JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوليد العضيات الوعائية باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

Abstract

تلخص العضيات الوعائية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تنوع نوع الخلايا والهندسة المعمارية المعقدة لشبكات الأوعية الدموية البشرية. يحمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة لنمذجة أمراض الأوعية الدموية وفحص الأدوية في المختبر . على الرغم من التطورات الأخيرة ، لا يزال هناك تحد تقني رئيسي يتمثل في توليد العضيات بشكل متكرر بجودة متسقة ، وهو أمر بالغ الأهمية لفحوصات وتطبيقات المصب. هنا ، يتم تقديم بروتوكول معدل يحسن كلا من تجانس وقابلية التكاثر لتوليد العضيات الوعائية. يشتمل البروتوكول المعدل على استخدام الآبار الصغيرة وكوكتيل CEPT (chroman 1 ، emricasan ، polyamines ، ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل ، عبر ISRIB) لتحسين تكوين الجسم الجنيني وبقاء الخلايا. تتميز العضيات الوعائية المتمايزة الناضجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول بفحص مجهري مناعي ثلاثي الأبعاد كامل لتحليل مورفولوجيتها والأوعية الدموية المعقدة. يتيح هذا البروتوكول إنتاج عضيات وعائية عالية الجودة بطريقة قابلة للتطوير ، مما قد يسهل استخدامها في نمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية.

Introduction

ظهرت نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة في المختبر ، بما في ذلك الأنظمة العضوية والأنسجة على الرقاقة ، على مدار العقد الماضي1،2،3. تعالج هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من الخلايا البشرية القيود المفروضة على زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية ، مثل عدم وجود العديد من المكونات في البيئة المكروية الفسيولوجية والاختلافات الجينية عبر الأنواع ، على التوالي. إنها توفر المزيد من الأفكار الفسيولوجية وهي أكثر ملاءمة لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية من النماذج التقليدية. من بين النماذج الفيزيولوجية الدقيقة ، ثبت أن العضيات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تلخص السمات المعمارية للأنسجة البشرية الأصلية بشكل فعال وتم تطويرها لتقليد الأعضاء البشرية المختلفة ، بما في ذلك الدماغ4،5 ، الكلى6 ، الكبد7،8 وشبكيةالعين 9. هنا ، نركز بشكل خاص على توليد العضيات الوعائية من hiPSCs ونحدد بروتوكولا مبسطا يهدف إلى تقليل الاختلافات بين العينات العضوية المختلفة والدفعات ، وبالتالي تحسين قابلية التكاثر الإجمالية.

تلعب الأوعية الدموية دورا مهما في الحفاظ على التوازن الفسيولوجي في جميع أعضاء الإنسان. يتضمن تكوين الأوعية الدموية عمليات تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية الدموية ، والتي يتم تنظيمها من خلال التفاعلات بين الخلايا البطانية والجدارية (على سبيل المثال ، الخلايا المحيطة وخلايا العضلات الملساء الوعائية) وتتأثر بمحفزات مختلفة10. طور Penninger و Wimmer وزملاؤه أول طريقة لتوليد العضوية الوعائية11،12 التي تحاكي هاتين العمليتين. مع العضيات المتولدة من هذه الطريقة ، أثبتت مجموعتهم12 و13،14 إمكانات العضيات الوعائية لنمذجة أعطال الأوعية الدموية في الأمراض. على سبيل المثال ، في أعمالنا الأخيرة13،14 ، لوحظت أنماط ظاهرية مميزة ، مثل تنبت الأوعية الدموية واختلافات تكوين الخلايا الجدارية ، بين العضيات الوعائية التي تحاكي الأمراض ونظيراتها من النوع البري. تسلط هذه الأمثلة الضوء على أن النموذج العضوي الوعائي يمكن أن يكون بمثابة منصة لفحص الأدوية من خلال محاكاة أعطال الأوعية الدموية المرتبطة بالأمراض.

