יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

אורגנואידים וסקולריים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) משחזרים את מגוון סוגי התאים ואת הארכיטקטורה המורכבת של רשתות כלי הדם האנושיות. מודל תלת-ממדי (תלת-ממדי) זה טומן בחובו פוטנציאל משמעותי למידול פתולוגיה וסקולרית ולבדיקת תרופות חוץ גופיות . למרות ההתקדמות האחרונה, אתגר טכני מרכזי נותר בייצור אורגנואידים באיכות עקבית, שהיא חיונית עבור בדיקות ויישומים במורד הזרם. כאן מוצג פרוטוקול שונה המשפר הן את ההומוגניות והן את יכולת השחזור של יצירת אורגנואידים וסקולריים. הפרוטוקול המתוקן משלב שימוש במיקרו-בארות ובקוקטייל CEPT (כרומן 1, אמריקסן, פוליאמינים ומעכב תגובת הדחק המשולב, טרנס-ISRIB) לשיפור היווצרות הגוף העוברי והישרדות התא. אורגנואידים מובחנים ובוגרים של כלי דם שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מאופיינים במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי תלת-ממדי שלם כדי לנתח את המורפולוגיה וכלי הדם המורכבים שלהם. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אורגנואידים וסקולריים באיכות גבוהה באופן מדרגי, מה שעשוי להקל על השימוש בהם במידול מחלות וביישומי סינון תרופות.

מודלים מיקרופיזיולוגיים במבחנה, כולל מערכות אורגנואיד ורקמות על שבב, התפתחו בעשור האחרון ^1,2,3. מערכות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) אלה שמקורן בתאים אנושיים נותנות מענה למגבלות בתרביות תאים דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות ובמודלים של בעלי חיים, כגון היעדר רכיבים רבים במיקרו-סביבה הפיזיולוגית והבדלים גנטיים בין מינים, בהתאמה. הם מספקים תובנות פיזיולוגיות רבות יותר ומתאימים יותר למידול מחלות ולבדיקת תרופות מאשר מודלים קונבנציונליים. בין המודלים המיקרופיזיולוגיים, אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) הוכחו כמשחזרים את התכונות האדריכליות של רקמות אנושיות מקומיות ביעילות ופותחו כדי לחקות איברים אנושיים שונים, כולל המוח ^4,5, הכליה⁶, הכבד ^7,8 והרשתית⁹. כאן, אנו מתמקדים במיוחד ביצירת אורגנואידים וסקולריים מ- hiPSCs ומתווים פרוטוקול יעיל שמטרתו למזער את השונות בין דגימות אורגנואידים ואצוות שונות, ובכך לשפר את יכולת השחזור הכוללת.

כלי הדם ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי בכל האיברים האנושיים. היווצרות כלי הדם כרוכה בתהליכים של וסקולוגנזה ואנגיוגנזה, המתוזמרים באמצעות יחסי הגומלין בין תאי אנדותל וציור קיר (למשל, פריציטים ותאי שריר חלק של כלי הדם) ומושפעים מגירויים שונים¹⁰. פנינגר, וימר ועמיתיו פיתחו את השיטה הראשונה לייצור אורגנואידים וסקולריים^11,12 המחקה את שני התהליכים הללו. בעזרת האורגנואידים שנוצרו משיטה זו, הקבוצה שלהם^{12 ו-13,14} הדגימו את הפוטנציאל של אורגנואידים וסקולריים למידול תקלות בכלי הדם במחלות. לדוגמה, בעבודות האחרונות שלנו^13,14, נצפו פנוטיפים שונים, כגון הנבטת כלי דם ושינויים בהרכב תאי קיר, בין אורגנואידים כלי דם המחקים מחלות לבין עמיתיהם מסוג פרא. דוגמאות אלה מדגישות כי מודל אורגנואיד כלי הדם יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת תרופות על ידי חיקוי תקלות כלי דם הקשורות למחלה.

