Method Article
* These authors contributed equally
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوليد العضيات الوعائية باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
تلخص العضيات الوعائية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تنوع نوع الخلايا والهندسة المعمارية المعقدة لشبكات الأوعية الدموية البشرية. يحمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة لنمذجة أمراض الأوعية الدموية وفحص الأدوية في المختبر . على الرغم من التطورات الأخيرة ، لا يزال هناك تحد تقني رئيسي يتمثل في توليد العضيات بشكل متكرر بجودة متسقة ، وهو أمر بالغ الأهمية لفحوصات وتطبيقات المصب. هنا ، يتم تقديم بروتوكول معدل يحسن كلا من تجانس وقابلية التكاثر لتوليد العضيات الوعائية. يشتمل البروتوكول المعدل على استخدام الآبار الصغيرة وكوكتيل CEPT (chroman 1 ، emricasan ، polyamines ، ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل ، عبر ISRIB) لتحسين تكوين الجسم الجنيني وبقاء الخلايا. تتميز العضيات الوعائية المتمايزة الناضجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول بفحص مجهري مناعي ثلاثي الأبعاد كامل لتحليل مورفولوجيتها والأوعية الدموية المعقدة. يتيح هذا البروتوكول إنتاج عضيات وعائية عالية الجودة بطريقة قابلة للتطوير ، مما قد يسهل استخدامها في نمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية.
ظهرت نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة في المختبر ، بما في ذلك الأنظمة العضوية والأنسجة على الرقاقة ، على مدار العقد الماضي1،2،3. تعالج هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من الخلايا البشرية القيود المفروضة على زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية ، مثل عدم وجود العديد من المكونات في البيئة المكروية الفسيولوجية والاختلافات الجينية عبر الأنواع ، على التوالي. إنها توفر المزيد من الأفكار الفسيولوجية وهي أكثر ملاءمة لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية من النماذج التقليدية. من بين النماذج الفيزيولوجية الدقيقة ، ثبت أن العضيات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تلخص السمات المعمارية للأنسجة البشرية الأصلية بشكل فعال وتم تطويرها لتقليد الأعضاء البشرية المختلفة ، بما في ذلك الدماغ4،5 ، الكلى6 ، الكبد7،8 وشبكيةالعين 9. هنا ، نركز بشكل خاص على توليد العضيات الوعائية من hiPSCs ونحدد بروتوكولا مبسطا يهدف إلى تقليل الاختلافات بين العينات العضوية المختلفة والدفعات ، وبالتالي تحسين قابلية التكاثر الإجمالية.
تلعب الأوعية الدموية دورا مهما في الحفاظ على التوازن الفسيولوجي في جميع أعضاء الإنسان. يتضمن تكوين الأوعية الدموية عمليات تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية الدموية ، والتي يتم تنظيمها من خلال التفاعلات بين الخلايا البطانية والجدارية (على سبيل المثال ، الخلايا المحيطة وخلايا العضلات الملساء الوعائية) وتتأثر بمحفزات مختلفة10. طور Penninger و Wimmer وزملاؤه أول طريقة لتوليد العضوية الوعائية11،12 التي تحاكي هاتين العمليتين. مع العضيات المتولدة من هذه الطريقة ، أثبتت مجموعتهم12 و13،14 إمكانات العضيات الوعائية لنمذجة أعطال الأوعية الدموية في الأمراض. على سبيل المثال ، في أعمالنا الأخيرة13،14 ، لوحظت أنماط ظاهرية مميزة ، مثل تنبت الأوعية الدموية واختلافات تكوين الخلايا الجدارية ، بين العضيات الوعائية التي تحاكي الأمراض ونظيراتها من النوع البري. تسلط هذه الأمثلة الضوء على أن النموذج العضوي الوعائي يمكن أن يكون بمثابة منصة لفحص الأدوية من خلال محاكاة أعطال الأوعية الدموية المرتبطة بالأمراض.