مبني على أعمال التوليد العضوي الوعائي الأولي11،12 ، تم تقديم بروتوكول منقح يتضمن استخدام الميكروويل لتسهيل تكوين الجسم الجنيني المتجانس (EB) ، وهو عامل حاسم في تقليل الاختلافات التي غالبا ما تظهر داخل نفس دفعة توليد العضوية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام كوكتيل CEPT ، وهو مزيج من chroman 1 و emricasan و polyamines ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل (trans-ISRIB) 15 ، لتحسين قابلية بقاء hiPSCs والخلايا المتمايزة أثناء عملية تكوين EB. يهدف هذا التعديل بشكل أساسي إلى تقليل الاختلافات بين العينات العضوية والدفعات المختلفة. يمكن إنتاج عضيات الأوعية الدموية الموحدة باستخدام هذا البروتوكول الذي يستمر لمدة أسبوعين تقريبا ، حيث يتم تحفيز تكوين الأوعية الدموية لمساعدة البطانة على التنظيم في شبكات أنبوبية بدائية في اليوم الأول ، متبوعا بتحريض تكوين الأوعية الدموية في اليوم 5 لتطوير شبكات الأوعية الدموية المعقدة في العضيات. في اليوم 12-15 ، يجب أن تظهر العضيات المتولدة شبكات الأوعية الدموية الناضجة المكونة من كل من الخلايا البطانة والخلايا الجدارية.

Protocol

يقدم الشكل 1 نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في هذا البروتوكول. وترد معلومات مفصلة عن الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يوصى بتسخين جميع الوسائط مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع مواد ومستلزمات زراعة الخلايا إما معقمة أو معقمة ، ويجب أن تتم معالجة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعديل قيمة الأس الهيدروجيني لخليط الكولاجين I بعناية إلى درجة الحموضة 7.3 لتجنب مشكلات التصلب المحتملة.

1. صيانة iPSC البشرية

  1. قم بإذابة مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج ، ورج الزجاجة برفق لخلط المحلول ، وقم بعمل 0.5 مل من الحصص في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام ماصة P1000 وأطراف مبردة مسبقا. قم بتخزين الكميات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. قم بإذابة كمية واحدة من مستخلص المصفوفة (0.5 مل) على الثلج. تخلط مع 49.5 مل من وسط DMEM / F12 المبرد مسبقا في أنبوب سعة 50 مل. وزعي الخليط على كل بئر (1.5 مل / بئر) في أطباق من 6 آبار ثم رجي الطبق برفق للتأكد من أن المحلول السائل يغطي البئر بالكامل. أغلق الألواح بغشاء البارافين واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  3. إعداد وسيط تمدد hiPSC كما هو موضح في الجدول 1. قم بعمل كميات من الوسط الكامل (40 مل / أنبوب) وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  4. ضع صفيحة مطلية مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل ثقافة hiPSC.
  5. وسط تمدد hiPSC (40 مل) عند 37 درجة مئوية وإعداد وسط البذر hiPSC كما هو موضح في الجدول 2.
  6. انقل اللوحة المطلية من الحاضنة 37 درجة مئوية إلى خزانة السلامة الحيوية. استبدل الوسط الموجود في اللوحة المطلية بوسط بذر hiPSC (1 مل / بئر).
  7. قم بإذابة قارورة محفوظة بالتبريد من hiPSCs من خزان التبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  8. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل ثم أضف 5 مل من وسط DMEM / F12 ، متبوعا بالطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع الخلايا.
  9. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 1.5 مل من وسط البذر hiPSC. أعد تعليق الخلايا برفق في أنبوب سعة 15 مل.
  10. Aliquot 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتخلط مع 10 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق. انقل خليط 10 ميكرولتر إلى شريحة مقياس الدم وقم بتغطيته بغطاء غطاء.
  11. قم بتركيب الشريحة على الحامل وأدخلها في عداد الخلية الآلي. انتظر حتى تعثر الأداة على التركيز أو اضبط التركيز يدويا بالضغط على زر التركيز +/- على الشاشة. بعد ذلك ، استخدم الإعداد الافتراضي واضغط على زر الالتقاط . استخدم قراءة كثافة الخلية الحية كتركيز معلق hiPSC المحضر من الخطوة 1.9.
  12. البذور 2 × 105 خلايا في كل بئر وتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في البئر.
  13. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واستبدل الوسط بوسط تمدد hiPSC (1.5 مل / بئر) بعد 24 ساعة.
  14. قم بتغيير الوسط يوميا حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪. تحقق من مورفولوجيا الخلية وحجم المستعمرة بشكل روتيني لضمان عدم وجود تمايز تلقائي. تخلص من الثقافة وأعد تشغيلها بدفعة جديدة من hiPSCs إذا لوحظ تمايز تلقائي واسع النطاق (>5٪).