בהתבסס על עבודות הדור הראשוניות של אורגנואידים וסקולריים^11,12, מוצג פרוטוקול מתוקן הכולל את השימוש במיקרווול כדי להקל על היווצרות גוף עוברי הומוגני (EB), גורם קריטי במזעור הווריאציות הנראות לעתים קרובות באותה אצווה של ייצור אורגנואידים. בנוסף, קוקטייל CEPT, שילוב של כרומן 1, אמריקסן, פוליאמינים ומעכב תגובת הלחץ המשולב (trans-ISRIB)¹⁵, משמש לשיפור הכדאיות של hiPSCs ותאים ממוינים במהלך תהליך היווצרות EB. שינוי זה נועד בעיקר להפחית את השונות בין דגימות אורגנואידים שונות ואצוות. אורגנואידים וסקולריים אחידים יכולים להיות מיוצרים עם פרוטוקול זה שנמשך כשבועיים, שבו מושרה וסקולוגנזה כדי לעזור לאנדותל להתארגן לרשתות צינוריות פרימיטיביות ביום 1, ואחריו השראת אנגיוגנזה ביום 5 כדי לפתח רשתות כלי דם מורכבות באורגנואידים. ביום 12-15, האורגנואידים שנוצרו צריכים להראות רשתות כלי דם בוגרות המורכבות הן מתאי אנדותל והן מתאי קיר.

איור 1 מציג סקירה כללית של השלבים המעורבים בפרוטוקול זה. מידע מפורט לגבי ריאגנטים וחומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן בטבלת החומרים. מומלץ לחמם מראש את כל חומרי ההדפסה בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת. כל החומרים והאספקה של תרביות התאים צריכים להיות אוטוקלאביים או סטריליים, והטיפול בתאים צריך להיעשות בארון בטיחות ביולוגית. נוסף על כך, יש להתאים בזהירות את ערך ה-pH של תערובת קולגן I ל-pH 7.3 כדי למנוע בעיות התמצקות אפשריות.

1. תחזוקת iPSC אנושית

1. הפשירו את תמצית מטריצת קרום המרתף על קרח, נערו בעדינות את הבקבוק כדי לערבב את התמיסה, והכינו אליציטוטים של 0.5 מ"ל בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה P1000 וקצוות טרום קירור. אחסן את aliquots ב -20 ° C למשך עד 1 שנה.
2. הפשירו אליקוט אחד של תמצית מטריצה (0.5 מ"ל) על קרח. יש לערבב עם 49.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12 מקורר מראש בצינור של 50 מ"ל. מפזרים את התערובת לכל באר (1.5 מ"ל/באר) בצלחות בנות 6 בארות ולאחר מכן מנערים בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שתמיסת הנוזלים מכסה את כל הבאר. אטמו את הצלחות בסרט פרפין ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
3. הכן את אמצעי ההתרחבות hiPSC כמתואר בטבלה 1. הפוך aliquots של המדיום המלא (40 מ"ל / צינור) ולאחסן ב -20 ° C עד 1 שנה.
4. שים צלחת מצופה מראש באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני תרבית hiPSC.
5. חממו מראש את מדיום ההתפשטות hiPSC (40 מ"ל) ב-37°C והכינו את מצע הזריעה hiPSC כמתואר בטבלה 2.
6. מעבירים את הצלחת המצופה מאינקובטור 37°C לארון הבטיחות הביולוגית. החלף את המדיום בצלחת המצופה במדיום זריעה hiPSC (1 מ"ל/באר).
7. הפשירו בקבוקון שמור בהקפאה של hiPSCs מההקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
8. העבר את התאים לצינור של 15 מ"ל ולאחר מכן הוסף 5 מ"ל של תווך DMEM/F12, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 100 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התאים.
9. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים עם 1.5 מ"ל של מדיום הזריעה hiPSC. בעדינות resuspend תאים בצינור 15 מ"ל.
10. Aliquot 10 μL של השעיית התא ומערבבים עם 10 μL של תמיסת טריפאן כחולה. מעבירים תערובת של 10 μL לשקופית ההמציטומטר ומכסים אותה בכיסוי.
11. הרכיבו את השקופית על המחזיק והכניסו אותה למונה התאים האוטומטי. המתן עד שהמכשיר ימצא את המיקוד או כוונן את המיקוד באופן ידני על-ידי לחיצה על לחצן המיקוד +/- על המסך. לאחר מכן, השתמש בהגדרת ברירת המחדל ולחץ על לכידת לחצן. השתמש בקריאת צפיפות התא LIVE כריכוז של מתלה hiPSC שהוכן משלב 1.9.
12. זרע 2 × 10⁵ תאים בכל באר ולוודא כי התאים מופצים באופן שווה בבאר.
13. תרבית את התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולהחליף את המדיום עם תווך התפשטות hiPSC (1.5 מ"ל / באר) לאחר 24 שעות.
14. שנה את המדיום מדי יום עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%. בדוק את המורפולוגיה של התא ואת גודל המושבה באופן שגרתי כדי לוודא שאין התמיינות ספונטנית. השליכו את התרבית והפעילו מחדש עם קבוצה חדשה של hiPSCs אם נצפתה הבחנה ספונטנית נרחבת (>5%).