مبني على أعمال التوليد العضوي الوعائي الأولي11،12 ، تم تقديم بروتوكول منقح يتضمن استخدام الميكروويل لتسهيل تكوين الجسم الجنيني المتجانس (EB) ، وهو عامل حاسم في تقليل الاختلافات التي غالبا ما تظهر داخل نفس دفعة توليد العضوية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام كوكتيل CEPT ، وهو مزيج من chroman 1 و emricasan و polyamines ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل (trans-ISRIB) 15 ، لتحسين قابلية بقاء hiPSCs والخلايا المتمايزة أثناء عملية تكوين EB. يهدف هذا التعديل بشكل أساسي إلى تقليل الاختلافات بين العينات العضوية والدفعات المختلفة. يمكن إنتاج عضيات الأوعية الدموية الموحدة باستخدام هذا البروتوكول الذي يستمر لمدة أسبوعين تقريبا ، حيث يتم تحفيز تكوين الأوعية الدموية لمساعدة البطانة على التنظيم في شبكات أنبوبية بدائية في اليوم الأول ، متبوعا بتحريض تكوين الأوعية الدموية في اليوم 5 لتطوير شبكات الأوعية الدموية المعقدة في العضيات. في اليوم 12-15 ، يجب أن تظهر العضيات المتولدة شبكات الأوعية الدموية الناضجة المكونة من كل من الخلايا البطانة والخلايا الجدارية.
يقدم الشكل 1 نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في هذا البروتوكول. وترد معلومات مفصلة عن الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يوصى بتسخين جميع الوسائط مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع مواد ومستلزمات زراعة الخلايا إما معقمة أو معقمة ، ويجب أن تتم معالجة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعديل قيمة الأس الهيدروجيني لخليط الكولاجين I بعناية إلى درجة الحموضة 7.3 لتجنب مشكلات التصلب المحتملة.
1. صيانة iPSC البشرية
2. تشكيل EB (اليوم 0)
3. تمايز الأوعية الدموية (اليوم 1 - 5)
4. تضمين الهيدروجيل (اليوم 5)
5. 3D مقايسة الفلورسنت المناعي
يعرض الشكل 1 أ مخطط هذا البروتوكول ، بما في ذلك المكونات الرئيسية المستخدمة في كل مرحلة. بدأ التمايز بتكوين EB ، تلاه تحريض الأديم المتوسط ومواصفات النسب الوعائي (الشكل 1B-D). نمت الركام بشكل أكبر وأقل كروية بمرور الوقت. بدأت العضيات في إظهار حواف خشنة في اليوم الخامس. بعد دمجها في خليط مصفوفة غشاء الكولاجين الأول القاعدي ، نبتت الخلايا البطانية الوعائية والخلايا المحيطة وتكبرت لتشكيل شبكات الأوعية الدموية المعقدة في وقت مبكر من اليوم 7 (الشكل 1 ه). نظرا لأن الغرض الرئيسي من هذه الطريقة المعدلة هو تقليل الاختلافات بين دفعات الجيل المختلفة ، فقد قمنا بقياس حجم EB من دفعتين مستقلتين ، وأكدت كل من قياسات الحجم والتحليل الإحصائي الاتساق والتوحيد مع هذه الطريقة (الشكل 1F).
للتحقق من صحة تمايز الأوعية الدموية ، تم جمع العضيات في اليوم 5 قبل تضمينها وتلطيخها بعلامات الأوعية الدموية ، بما في ذلك CD31 و ERG1 و PDGFRβ. عبرت العضيات عن CD31 و ERG1 و PDGFRβ (الشكل 2) ، مما يشير إلى وجود الخلايا البطانية الوعائية والخلايا المحيطة.
بعد إزالة الأنسجة ، تم تحليل شبكات الأوعية الدموية باستخدام الفحص المجهري المناعي الكامل (الشكل 3 أ). تم تلطيخ العضيات الناضجة ب CD31 و ERG1 و PDGFRβ في اليوم 17 (الشكل 3 ب ، عينة في كتلة الجل) واليوم 28 (الشكل 3 ج ، تم استرداد العينة من كتلة الهلام والثقافة بشكل فردي في صفيحة مكونة من 96 بئرا ؛ لاحظ أن شبكة الأوعية الدموية عند الحواف تلف الكرويات بدلا من التمدد شعاعيا بعد استرجاعها من كتلة الهلام).