2. تشكيل EB (اليوم 0)

  1. في اليوم 0 ، قم بإعداد وتسخين وسط DMEM / F12 ، ووسط البذر hiPSC ومحلول انفصال الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
  2. قم بإزالة وسط المزرعة من اللوحة المكونة من 6 آبار وأضف محلول انفصال الخلايا المسخن مسبقا (1.5 مل / بئر). احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق.
  3. انقل اللوحة إلى خزانة السلامة الحيوية ، واضغط على اللوحة لفصل مستعمرات hiPSC ، وقم بتفكيك الركام.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 4.5 مل من وسط DMEM / F12. قم بسحب الخليط برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل خمس مرات لفصل الخلايا إلى معلق أحادي الخلية. تجنب توليد الفقاعات.
  5. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع الخلايا.
  6. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا برفق باستخدام 1 مل من وسط البذر hiPSC باستخدام ماصة P1000.
  7. امزج 10 ميكرولتر من معلق الخلية مع 10 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق لعد الخلايا. انقل 10 ميكرولتر من الخليط إلى شريحة مقياس الدم وقم بتغطيته بغطاء. قم بتركيب الشريحة على الحامل وأدخلها في عداد الخلية الآلي. بعد أن يجد الجهاز التركيز البؤري ، اضغط على زر الالتقاط واستخدم قراءة كثافة الخلية LIVE لتحديد تركيز تعليق hiPSC.
  8. قم بزرع الخلايا في صفيحة microwell مستديرة منخفضة الارتباط بكثافة 2.7 × 105 خلايا / بئر لإنتاج 500-1,000 خلية لكل EB.
  9. أضف 2 مل من وسط البذر hiPSC إلى كل بئر واخلط المحلول برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي.
  10. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.

3. تمايز الأوعية الدموية (اليوم 1 - 5)

  1. في اليوم 1 ، قم بإعداد وسط تحريض الأديم المتوسط (MIM) كما هو موضح في الجدول 3 والجدول 4 وقم بتسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. يجب أن يكون وسيط MIM طازجا.
  2. استخدم ماصة P200 لشفط الوسط بعناية من لوحة الميكروويل دون إزعاج EBs في الأسفل.
  3. أضف 2.5 مل من MIM ببطء باستخدام ماصة P200. استزراع EBs في MIM عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة يومين.
  4. في اليوم 3 ، استبدل الوسط برفق ب 2.5 مل من وسط تمايز الأوعية الدموية 1 (VDM1 ، الجدول 5) دون إزعاج EBs في قاع البئر الصغير. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة يومين آخرين.

4. تضمين الهيدروجيل (اليوم 5)