2. היווצרות EB (יום 0)

1. ביום 0, הכינו וחממו מראש את תמיסת הזריעה הבינונית DMEM/F12 מסוג DMEM/F12 ואת תמיסת ניתוק התאים ב-37°C למשך 20-30 דקות.
2. מוציאים את מדיום התרבית מצלחת 6 הקידוחים ומוסיפים תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש (1.5 מ"ל/באר). לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 5-7 דקות.
3. מעבירים את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית, מקישים על הצלחת כדי לנתק מושבות hiPSC ומפרקים את האגרגטים.
4. העבר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל. הוסף 4.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12. מזלפים בעדינות את התערובת למעלה ולמטה באמצעות צינור סרולוגי של 10 מ"ל חמש פעמים כדי לנתק תאים לתרחיף חד-תאי. הימנעו מיצירת בועות.
5. צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התאים.
6. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את התאים עם 1 מ"ל של מדיום זריעה hiPSC באמצעות פיפטה P1000.
7. ערבבו 10 μL של תרחיף תאים עם 10 μL של תמיסה כחולה טריפאן לספירת תאים. מעבירים 10 μL מהתערובת לשקופית ההמציטומטר ומכסים אותה בכיסוי. הרכיבו את השקופית על המחזיק והכניסו אותה למונה התאים האוטומטי. לאחר שהמכשיר מוצא את המיקוד, לחץ על לחצן לכידה והשתמש בקריאת צפיפות התאים LIVE כדי לקבוע את ריכוז מתלה hiPSC.
8. זרעו את התאים בצלחת המיקרווול התחתונה העגולה בעלת החיבור הנמוך במיוחד עם צפיפות של 2.7 × 10⁵ תאים / באר כדי להניב 500-1,000 תאים לכל EB.
9. הוסף 2 מ"ל של מדיום זריעה hiPSC לכל באר וערבב את התמיסה בעדינות כדי לפזר תאים באופן שווה.
10. תרבית את התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 24 שעות.

3. הבחנה וסקולרית (יום 1 - 5)

1. ביום הראשון, הכינו את מדיום השראת המזודרם (MIM) כמתואר בטבלה 3 ובטבלה 4 וחממו אותו מראש בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. המדיום MIM חייב להיעשות טרי.
2. השתמש פיפטה P200 כדי לשאוף בזהירות את התווך מצלחת microwell מבלי להפריע EBs בתחתית.
3. הוסף 2.5 מ"ל של MIM באיטיות באמצעות פיפטה P200. תרבית את EBs ב MIM ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 2 ימים.
4. ביום 3, החליפו בעדינות את המדיום ב-2.5 מ"ל מחומם מראש של מדיום התמיינות כלי הדם 1 (VDM1, טבלה 5) מבלי להפריע ל-EBs בתחתית המיקרו-באר. תרבית את התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 2 ימים נוספים.

4. הטבעה הידרוג'ל (יום 5)

1. הכינו את תערובת הקולגן I כמתואר בטבלה 6. מניחים צינור 50 מ"ל על קרח ומוסיפים תמיסת קולגן I, H₂O, 10× DMEM/F12 בינוני, סודיום ביקרבונט ו- HEPES לאחר מכן. מערבבים היטב על ידי ניעור עדין של הצינור. הוסף תמיסת NaOH 1 M טיפה תוך כדי ניעור התמיסה המעורבת כדי להתאים את ערך ה- pH ל- 7.3 ובדוק את ערך ה- pH של התערובת עם מד pH.
   הערה: יש לקרר מראש את כל התמיסות על קרח לפני השימוש. בצע את ההליך על קרח בארון הבטיחות הביולוגית כל הזמן. הוספת תמיסת NaOH היא קריטית, ויש צורך בפיזור מהיר כדי ליצור תמיסה הומוגנית כדי למנוע ריפוי מקומי של קולגן I. נפח NaOH עשוי להשתנות בהתאם למספר הרב של תמיסת הקולגן I שבה השתמשתי. אין לזלף במרץ לערבוב, מכיוון שלחץ גזירה עלול לגרום לריפוי מקדים לא רצוי.
2. הכינו את תערובת מטריצת קרום הקולגן I-basement כמתואר בטבלה 7. הוסף 1.25 מ"ל של מטריצת קרום מרתף לתערובת 5 מ"ל קולגן I שהוכנה משלב 4.1. מערבבים את התמיסה בעדינות על ידי ניעור הצינור.
3. מניחים צלחת של 12 בארות על קרח למשך 2 דקות.
4. הוסיפו באיטיות את תערובת מטריצת הממברנה I-basement של קולגן לצלחת בעלת 12 הקידוחים (1.5 מ"ל/באר) בעזרת הקצוות הרחבים. ודאו שהתערובת מפוזרת באופן שווה.
5. שים את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות כדי למצק את השכבה הראשונה של הידרוג'ל.
6. יש לשמור את שארית תערובת מטריצת ממברנות הקולגן I-basement על קרח לשימוש מאוחר יותר.
7. העבר ~ 60 צברי תאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ומקרר את הצינור על קרח במשך 5 דקות. הסר בזהירות את המדיום עם קצה פיפטה P200.
   הערה: התחל שלב זה 1.5 שעות לאחר שלב 4.5.
8. טיפתית, הוסיפו 1.5 מ"ל של תערובת קרום קולגן I-מרתף לאגרגטים וערבבו אותם בעדינות באמצעות קצוות פיפטה P200 רחבים.
9. מעבירים את הצלחת עם שכבת ההידרוג'ל הראשונה מהאינקובטור (שלב 4.5) לארון הבטיחות הביולוגית.
10. הוסף 1.5 מ"ל של המתלה המצטבר על השכבה נרפא. נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את האגרגטים באופן שווה. הימנעו מיצירת בועות.
11. לדגור את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 2 שעות נוספות.
12. הכן את מדיום התמיינות כלי הדם 2 (VDM2; טבלה 8) וחממו מראש את המדיום באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות לפני השימוש.
13. הוסף 2 מ"ל VDM2 לכל באר ותגדל את התאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
14. החליפו את המדיום כל 3 ימים עם VDM2 שחומם מראש.
    הערה: (אופציונלי) אורגנואידים וסקולריים יכולים להשתחרר מתערובת הג'ל על ידי הסרת הג'ל עם מחט מזרק. אורגנואידים וסקולריים שנלקחו מהג'ל יכולים להישמר בנפרד בצלחת 96 בארות עם VDM2 (200 μL / well). שנה את המדיום כל 2-3 ימים.

5. 3D בדיקת Immunofluorescent

1. אורגנואידים וסקולריים אמורים להתבגר בערך ביום ה-13. עבור אורגנואידים המוטבעים בהידרוג'ל, שאפו את המדיום בזהירות ושטפו עם PBS של 2 מ"ל שלוש פעמים (10 דקות בכל פעם). עבור אורגנואידים שנלקחו מהג'ל (לאחר שלב 4.14), אספו 6-10 אורגנואידים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, שאפו את המדיה ושטפו עם PBS של 2 מ"ל שלוש פעמים (10 דקות כל אחת).
2. יש להוסיף 2 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לדגימה ולדגור ב-4°C למשך הלילה עם איטום סרט פרפין.
3. הסר את תמיסת ה- PFA ושטוף את הדגימה עם PBS של 2 מ"ל ארבע פעמים (15 דקות בכל פעם).
4. מוסיפים 2 מ"ל של חיץ חוסם (טבלה 9) ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
5. הסר את המאגר החוסם והוסף 1.5 מ"ל של נוגדנים ראשוניים (ראה טבלת חומרים למידע על נוגדנים; יש לדלל נוגדנים במאגר החוסמים). לדגור את הדגימה עם נוגדנים ראשוניים ב 4 ° C במשך 2 ימים עם רעד עדין.
   הערה: מומלץ לדלל את הנוגדן הראשוני (CD31, PDGFRβ ו-ERG1) במאגר החוסם ביחס של 1:400 (ראה טבלת חומרים למידע נוסף).
6. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף עם 2 מ"ל PBST במשך שעה אחת שש פעמים.
7. הוסף 2 מ"ל של נוגדנים משניים (ראה טבלת חומרים למידע על הנוגדנים; נוגדנים צריכים להיות מדוללים ב- PBST) לדגימה. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בחום של 4°C למשך יומיים עם ניעור עדין.
   הערה: מומלץ לדלל את הנוגדן המשני ב-PBST ביחס של 1:1000 (ראה טבלת חומרים למידע נוסף). יש להרחיק את הצלחת מהאור במהלך הדגירה ולשטוף משלב זה ואילך.
8. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטוף עם 2 מ"ל TBST שש פעמים (1 שעה בכל פעם). הוסף DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) למאגר הכביסה המשמש לשלב השטיפה האחרון אם יש צורך בצביעת גרעינים.
9. עבור אורגנואידים אלה משובצים ג'ל, לחתוך את הג'ל לתוך 4 חתיכות ולהעביר אותם בזהירות 2 מ"ל צינורות microcentrifuge עם מרית. עבור האורגנואידים שאוחזרו, הסירו את מאגר הכביסה.
10. השתמשו במגבונים כדי לספוג את התמיסה הנותרת מבלי לגעת בג'ל או באורגנואידים.
11. הוסף 2 מ"ל של מגיב ניקוי רקמות מסיס במים (מדד השבירה = 1.49) לכל צינור. דגרו על הדגימות עם מגיב ניקוי בטמפרטורת החדר בחושך עד שהאורגנואידים מתבהרים (בדרך כלל במהלך הלילה). אין לנער את הדגימות.
12. מעבירים בזהירות את האורגנואידים עם מגיב הניקוי למרכז צלחת תחתית הזכוכית באמצעות מרית.
13. מכסים את האורגנואידים או חתיכת הג'ל בכיסוי 24 מ"מ × 24 מ"מ.
14. דוחפים את הכיסוי כלפי מטה בעדינות עד שהוא מונח שטוח, וסנדוויץ' את הדגימות עם תחתית הזכוכית.
15. הסירו את מגיב הניקוי המיותר בצלחת ואטמו את הכיסוי בלק.
16. עבור הדמיה תלת ממדית, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של 10×. השתמש בסריקת אריחים ובסריקת מחסנית Z כדי לקבל תמונות הרכבה שלמות של אורגנואידים.

איור 1A מציג את התוכנית של פרוטוקול זה, כולל מרכיבי המפתח שבהם נעשה שימוש בכל שלב. ההבחנה החלה עם היווצרות EB, ואחריה אינדוקציה מזודרם ומפרט שושלת כלי דם (איור 1B-D). האגרגטים גדלו והפכו פחות כדוריים עם הזמן. אורגנואידים החלו להראות קצוות מחוספסים ביום 5. לאחר שהוטמעו בתערובת מטריצת קרום הקולגן I-basement, תאי אנדותל של כלי דם ופריציטים נבטו ויצאו החוצה ליצירת רשתות כלי דם מורכבות כבר ביום השביעי (איור 1E). מאחר שהמטרה העיקרית של שיטה מותאמת זו היא למזער את השונות בין אצוות דור שונות, מדדנו את גודל EB משתי אצוות בלתי תלויות, וגם מדידות הגודל וגם הניתוח הסטטיסטי אישרו את העקביות והאחידות בשיטה זו (איור 1F).

כדי לאמת את התמיינות כלי הדם, אורגנואידים נאספו ביום 5 לפני הטבעה ומוכתמים בסמנים וסקולריים, כולל CD31, ERG1 ו- PDGFRβ. האורגנואידים ביטאו CD31, ERG1 ו-PDGFRβ (איור 2), מה שמצביע על נוכחות של תאי אנדותל וסקולריים ופריציטים.

לאחר ניקוי הרקמות, רשתות כלי הדם נותחו במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בהרכבה שלמה (איור 3A). אורגנואידים בוגרים הוכתמו ב-CD31, ERG1 ו-PDGFRβ ביום ה-17 (איור 3B, דגימה בבלוק הג'ל) וביום ה-28 (איור 3C, הדגימה נלקחה מבלוק הג'ל והתרבית בנפרד בצלחת של 96 בארות; שימו לב שרשת כלי הדם בקצוות עטפה את הספרואידים במקום להתרחב רדיאלית לאחר שנלקחה מבלוק הג'ל).

איור 1: יצירת אורגנואידים וסקולריים. (A) סכימת השלבים וציר הזמן ליצירת אורגנואידים וסקולריים. (ב-ה) תמונות שדה בהירות מייצגות של אורגנואידים וסקולריים בשלבים שונים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (F) ניתוח סטטיסטי בגודל EB משתי אצוות שונות מדור EB בשיטת microwell המוצגת בעבודה זו. עבור יצירת EB, 1,000 תאים לכל מיקרו-באר שימשו, ועבור אצוות 1 ו -2, n = 42 ו- n = 40, בהתאמה. המשמעות מוצגת כ-ns, לא משמעותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צביעה חיסונית של אורגנואידים וסקולריים לפני הטבעה בג'ל. תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של אורגנואידים מוכתמים בסמני האנדותל (A) CD31 (ירוק) ו-(B) ERG1 (ירוק), כמו גם (C) סמן הפריציטים, PDGFRβ (ירוק), בהתאמה. גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אפיונים אימונופלואורסצנטיים של רשת כלי הדם באורגנואידים של כלי הדם. (A) תמונה מייצגת מראה אורגנואידים וסקולריים משובצים בג'ל בכלי הזכוכית לאחר ניקוי הרקמות. האורגנואידים היו שקופים אך נראו תחת אור UV של 385 ננומטר. (B) תמונה תלת-ממדית מייצגת של אורגנואיד כלי דם ביום ה-17. אורגנואיד כלי הדם הוכתם ב- DAPI (כחול), סמן תאי אנדותל כלי הדם, CD31 (ירוק) וסמן הפריציטים, PDGFRβ (מגנטה). (C) הדמיה תלת-ממדית מייצגת של אורגנואיד כלי דם שנלקח ביום ה-28, מוכתמת בסמני האנדותל CD31 (אדום) ו-ERG1 (ירוק). פסי קנה מידה: 150 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב מדיום הרחבת hiPSC.

טבלה 2: הרכב מדיום הזריעה hiPSC.

טבלה 3: הרכב מדיום N2B27.

טבלה 4: הרכב מדיום אינדוקציה מזודרם (MIM).

טבלה 5: הרכב מדיום התמיינות כלי דם 1 (VDM1).

טבלה 6: הרכב תערובת קולגן I.

טבלה 7: הרכב תערובת מטריצת קרום קולגן I-מרתף.

טבלה 8: הרכב מדיום התמיינות כלי דם 2 (VDM2).

טבלה 9: הרכב חיץ חוסם לצביעת חיסון.

הפרוטוקול המתואר כולל שני שינויים מרכזיים לייצור הומוגני וניתן לשחזור של אורגנואידים וסקולריים באיכות גבוהה. השינוי הראשון הוא השימוש בצלחת מיקרווול כדי לאפשר שליטה טובה יותר באחידות EB. כנקודת מוצא של התמיינות כלי דם, גודל EBs הוא קריטי מכיוון שהוא מווסת את גורל תאי הגזע ואת יעילות ההתמיינות כלפי שושלות שונות. שינויים בגודל EB מובילים בדרך כלל לאורגנואידים הטרוגניים עם מבנה וארגון לא עקביים^16,17. שיטת ייצור EB קונבנציונלית על ידי הרמת מושבות hiPSC^11,12 מקשה על שליטה במספר התאים עבור EBs בודדים ובדרך כלל גורמת להיווצרות EB הטרוגנית. בפרוטוקול זה, hiPSCs מנותקים לתרחיף חד-תאי ונצברים מחדש במיקרו-בארות^16,18. על ידי התאמת מספרי תאי הזריעה, ניתן למטב את גודל EBs כדי להבטיח התמיינות מזודרמלית עקבית ויעילה. עבור זריעת microwell, 500-1,000 תאים משמשים, וזה יכול להניב EBs קטנים יחסית (עם קוטר של 100-200 מיקרומטר). שיטה זו יכולה ליצור EBs אחידים בגדלים הרצויים מאצווה לאצווה (איור 1F) ובין שורות תאים שונות¹³. מאז יום 0, המורפולוגיה של EB השתנתה עם הזמן במהלך ההתמיינות: הצורה נעשית פחות כדורית, והמשטח נעשה מחוספס יותר (איור 1), אולם הנפח אינו גדל באופן משמעותי. המורפולוגיה התלת-ממדית של כלי הדם תלויה בצפיפות ההטבעה ובגדלים של האורגנואידים המוטבעים. אורגנואידים גדולים מדי (>500 מיקרומטר) גורמים בדרך כלל להתמיינות לא מספקת של תאי כלי הדם, בעוד שאורגנואידים קטנים מדי נוטים להיות בעלי כלי דם לא מפותחים.

השינוי השני הוא שילוב קוקטייל CEPT כדי לשפר את הכדאיות hiPSC במהלך היווצרות EB. כדאיות התא חיונית בנוסף לאיכות מושבות hiPSC בתהליך זה. כאשר hiPSCs מנותקים לתרחיף חד-תאי, מעכב ROCK Y27632 מתווסף בדרך כלל כדי לשפר את יכולת הקיום של התא. עם זאת, Y27632 הוכח כלא אופטימלי עבור hiPSCs בצפיפות נמוכה ועלול לגרום ללחץ בלתי רצוי בממברנה, בעוד שקוקטייל CEPT (המורכב מכרומן 1, אמריקסן, פוליאמינים וטרנס-ISRIB) יכול להפחית באופן משמעותי את הלחץ התאי ולשפר את הכדאיות במהלך תהליך היווצרות EB זה עם hiPSCs בצפיפות נמוכה יותר¹⁵.

לפני הטמעת אורגנואידים בג'ל, האורגנואידים נשמרים בצלחת המיקרווול, והשינוי הבינוני צריך להיות עדין כדי למנוע הפרעה אפשרית. עדיף להשתמש פיפטה 200 μL כדי לשנות את המדיום במשך 5 הימים הראשונים. יש לחמם מראש את כל המדיה המשמשת לייצור אורגנואידים וסקולריים לפני השימוש. במיוחד לאחר הטבעה בג'ל, השימוש במדיה קרה יכול להנזיל חלקית את מטריצת קרום המרתף ולהשפיע על נישת הידרוג'ל תלת ממדית להיווצרות רשת כלי דם. צפיפות ההטבעה ואפילו הפיזור של האורגנואידים הם גם גורמים קריטיים להיווצרות רשת כלי הדם. הטבעה צפופה של אורגנואידים עלולה להוביל לאיחוי יתר של רשתות כלי הדם, בעוד שצפיפות הטבעה נמוכה עלולה להוביל להיווצרות רשת לא מספקת. זריעת 60-80 אורגנואידים לכל באר והזזת הצלחת בעדינות קדימה ואחורה מיד לאחר הוספתם לשכבה הראשונה של הג'ל התלת-ממדי יכולה להפיץ טוב יותר אורגנואידים אלה.

פרוטוקול זה ניתן לשינוי נוסף עבור יישומים שונים. לדוגמה, ניתן ליישם רמזי מחסום דם-מוח (BBB) כדי לרסן עוד יותר את תאי האנדותל של כלי הדם מהיווצרות ממשק BBB^{19,20,21,22,23,24,25}. ניתן להתאים גם את הרכב ההידרוג'ל התלת-ממדי. לדוגמה, פיברין וויטרונקטין משמשים בדרך כלל ליצירת רשת כלי דם במבחנה 25,26,27,28,29,30,31,32. ניתן להשתמש במטריצת קרום המרתף ללא קולגן I להטמעה, מה שעשוי לפשט את תהליך ההטבעה ולספק גירויים מכניים שונים.

אף על פי שהאורגנואידים של כלי הדם הנוצרים מפרוטוקול זה יכולים לשמש באופן פוטנציאלי למידול מחלות או ליישומי סינון תרופות, מגבלה אחת היא שאורגנואידים אלה רק מחזירים בעיקר את כלי הדם הנימיים עם מעט כלי דם גדולים יותר. עבור מחקר המתמקד בכלי דם גדולים יותר, ייצור אורגנואידים עשוי לדרוש גירויים מכניים נוספים 24,31,32,33. חיבור אורגנואידים וסקולריים עם מחזור הדם, כגון השתלה לבעלי חיים³⁴ או התקנים מיקרו-/ מאקרו-פלואידים עם משאבות זילוח³³, עשוי לטפל בכך.

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

ברצוננו להכיר בתמיכה הטכנית של המשאב המשותף למיקרוסקופיה קונפוקלית ומיוחדת של מרכז הסרטן המקיף ע"ש הרברט אירווינג באוניברסיטת קולומביה, שמומן בחלקו באמצעות מענק מרכז NIH (P30CA013696). עבודה זו נתמכת על ידי NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, ק. ו. ל.). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.