الشكل 1: توليد العضوية الوعائية. (أ) مخطط الخطوات والجدول الزمني لتوليد العضوية الوعائية. (ب - ه) صور المجال الساطع التمثيلية للعضيات الوعائية في مراحل مختلفة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. (F) التحليل الإحصائي في حجم EB من دفعتين مختلفتين من جيل EB باستخدام طريقة microwell المعروضة في هذا العمل. بالنسبة لتوليد EB ، تم استخدام 1,000 خلية لكل ميكروبئر ، وبالنسبة للدفعتين 1 و 2 ، n = 42 و n = 40 ، على التوالي. يتم تقديم الأهمية على أنها ns ، وليست مهمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التلوين المناعي للعضيات الوعائية قبل تضمين الجل. صور فلورية تمثيلية للعضيات الملطخة بعلامات البطانية (أ) CD31 (أخضر) و (ب) ERG1 (أخضر) وكذلك (ج) علامة السعيج ، PDGFRβ (أخضر) ، على التوالي. تم تلطيخ النوى ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: توصيفات الفلورسنت المناعي لشبكة الأوعية الدموية في العضيات الوعائية. (أ) تظهر صورة تمثيلية عضيات الأوعية الدموية المضمنة في الهلام في الطبق الزجاجي بعد إزالة الأنسجة. كانت العضيات شفافة ولكنها مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 385 نانومتر. (ب) صورة تمثيلية ثلاثية الأبعاد كاملة للعضيات الوعائية في اليوم 17. تم تلطيخ العضوية الوعائية ب DAPI (أزرق) ، وعلامة الخلايا البطانية الوعائية ، CD31 (أخضر) وعلامة السعيج ، PDGFRβ (أرجواني). (ج) تصوير ثلاثي الأبعاد تمثيلي كامل التركيب لعضوية وعائية تم استردادها في اليوم 28 ، ملطخة بعلامات البطانية CD31 (أحمر) و ERG1 (أخضر). أشرطة المقياس: 150 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
وسيط توسيع hiPSC | 500 مل |
mTeSR Plus الوسط القاعدي | 400 مل |
مكمل mTeSR Plus | 100 مل |
جنتاميسين (50 مجم / مل) | 1 مل |
الجدول 1: تكوين وسط تمدد hiPSC.
وسط البذر hiPSC | 20 مل |
وسيط توسعة PSC | 20 مل |
كرومان 1 (100 ميكرومتر) | 10 ميكرولتر |
Emricasan (1 ملم) | 30 ميكرولتر |
مكمل بولي أمين (1000x) | 20 ميكرولتر |
عبر ISRIB (1 ملليمتر) | 14 ميكرولتر |
الجدول 2: تكوين وسط البذر hiPSC.
N2B27 متوسط | 100 مل |
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAX | 48.6 مل |
وسط NeuroBasal | 48.6 مل |
مكمل GlutaMAX (100x) | 0.5 مل |
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (NEAA ، 100x) | 0.5 مل |
2-ميركابتو إيثانول (1000x) | 0.1 مل |
جنتاميسين (50 مجم / مل) | 0.1 مل |
ملحق N2 (100x) | 0.5 مل |
مكمل فيتامين ب 27 مطروحا منه فيتامين أ (50 ضعفا) | 1 مل |
الهيبارين ، 4 كيلو واط / مل | 0.1 مل |
الجدول 3: تكوين وسط N2B27.
وسط تحريض الأديم المتوسط (MIM) | 3 مل |
N2B27 متوسط | 3 مل |
BMP4 (100 نانوغرام/ميكرولتر) | 0.9 ميكرولتر |
CHIR99021 (12 مل) | 3 ميكرولتر |
الجدول 4: تكوين وسط تحريض الأديم المتوسط (MIM).
وسط تمايز الأوعية الدموية 1 (VDM1) | 3 مل |
N2B27 متوسط | 3 مل |
فورسكلين (12 مل) | 0.5 ميكرولتر |
VEGFA (100 نانوغرام / ميكرولتر) | 3 ميكرولتر |
الجدول 5: تكوين وسط تمايز الأوعية الدموية 1 (VDM1).
خليط الكولاجين الأول | 5 مل |
الكولاجين الأول (3.61 جم / مل) | 2.77 مل |
10x DMEM / F12 متوسط | 0.5 مل |
بيكربونات الصوديوم ، 7.5٪ | 0.5 مل |
هيبس ، 1 م | 0.5 مل |
H2O | 0.73 مل |
هيدروكسيد الصوديوم ، 1 م | 75 ميكرولتر |
الجدول 6: تكوين خليط الكولاجين الأول.
الكولاجين الأول - خليط مصفوفة الغشاء القاعدي | 6.5 مل |
خليط الكولاج الأول | 5 مل |
ماتريجيل (10 مجم / مل) | 1.5 مل |
الجدول 7: تكوين خليط مصفوفة غشاء الكولاجين I-القاعدية.
وسط تمايز الأوعية الدموية 2 (VDM2) | 5 مل |
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAX™ | 3.67 مل |
جنتاميسين (50 مجم / مل) | 5 ميكرولتر |
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (NEAA ، 100X) | 50 ميكرولتر |
2-ميركابتو إيثانول (1000x) | 5 ميكرولتر |
الهيبارين ، 4 كيلو واط / مل | 5 ميكرولتر |
استبدال مصل خروج المغلوب | 0.75 مل |
FBS | 0.5 مل |
VEGFA (100 نانوغرام / ميكرولتر) | 5 ميكرولتر |
FGF2 (100 نانوغرام/ميكرولتر) | 5 ميكرولتر |
الجدول 8: تكوين وسط تمايز الأوعية الدموية 2 (VDM2).
المخزن المؤقت للحجب | 50 مل |
مصل الحمار | 2.5 مل |
توين 20 | 0.25 مل |
تريتون X-100 | 0.25 مل |
محلول ديوكسي كولات الصوديوم (1٪ ، الوزن / الحجم) | 0.5 مل |
برنامج تلفزيوني | 46.5 مل |
الجدول 9: تكوين المخزن المؤقت للانسداد للتلوين المناعي.
يتضمن البروتوكول الموصوف تعديلين رئيسيين للتوليد المتجانس والقابل للتكرار من العضيات الوعائية عالية الجودة. التعديل الأول هو استخدام لوحة microwell لتمكين التحكم بشكل أفضل في توحيد EB. كنقطة انطلاق لتمايز الأوعية الدموية ، يعد حجم EBs أمرا بالغ الأهمية لأنه ينظم مصير الخلايا الجذعية وفعالية التمايز تجاه سلالات مختلفة. عادة ما تؤدي الاختلافات في حجم EB إلى عضيات غير متجانسة ذات بنية وتنظيم غير متسقين16،17. طريقة توليد EB التقليدية عن طريق رفع مستعمرات hiPSC11،12 تجعل من الصعب التحكم في أعداد الخلايا للطوابع الكهربية الفردية وعادة ما تؤدي إلى تكوين EB غير متجانس. في هذا البروتوكول ، يتم فصل hiPSCs إلى معلق أحادي الخلية وإعادة تجميعها في الآبار الصغيرة16،18. من خلال ضبط أعداد خلايا البذر ، يمكن تحسين حجم EBs لضمان تمايز الأديم المتوسط بشكل متسق وفعال. بالنسبة لتلقيح الآبار الصغيرة ، يتم استخدام 500-1,000 خلية ، وهذا يمكن أن ينتج عنه EBs صغيرة نسبيا (بقطر 100-200 ميكرومتر). يمكن أن تولد هذه الطريقة بشكل متكرر EBs موحدة بالأحجام المطلوبة من دفعة إلى أخرى (الشكل 1F) وبين خطوط الخلاياالمختلفة 13. منذ اليوم 0 ، تغيرت مورفولوجيا EB بمرور الوقت أثناء التمايز: يصبح الشكل أقل كروية ، ويصبح السطح أكثر خشونة (الشكل 1) ، لكن الحجم لا يزداد بشكل كبير. يعتمد مورفولوجيا الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد على كثافة التضمين وأحجام العضيات المضمنة. عادة ما تؤدي العضيات الكبيرة جدا (>500 ميكرومتر) إلى عدم كفاية تمايز الخلايا الوعائية ، بينما تميل العضيات الصغيرة جدا إلى أن يكون لها الأوعية الدموية المتخلفة.
التعديل الثاني هو دمج كوكتيل CEPT لتحسين جدوى hiPSC أثناء تكوين EB. تعد صلاحية الخلية أمرا بالغ الأهمية بالإضافة إلى جودة مستعمرات hiPSC خلال هذه العملية. عندما يتم فصل hiPSCs في معلق أحادي الخلية ، عادة ما يتم إضافة مثبط ROCK Y27632 لتحسين صلاحية الخلية. ومع ذلك ، فقد تبين أن Y27632 دون المستوى الأمثل ل hiPSCs ذات الكثافة المنخفضة وقد يتسبب في إجهاد غشائي غير مرغوب فيه ، في حين أن كوكتيل CEPT (المكون من chroman 1 و emricasan و polyamines و trans-ISRIB) يمكن أن يقلل بشكل كبير من إجهاد الخلية ويحسن الجدوى خلال عملية تكوين EB هذه مع hiPSCs بكثافة أقل15.