  1. تحضير خليط الكولاجين الأول كما هو موضح في الجدول 6. ضع أنبوبا سعة 50 مل على الثلج وأضف محلول الكولاجين الأول ، H2O ، 10× DMEM / F12 المتوسط ، بيكربونات الصوديوم و HEPES لاحقا. تخلط جيدا عن طريق هز الأنبوب برفق. أضف 1 M محلول هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط أثناء رج المحلول المختلط لضبط قيمة الأس الهيدروجيني إلى 7.3 وتحقق من قيمة الأس الهيدروجيني للخليط باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
    ملاحظة: يجب تبريد جميع المحاليل مسبقا على الثلج قبل الاستخدام. قم بتنفيذ الإجراء على الجليد في خزانة السلامة الحيوية طوال الوقت. تعد إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم أمرا بالغ الأهمية ، وهناك حاجة إلى تشتت سريع لعمل محلول متجانس لتجنب المعالجة الموضعية للكولاجين الأول. قد يختلف حجم هيدروكسيد الصوديوم بناء على عدد محلول الكولاجين الأول المستخدم. لا تقم بسحب الماصات بقوة للخلط ، لأن إجهاد القص قد يتسبب في معالجة مسبقة غير مرغوب فيها.
  2. تحضير خليط مصفوفة غشاء الكولاجين I-القاعدي كما هو موضح في الجدول 7. أضف 1.25 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى خليط الكولاجين الأول سعة 5 مل المحضر من الخطوة 4.1. امزج المحلول برفق عن طريق هز الأنبوب.
  3. ضع طبقا من 12 بئرا على الثلج لمدة دقيقتين.
  4. أضف خليط مصفوفة غشاء الكولاجين I ببطء إلى الصفيحة المكونة من 12 بئرا (1.5 مل / بئر) باستخدام الأطراف ذات التجويف العريض. تأكد من توزيع الخليط بالتساوي.
  5. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لترسيخ الطبقة الأولى من الهيدروجيل.
  6. احتفظ بخليط مصفوفة غشاء الكولاجين I المتبقي على الثلج لاستخدامه لاحقا.
  7. انقل ~ 60 خلية مجاميع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وقم بتبريد الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الوسط بعناية باستخدام طرف ماصة P200.
    ملاحظة: ابدأ هذه الخطوة بعد 1.5 ساعة من الخطوة 4.5.
  8. بالتنقيط ، أضف 1.5 مل من خليط غشاء الكولاجين I-basement إلى الركام واخلطها برفق باستخدام أطراف ماصة P200 واسعة التجويف.
  9. انقل اللوحة مع الطبقة الأولى من الهيدروجيل من الحاضنة (الخطوة 4.5) إلى خزانة السلامة الحيوية.
  10. أضف 1.5 مل من التعليق الكلي على الطبقة المعالجة رج الطبق برفق لتوزيع الركام بالتساوي. تجنب توليد أي فقاعات.
  11. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين أخرى.
  12. تحضير وسط تمايز الأوعية الدموية 2 (VDM2; الجدول 8) وقم بتسخين الوسط في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام.
  13. أضف 2 مل من VDM2 إلى كل بئر وقم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  14. قم بتغيير الوسط كل 3 أيام باستخدام VDM2 الطازج الدافئ مسبقا.
    ملاحظة: (اختياري) يمكن إطلاق عضيات الأوعية الدموية من خليط الجل عن طريق إزالة الجل بإبرة حقنة. يمكن الحفاظ على العضيات الوعائية المسترجعة من الجل بشكل فردي في صفيحة 96 بئرا مع VDM2 (200 ميكرولتر / بئر). قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام.

5. 3D مقايسة الفلورسنت المناعي

  1. يجب أن تصبح العضيات الوعائية ناضجة تقريبا في اليوم 13. بالنسبة للعضويات المضمنة في الهيدروجيل ، قم بشفط الوسط بعناية واغسله ب 2 مل PBS ثلاث مرات (10 دقائق في كل مرة). بالنسبة للعضيات المسترجعة من الجل (بعد الخطوة 4.14) ، اجمع 6-10 عضيات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، وشفط الوسائط ، واغسلها ب 2 مل PBS ثلاث مرات (10 دقائق لكل منهما).
  2. أضف 2 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى العينة واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع ختم فيلم البارافين.
  3. قم بإزالة محلول PFA واغسل العينة ب 2 مل PBS أربع مرات (15 دقيقة في كل مرة).
  4. أضف 2 مل من المخزن المؤقت للحجب (الجدول 9) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
  5. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع وأضف 1.5 مل من الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد للحصول على معلومات الأجسام المضادة ؛ يجب تخفيف الأجسام المضادة في المخزن المؤقت للحظر). احتضان العينة بالأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة يومين مع رج لطيف.
    ملاحظة: يوصى بتخفيف الجسم المضاد الأساسي (CD31 و PDGFRβ و ERG1) في المخزن المؤقت للحجب بنسبة 1: 400 (انظر جدول المواد لمزيد من المعلومات).
  6. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسله ب 2 مل PBST لمدة ساعة ست مرات.
  7. أضف 2 مل من الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد للحصول على معلومات الأجسام المضادة ؛ يجب تخفيف الأجسام المضادة في PBST) إلى العينة. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة يومين مع رج لطيف.
    ملاحظة: يوصى بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في PBST بنسبة 1: 1000 (انظر جدول المواد لمزيد من المعلومات). احتفظ باللوحة بعيدا عن الضوء أثناء الحضانة واغسلها من هذه الخطوة بعد ذلك.
  8. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسله ب 2 مل TBST ست مرات (1 ساعة في كل مرة). أضف DAPI (1 ميكروغرام / مل) في مخزن الغسيل المستخدم في خطوة الغسيل الأخيرة إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ النوى.
  9. بالنسبة لهذه العضيات المضمنة في الهلام ، قم بتقطيع الجل إلى 4 قطع ونقلها بعناية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل باستخدام ملعقة. بالنسبة للعضيات المستردة ، قم بإزالة مخزن الغسيل.
  10. استخدم المناديل المبللة لامتصاص المحلول المتبقي دون لمس الجل أو العضيات.
  11. أضف 2 مل من كاشف إزالة الأنسجة القابل للذوبان في الماء (مؤشر الانكسار = 1.49) إلى كل أنبوب. احتضان العينات بكاشف المقاصة في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى تصبح العضيات واضحة (عادة بين عشية وضحاها). لا تهز العينات.
  12. انقل العضيات باستخدام كاشف المقاصة بعناية إلى وسط الطبق ذو القاع الزجاجي باستخدام ملعقة.
  13. قم بتغطية العضيات أو قطعة الجل بغطاء 24 مم × 24 مم.
  14. ادفع الغطاء لأسفل برفق حتى يصبح مسطحا ، وقم بشطيرة العينات بقاع الزجاج.
  15. قم بإزالة كاشف المقاصة الزائد عن الحاجة في الطبق وأغلق الغطاء بطلاء الأظافر.
  16. للتصوير ثلاثي الأبعاد ، استخدم مجهر متحد البؤر بهدف 10×. استخدم مسح البلاط والمسح الضوئي Z-stack للحصول على صور كاملة للعضيات العضوية.

النتائج

يعرض الشكل 1 أ مخطط هذا البروتوكول ، بما في ذلك المكونات الرئيسية المستخدمة في كل مرحلة. بدأ التمايز بتكوين EB ، تلاه تحريض الأديم المتوسط ومواصفات النسب الوعائي (الشكل 1B-D). نمت الركام بشكل أكبر وأقل كروية بمرور الوقت. بدأت العضيات في إظهار حواف خشنة في اليوم الخامس. بعد دمجها في خليط مصفوفة غشاء الكولاجين الأول القاعدي ، نبتت الخلايا البطانية الوعائية والخلايا المحيطة وتكبرت لتشكيل شبكات الأوعية الدموية المعقدة في وقت مبكر من اليوم 7 (الشكل 1 ه). نظرا لأن الغرض الرئيسي من هذه الطريقة المعدلة هو تقليل الاختلافات بين دفعات الجيل المختلفة ، فقد قمنا بقياس حجم EB من دفعتين مستقلتين ، وأكدت كل من قياسات الحجم والتحليل الإحصائي الاتساق والتوحيد مع هذه الطريقة (الشكل 1F).

للتحقق من صحة تمايز الأوعية الدموية ، تم جمع العضيات في اليوم 5 قبل تضمينها وتلطيخها بعلامات الأوعية الدموية ، بما في ذلك CD31 و ERG1 و PDGFRβ. عبرت العضيات عن CD31 و ERG1 و PDGFRβ (الشكل 2) ، مما يشير إلى وجود الخلايا البطانية الوعائية والخلايا المحيطة.

بعد إزالة الأنسجة ، تم تحليل شبكات الأوعية الدموية باستخدام الفحص المجهري المناعي الكامل (الشكل 3 أ). تم تلطيخ العضيات الناضجة ب CD31 و ERG1 و PDGFRβ في اليوم 17 (الشكل 3 ب ، عينة في كتلة الجل) واليوم 28 (الشكل 3 ج ، تم استرداد العينة من كتلة الهلام والثقافة بشكل فردي في صفيحة مكونة من 96 بئرا ؛ لاحظ أن شبكة الأوعية الدموية عند الحواف تلف الكرويات بدلا من التمدد شعاعيا بعد استرجاعها من كتلة الهلام).

figure-results-1795
الشكل 1: توليد العضوية الوعائية. (أ) مخطط الخطوات والجدول الزمني لتوليد العضوية الوعائية. (ب - ه) صور المجال الساطع التمثيلية للعضيات الوعائية في مراحل مختلفة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. (F) التحليل الإحصائي في حجم EB من دفعتين مختلفتين من جيل EB باستخدام طريقة microwell المعروضة في هذا العمل. بالنسبة لتوليد EB ، تم استخدام 1,000 خلية لكل ميكروبئر ، وبالنسبة للدفعتين 1 و 2 ، n = 42 و n = 40 ، على التوالي. يتم تقديم الأهمية على أنها ns ، وليست مهمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2678
الشكل 2: التلوين المناعي للعضيات الوعائية قبل تضمين الجل. صور فلورية تمثيلية للعضيات الملطخة بعلامات البطانية (أ) CD31 (أخضر) و (ب) ERG1 (أخضر) وكذلك (ج) علامة السعيج ، PDGFRβ (أخضر) ، على التوالي. تم تلطيخ النوى ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3328
الشكل 3: توصيفات الفلورسنت المناعي لشبكة الأوعية الدموية في العضيات الوعائية. (أ) تظهر صورة تمثيلية عضيات الأوعية الدموية المضمنة في الهلام في الطبق الزجاجي بعد إزالة الأنسجة. كانت العضيات شفافة ولكنها مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 385 نانومتر. (ب) صورة تمثيلية ثلاثية الأبعاد كاملة للعضيات الوعائية في اليوم 17. تم تلطيخ العضوية الوعائية ب DAPI (أزرق) ، وعلامة الخلايا البطانية الوعائية ، CD31 (أخضر) وعلامة السعيج ، PDGFRβ (أرجواني). (ج) تصوير ثلاثي الأبعاد تمثيلي كامل التركيب لعضوية وعائية تم استردادها في اليوم 28 ، ملطخة بعلامات البطانية CD31 (أحمر) و ERG1 (أخضر). أشرطة المقياس: 150 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

وسيط توسيع hiPSC500 مل
mTeSR Plus الوسط القاعدي400 مل
مكمل mTeSR Plus100 مل
جنتاميسين (50 مجم / مل)1 مل

الجدول 1: تكوين وسط تمدد hiPSC.

وسط البذر hiPSC20 مل
وسيط توسعة PSC20 مل
كرومان 1 (100 ميكرومتر)10 ميكرولتر
Emricasan (1 ملم)30 ميكرولتر
مكمل بولي أمين (1000x)20 ميكرولتر
عبر ISRIB (1 ملليمتر)14 ميكرولتر

الجدول 2: تكوين وسط البذر hiPSC.

N2B27 متوسط100 مل
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAX48.6 مل
وسط NeuroBasal48.6 مل
مكمل GlutaMAX (100x)0.5 مل
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (NEAA ، 100x)0.5 مل
2-ميركابتو إيثانول (1000x)0.1 مل
جنتاميسين (50 مجم / مل)0.1 مل
ملحق N2 (100x)0.5 مل
مكمل فيتامين ب 27 مطروحا منه فيتامين أ (50 ضعفا)1 مل
الهيبارين ، 4 كيلو واط / مل0.1 مل

الجدول 3: تكوين وسط N2B27.

وسط تحريض الأديم المتوسط (MIM)3 مل
N2B27 متوسط3 مل
BMP4 (100 نانوغرام/ميكرولتر)0.9 ميكرولتر
CHIR99021 (12 مل)3 ميكرولتر

الجدول 4: تكوين وسط تحريض الأديم المتوسط (MIM).

وسط تمايز الأوعية الدموية 1 (VDM1)3 مل
N2B27 متوسط3 مل
فورسكلين (12 مل)0.5 ميكرولتر
VEGFA (100 نانوغرام / ميكرولتر)3 ميكرولتر

الجدول 5: تكوين وسط تمايز الأوعية الدموية 1 (VDM1).

خليط الكولاجين الأول5 مل
الكولاجين الأول (3.61 جم / مل)2.77 مل
10x DMEM / F12 متوسط0.5 مل
بيكربونات الصوديوم ، 7.5٪0.5 مل
هيبس ، 1 م0.5 مل
H2O0.73 مل
هيدروكسيد الصوديوم ، 1 م75 ميكرولتر

الجدول 6: تكوين خليط الكولاجين الأول.

الكولاجين الأول - خليط مصفوفة الغشاء القاعدي6.5 مل
خليط الكولاج الأول5 مل
ماتريجيل (10 مجم / مل)1.5 مل

الجدول 7: تكوين خليط مصفوفة غشاء الكولاجين I-القاعدية.

وسط تمايز الأوعية الدموية 2 (VDM2)5 مل
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAX™3.67 مل
جنتاميسين (50 مجم / مل)5 ميكرولتر
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (NEAA ، 100X)50 ميكرولتر
2-ميركابتو إيثانول (1000x)5 ميكرولتر
الهيبارين ، 4 كيلو واط / مل5 ميكرولتر
استبدال مصل خروج المغلوب0.75 مل
FBS0.5 مل
VEGFA (100 نانوغرام / ميكرولتر)5 ميكرولتر
FGF2 (100 نانوغرام/ميكرولتر)5 ميكرولتر

الجدول 8: تكوين وسط تمايز الأوعية الدموية 2 (VDM2).

المخزن المؤقت للحجب50 مل
مصل الحمار2.5 مل
توين 200.25 مل
تريتون X-1000.25 مل
محلول ديوكسي كولات الصوديوم (1٪ ، الوزن / الحجم)0.5 مل
برنامج تلفزيوني46.5 مل

الجدول 9: تكوين المخزن المؤقت للانسداد للتلوين المناعي.

Discussion

يتضمن البروتوكول الموصوف تعديلين رئيسيين للتوليد المتجانس والقابل للتكرار من العضيات الوعائية عالية الجودة. التعديل الأول هو استخدام لوحة microwell لتمكين التحكم بشكل أفضل في توحيد EB. كنقطة انطلاق لتمايز الأوعية الدموية ، يعد حجم EBs أمرا بالغ الأهمية لأنه ينظم مصير الخلايا الجذعية وفعالية التمايز تجاه سلالات مختلفة. عادة ما تؤدي الاختلافات في حجم EB إلى عضيات غير متجانسة ذات بنية وتنظيم غير متسقين16،17. طريقة توليد EB التقليدية عن طريق رفع مستعمرات hiPSC11،12 تجعل من الصعب التحكم في أعداد الخلايا للطوابع الكهربية الفردية وعادة ما تؤدي إلى تكوين EB غير متجانس. في هذا البروتوكول ، يتم فصل hiPSCs إلى معلق أحادي الخلية وإعادة تجميعها في الآبار الصغيرة16،18. من خلال ضبط أعداد خلايا البذر ، يمكن تحسين حجم EBs لضمان تمايز الأديم المتوسط بشكل متسق وفعال. بالنسبة لتلقيح الآبار الصغيرة ، يتم استخدام 500-1,000 خلية ، وهذا يمكن أن ينتج عنه EBs صغيرة نسبيا (بقطر 100-200 ميكرومتر). يمكن أن تولد هذه الطريقة بشكل متكرر EBs موحدة بالأحجام المطلوبة من دفعة إلى أخرى (الشكل 1F) وبين خطوط الخلاياالمختلفة 13. منذ اليوم 0 ، تغيرت مورفولوجيا EB بمرور الوقت أثناء التمايز: يصبح الشكل أقل كروية ، ويصبح السطح أكثر خشونة (الشكل 1) ، لكن الحجم لا يزداد بشكل كبير. يعتمد مورفولوجيا الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد على كثافة التضمين وأحجام العضيات المضمنة. عادة ما تؤدي العضيات الكبيرة جدا (>500 ميكرومتر) إلى عدم كفاية تمايز الخلايا الوعائية ، بينما تميل العضيات الصغيرة جدا إلى أن يكون لها الأوعية الدموية المتخلفة.

التعديل الثاني هو دمج كوكتيل CEPT لتحسين جدوى hiPSC أثناء تكوين EB. تعد صلاحية الخلية أمرا بالغ الأهمية بالإضافة إلى جودة مستعمرات hiPSC خلال هذه العملية. عندما يتم فصل hiPSCs في معلق أحادي الخلية ، عادة ما يتم إضافة مثبط ROCK Y27632 لتحسين صلاحية الخلية. ومع ذلك ، فقد تبين أن Y27632 دون المستوى الأمثل ل hiPSCs ذات الكثافة المنخفضة وقد يتسبب في إجهاد غشائي غير مرغوب فيه ، في حين أن كوكتيل CEPT (المكون من chroman 1 و emricasan و polyamines و trans-ISRIB) يمكن أن يقلل بشكل كبير من إجهاد الخلية ويحسن الجدوى خلال عملية تكوين EB هذه مع hiPSCs بكثافة أقل15.

قبل تضمين العضوية في الجل ، يتم الاحتفاظ بالعضيات في لوحة microwell ، ويجب أن يكون التغيير المتوسط لطيفا لتجنب الاضطراب المحتمل. سيكون من الأفضل استخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر لتغيير الوسط خلال الأيام الخمسة الأولى. يجب تسخين جميع الوسائط المستخدمة لتوليد العضوية الوعائية مسبقا قبل الاستخدام. خاصة بعد تضمين الهلام ، يمكن أن يؤدي استخدام الوسائط الباردة إلى تسييل مصفوفة الغشاء القاعدي جزئيا والتأثير على مكانة الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد لتشكيل شبكة الأوعية الدموية. تعد كثافة التضمين وحتى توزيع العضيات أيضا من العوامل الحاسمة لتكوين شبكة الأوعية الدموية. يمكن أن يؤدي التضمين العضوي الكثيف إلى الاندماج المفرط لشبكات الأوعية الدموية ، في حين أن كثافة التضمين المنخفضة يمكن أن تؤدي إلى عدم كفاية تكوين الشبكة. يمكن أن يؤدي بذر 60-80 عضوا لكل بئر وتحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا فور إضافتها إلى الطبقة الأولى من الجل ثلاثي الأبعاد إلى توزيع هذه العضيات بشكل أفضل.

يمكن تعديل هذا البروتوكول بشكل أكبر لتطبيقات مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق إشارات الحاجز الدموي الدماغي (BBB) لزيادة كبح الخلايا البطانية الوعائية من تكوين واجهة BBB19،20،21،22،23،24،25. يمكن تعديل تركيبة الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد أيضا. على سبيل المثال ، يشيع استخدام الفيبرين والفيترونكتين لتكوين شبكة الأوعية الدموية في المختبر25،26،27،28،29،30،31،32. يمكن استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي بدون الكولاجين I للتضمين ، مما قد يبسط عملية التضمين ويوفر محفزات ميكانيكية مختلفة.

على الرغم من أن العضيات الوعائية المتولدة من هذا البروتوكول يمكن استخدامها في نمذجة المرض أو تطبيقات فحص الأدوية ، إلا أن أحد القيود هو أن هذه العضيات تلخص فقط في الغالب الأوعية الدموية الشعرية مع عدد قليل من الأوعية الكبيرة. بالنسبة للبحث الذي يركز على الأوعية الكبيرة ، قد يتطلب توليد العضوية محفزات ميكانيكية إضافية24،31،32،33. يمكن أن يؤدي توصيل عضيات الأوعية الدموية بإعادة التدوير ، مثل الزرع للحيوانات34 أو الأجهزة الموائع الدقيقة / الكبيرة بمضخات التروية33 ، إلى معالجة هذا الأمر.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الفني من المورد المشترك للفحص المجهري المتحد البؤر والمتخصص لمركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا ، والذي تم تمويله جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة (P30CA013696). هذا العمل مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21NS133635 ، Y.-H.L. ؛ UH3TR002151 ، ك. دبليو إل.). تم إنشاء الشكل 1 أ باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)Gibco12587010thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4ProSpecCYT-081reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody abcamab28364dilution ratio: 1:400
CentrifugeEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1Tocris7163/10make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I Corning40236
Confocal MicroscopeNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlatesCorning4441
Countess II FL automated cell counterThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565018
DMEM/F-12, powderGibco12500062make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGmake the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibodyCell Singali Technology97249dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2ProSpecCYT557reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)Gibco15710064
GlutaMAX supplement (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KUreconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubatorThermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco10828028thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)Gibco11140050
Molecular Biology Grade WaterCorning46000CV
mTeSR plus kitSTEMCELL Technologies1001130thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)Gibco17502048thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)Cytiva HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713Sdilute with PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ antibodyR&DAF385dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49SUNJIN LABRC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)Gibco25080094
Sodium deoxycholate monohydrateThermofisherJ6228822dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C

References

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3d tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  7. Koike, H., et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).
  8. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  9. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).
  10. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  11. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  12. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  13. He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. Biorxiv. , (2021).
  14. He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. Biorxiv. , (2024).
  15. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  16. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
  17. Hwang, Y. -S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11. Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  18. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates. Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).
  19. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).
  20. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).
  21. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).
  22. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  23. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  24. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).
  25. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).
  26. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  27. Kim, J., et al. Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network. PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).
  28. Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. Biorxiv. , (2019).
  29. Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system. Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).
  30. Haase, K., Kamm, R. D. Advances in on-chip vascularization. Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).
  31. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).
  32. Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).
  33. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255(2019).
  34. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

214

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved