器官的代表性荧光图像。细胞核用 DAPI （蓝色） 复染。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:血管类器官中血管网络的免疫荧光特征。 （A） 代表性图像显示组织透明化后玻璃皿中的凝胶包埋血管类器官。类器官是透明的，但在 385 nm 紫外光下可见。（B） 第 17 天血管类器官的代表性 3D 全安装图像。血管类器官用 DAPI （蓝色）、血管内皮细胞标志物 CD31 （绿色） 和周细胞标志物 PDGFRβ （品红色） 染色。（C） 第 28 天检索到的血管类器官的代表性整装 3D 成像，用内皮标志物 CD31（红色）和 ERG1（绿色）染色。比例尺:150 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

表 1:hiPSC 扩增培养基的组成。

表 2:hiPSC 接种培养基的组成。

表 3:N2B27 培养基的组成。

表 4:中胚层诱导培养基 （MIM） 的组成。

表 5:血管分化培养基 1 （VDM1） 的组成。

表 6:I 型胶原混合物的组成。

表 7:胶原蛋白 I 基底膜基质混合物的组成。

表 8:血管分化培养基 2 （VDM2） 的组成。

表 9:用于免疫染色的封闭缓冲液的组成。

所描述的方案包括两个关键修饰，用于同质和可重复地生成高质量的血管类器官。第一种修改是使用微孔板，以便更好地控制 EB 均匀性。作为血管分化的起点，EB 的大小至关重要，因为它调节干细胞的命运和对不同谱系的分化功效。EB 大小的变化通常会导致结构和组织不一致的异质类器官^16,17。通过提升 hiPSC 集落^11,12 的常规 EB 生成方法难以控制单个 EB 的细胞数量，通常会导致异质性 EB 形成。在该方案中，hiPSC 被解离成单细胞悬液并在微孔中重新聚集^16,18。通过调整接种细胞数量，可以优化 EB 的大小，以确保一致和有效的中胚层分化。对于微孔接种，使用 500-1,000 个细胞，这可以产生相对较小的 EB（直径为 100-200 μm）。这种方法可以在批次间和各种细胞系之间可重现地生成具有所需大小的均匀 EB（图 1F）¹³。从第 0 天开始，EB 的形态在分化过程中随着时间的推移而变化:形状变得不那么球形，表面变得更粗糙（图 1），但体积没有显着增加。3D 脉管系统形态取决于包埋密度和包埋的类器官的大小。太大 （>500 μm） 的类器官通常会导致血管细胞分化不足，而太小的类器官往往具有不发达的脉管系统。

第二种修改是掺入 CEPT 混合物以提高 EB 形成过程中的 hiPSC 活力。在此过程中，除了 hiPSC 集落的质量外，细胞活力也至关重要。当 hiPSC 解离成单细胞悬液时，通常会添加 ROCK 抑制剂 Y27632 以提高细胞活力。然而，Y27632 已被证明对低密度的 hiPSC 不理想，并且可能导致不希望的膜应激，而 CEPT 混合物（由 chroman 1、emricasan、多胺和反式 ISRIB 组成）可以显着降低细胞应激并提高 EB 形成过程中的活力，其中 hiPSC 密度较低¹⁵。

在类器官包埋到凝胶中之前，类器官保持在微孔板中，培养基更换应温和，以避免可能的破坏。最好在前 5 天使用 200 μL 移液器更换培养基。所有用于血管类器官生成的介质在使用前必须预热。特别是在凝胶包埋后，使用冷介质可以部分液化基底膜基质并影响 3D 水凝胶生态位以形成血管网络。类器官的包埋密度和均匀分布也是血管网络形成的关键因素。密集的类器官包埋可能导致血管网络的过度融合，而低包埋密度可能导致网络形成不足。每孔接种 60-80 个类器官，并在将它们添加到 3D 凝胶的第一层后立即轻轻地来回移动板，可以更好地分布这些类器官。

该协议可以针对不同的应用进一步修改。例如，血脑屏障 （BBB） 线索可用于进一步抑制血管内皮细胞形成 BBB 界面 19,20,21,22,23,24,25。3D 水凝胶成分也可以调整。例如，纤维蛋白和玻连蛋白通常用于体外血管网络形成 ^{25、26、27、28、29、30、31、32}。不含胶原蛋白 I 的基底膜基质可用于包埋，这可能会简化包埋过程并提供不同的机械刺激。

尽管从该方案生成的血管类器官可能用于疾病建模或药物筛选应用，但一个限制是这些类器官仅主要概括毛细血管系统，很少有较大的血管。对于专注于较大血管的研究，类器官的产生可能需要额外的机械刺激 24,31,32,33。将血管类器官与再循环连接起来，例如移植到动物身上³⁴ 或带有灌注泵³³ 的微/宏观流体装置，可能会解决这个问题。

作者声明没有竞争性的经济利益。

我们要感谢哥伦比亚大学 Herbert Irving 综合癌症中心的共聚焦和专业显微镜共享资源的技术支持，部分资金来自 NIH 中心赠款 （P30CA013696）。这项工作得到了 NIH （R21NS133635， Y.-H.L.;UH3TR002151，KWL）。图 1A 是使用 BioRender 创建的。