قبل تضمين العضوية في الجل ، يتم الاحتفاظ بالعضيات في لوحة microwell ، ويجب أن يكون التغيير المتوسط لطيفا لتجنب الاضطراب المحتمل. سيكون من الأفضل استخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر لتغيير الوسط خلال الأيام الخمسة الأولى. يجب تسخين جميع الوسائط المستخدمة لتوليد العضوية الوعائية مسبقا قبل الاستخدام. خاصة بعد تضمين الهلام ، يمكن أن يؤدي استخدام الوسائط الباردة إلى تسييل مصفوفة الغشاء القاعدي جزئيا والتأثير على مكانة الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد لتشكيل شبكة الأوعية الدموية. تعد كثافة التضمين وحتى توزيع العضيات أيضا من العوامل الحاسمة لتكوين شبكة الأوعية الدموية. يمكن أن يؤدي التضمين العضوي الكثيف إلى الاندماج المفرط لشبكات الأوعية الدموية ، في حين أن كثافة التضمين المنخفضة يمكن أن تؤدي إلى عدم كفاية تكوين الشبكة. يمكن أن يؤدي بذر 60-80 عضوا لكل بئر وتحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا فور إضافتها إلى الطبقة الأولى من الجل ثلاثي الأبعاد إلى توزيع هذه العضيات بشكل أفضل.
يمكن تعديل هذا البروتوكول بشكل أكبر لتطبيقات مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق إشارات الحاجز الدموي الدماغي (BBB) لزيادة كبح الخلايا البطانية الوعائية من تكوين واجهة BBB19،20،21،22،23،24،25. يمكن تعديل تركيبة الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد أيضا. على سبيل المثال ، يشيع استخدام الفيبرين والفيترونكتين لتكوين شبكة الأوعية الدموية في المختبر25،26،27،28،29،30،31،32. يمكن استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي بدون الكولاجين I للتضمين ، مما قد يبسط عملية التضمين ويوفر محفزات ميكانيكية مختلفة.
على الرغم من أن العضيات الوعائية المتولدة من هذا البروتوكول يمكن استخدامها في نمذجة المرض أو تطبيقات فحص الأدوية ، إلا أن أحد القيود هو أن هذه العضيات تلخص فقط في الغالب الأوعية الدموية الشعرية مع عدد قليل من الأوعية الكبيرة. بالنسبة للبحث الذي يركز على الأوعية الكبيرة ، قد يتطلب توليد العضوية محفزات ميكانيكية إضافية24،31،32،33. يمكن أن يؤدي توصيل عضيات الأوعية الدموية بإعادة التدوير ، مثل الزرع للحيوانات34 أو الأجهزة الموائع الدقيقة / الكبيرة بمضخات التروية33 ، إلى معالجة هذا الأمر.
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
نود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الفني من المورد المشترك للفحص المجهري المتحد البؤر والمتخصص لمركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا ، والذي تم تمويله جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة (P30CA013696). هذا العمل مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21NS133635 ، Y.-H.L. ؛ UH3TR002151 ، ك. دبليو إل.). تم إنشاء الشكل 1 أ باستخدام BioRender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
B27 supplement minus vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle |
BMP4 | ProSpec | CYT-081 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
CD31 antibody | abcam | ab28364 | dilution ratio: 1:400 |
Centrifuge | Eppendorf | 022626001 | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Collagen I | Corning | 40236 | |
Confocal Microscope | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
Corning Elplasia Plates | Corning | 4441 | |
Countess II FL automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | |
DMEM/F-12, powder | Gibco | 12500062 | make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C. |
Edi042A | Cedars Sinai | ||
Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
ERG antibody | Cell Singali Technology | 97249 | dilution ratio: 1:400 |
Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | thaw at 4 °C and aliquot, store at -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month |
FGF2 | ProSpec | CYT557 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
Fluorodish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15710064 | |
GlutaMAX supplement (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heparin, 100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Incubator | Thermo Scientific | 13998123 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828028 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) | Gibco | 11140050 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | |
mTeSR plus kit | STEMCELL Technologies | 1001130 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
N2 supplement (100x) | Gibco | 17502048 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
NaOH solution (1 M) | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
NeuroBasal medium | Gibco | 21103049 | |
NIS-Elements, ver 5.42 | Nikon | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks |
paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713S | dilute with PBS |
PBST, 20x | Thermofisher | 28352 | |
PDGFRβ antibody | R&D | AF385 | dilution ratio: 1:400 |
polyamine supplement (1000x) | Sigma-Aldrich | P8483 | |
Rapiclear clearing reagent, 1.49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080094 | |
Sodium deoxycholate monohydrate | Thermofisher | J6228822 | dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution |
TBST, 20x | Thermofisher | 28360 | |
trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year. |
Tritin X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved