Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes humanas.

Los organoides vasculares derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan la diversidad de tipos celulares y la compleja arquitectura de las redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) tiene un potencial sustancial para el modelado de patologías vasculares y el cribado de fármacos in vitro . A pesar de los avances recientes, sigue existiendo un desafío técnico clave en la generación reproducible de organoides con una calidad constante, que es crucial para los ensayos y aplicaciones posteriores. Aquí, se presenta un protocolo modificado que mejora tanto la homogeneidad como la reproducibilidad de la generación de organoides vasculares. El protocolo modificado incorpora el uso de micropocillos y el cóctel CEPT (croma 1, emricasan, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés, trans-ISRIB) para mejorar la formación de cuerpos embrioides y la supervivencia celular. Los organoides vasculares maduros y diferenciados generados mediante este protocolo se caracterizan mediante microscopía de inmunofluorescencia 3D de montaje completo para analizar su morfología y vasculatura compleja. Este protocolo permite la producción de organoides vasculares de alta calidad de forma escalable, lo que podría facilitar su uso en aplicaciones de modelado de enfermedades y cribado de fármacos.

En la última década han surgido modelos microfisiológicos in vitro, incluidos los sistemas de organoides y tejidos en un chip ^1,2,3. Estos sistemas tridimensionales (3D) derivados de células humanas abordan las limitaciones del cultivo celular bidimensional (2D) convencional y de los modelos animales, como la falta de muchos componentes en el microambiente fisiológico y las diferencias genéticas entre especies, respectivamente. Proporcionan más información fisiológica y son más adecuados para el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos que los modelos convencionales. Entre los modelos microfisiológicos, se ha demostrado que los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan eficazmente las características arquitectónicas de los tejidos humanos nativos y se han desarrollado para imitar diferentes órganos humanos, incluyendo el cerebro ^4,5, el riñón⁶, el hígado ^7,8 y la retina⁹. Aquí, nos centramos especialmente en la generación de organoides vasculares a partir de hiPSCs y esbozamos un protocolo simplificado que tiene como objetivo minimizar las variaciones entre diferentes muestras y lotes de organoides, mejorando así la reproducibilidad general.

La vasculatura desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica en todos los órganos humanos. La formación de la vasculatura involucra los procesos de vasculogénesis y angiogénesis, orquestados a través de las interacciones entre las células endoteliales y murales (por ejemplo, pericitos y células del músculo liso vascular) e influenciados por diversos estímulos¹⁰. Penninger, Wimmer y sus colegas desarrollaron el primer método de generación de organoides vasculares^11,12 que imita estos dos procesos. Con los organoides generados a partir de este método, su grupo¹² y nosotros^13,14 han demostrado el potencial de los organoides vasculares para modelar las disfunciones vasculares en las enfermedades. Por ejemplo, en nuestros trabajos recientes ^13,14, se observaron fenotipos distintos, como la brotación de vasos y las variaciones en la composición de las células murales, entre los organoides vasculares que imitan la enfermedad y sus contrapartes de tipo salvaje. Estos ejemplos ponen de manifiesto que el modelo de organoide vascular podría servir como plataforma para el cribado de fármacos al imitar las disfunciones vasculares relacionadas con la enfermedad.

A partir de los trabajos iniciales de generación de organoides vasculares^11,12, se presenta un protocolo revisado que incluye el uso de micropocillos para facilitar la formación homogénea de cuerpos embrioides (EB), un factor crítico para minimizar las variaciones que a menudo se observan dentro del mismo lote de generación de organoides. Además, el cóctel CEPT, una combinación de cromán 1, emicasano, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés (trans-ISRIB)¹⁵, se emplea para mejorar la viabilidad de las hiPSC y las células diferenciadas durante el proceso de formación de EB. Esta modificación es principalmente para reducir las variaciones entre diferentes muestras y lotes de organoides. Se pueden producir organoides vasculares uniformes con este protocolo de aproximadamente dos semanas de duración, donde se induce la vasculogénesis para ayudar al endotelio a organizarse en redes tubulares primitivas el día 1, seguido de la inducción de la angiogénesis el día 5 para desarrollar redes vasculares complejas en los organoides. En el día 12-15, los organoides generados deben mostrar redes vasculares maduras compuestas por endotelio y células murales.

La Figura 1 presenta una descripción general de los pasos involucrados en este protocolo. La información detallada sobre los reactivos y materiales utilizados en este protocolo se proporciona en la Tabla de Materiales. Se recomienda que todos los medios se precalienten a 37 °C antes de su uso, a menos que se especifique lo contrario. Todos los materiales y suministros de cultivo celular deben ser esterilizados en autoclave, y el manejo de las células debe realizarse en un gabinete de bioseguridad. Además, el valor de pH de la mezcla de colágeno I debe ajustarse cuidadosamente a un pH de 7,3 para evitar posibles problemas de solidificación.

1. Mantenimiento de iPSC humano

1. Descongele el extracto de la matriz de membrana basal en hielo, agite suavemente el frasco para mezclar la solución y haga alícuotas de 0,5 ml en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta P1000 y puntas prerefrigeradas. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 1 año.
2. Descongele una alícuota de extracto de matriz (0,5 mL) en hielo. Mezclar con 49,5 mL de medio DMEM/F12 preenfriado en un tubo de 50 mL. Distribuya la mezcla a cada pocillo (1,5 mL/pocillo) en placas de 6 pocillos y luego agite suavemente la placa para asegurarse de que la solución líquida cubra todo el pocillo. Selle las placas con film de parafina y guárdelas a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
3. Prepare el medio de expansión hiPSC como se describe en la Tabla 1. Prepare alícuotas del medio completo (40 mL/tubo) y almacene a -20 °C hasta por 1 año.
4. Coloque una placa prerrevestida en la incubadora a 37 °C durante 1 h antes del cultivo de hiPSC.
5. Precaliente el medio de expansión hiPSC (40 mL) a 37 °C y prepare el medio de siembra hiPSC como se describe en la Tabla 2.
6. Transfiera la placa recubierta de la incubadora a 37 °C a la cabina de bioseguridad. Reemplace el medio en la placa recubierta con medio de siembra hiPSC (1 mL/pocillo).
7. Descongele un vial criopreservado de hiPSC del tanque criogénico en un baño de agua a 37 °C durante 1 min.
8. Transfiera las células a un tubo de 15 mL y luego agregue 5 mL de medio DMEM/F12, seguido de una centrifugación a 100 x g durante 3 min a temperatura ambiente para recolectar las células.
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 1,5 mL de medio de siembra hiPSC. Vuelva a suspender suavemente las células en el tubo de 15 ml.
10. Aliquotar 10 μL de la suspensión celular y mezclar con 10 μL de solución de azul de tripano. Transfiera la mezcla de 10 μL al portaobjetos del hematocitómetro y cúbralo con un cubreobjetos.
11. Monte la corredera en el soporte e insértela en el contador de celdas automatizado. Espere a que el instrumento encuentre el enfoque o ajuste manualmente el enfoque presionando el botón de enfoque +/- en la pantalla. Luego, use la configuración predeterminada y presione el botón Capturar . Utilice la lectura de la densidad de células vivas como la concentración de la suspensión de hiPSC preparada a partir del paso 1.9.
12. Siembre 2 × 10⁵ celdas en cada pocillo y asegúrese de que las celdas se distribuyan uniformemente en el pocillo.
13. Cultive las células a 37 °C con 5% de CO₂ y reemplace el medio con medio de expansión hiPSC (1,5 mL/pocillo) después de 24 h.
14. Cambie el medio diariamente hasta que las células alcancen una confluencia del 80%. Compruebe la morfología de la célula y el tamaño de la colonia de forma rutinaria para asegurarse de que no haya diferenciación espontánea. Deseche el cultivo y reinicie con un nuevo lote de hiPSCs si se observa una diferenciación espontánea extensa (>5%).

2. Formación EB (Día 0)

1. El día 0, prepare y precaliente el medio DMEM/F12, el medio de siembra hiPSC y la solución de desprendimiento de celdas a 37 °C durante 20-30 min.
2. Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pocillos y agregue una solución de desprendimiento de células precalentada (1,5 mL/pocillo). Incubar la placa a 37 °C durante 5-7 min.
3. Transfiera la placa a la cabina de bioseguridad, golpee la placa para separar las colonias de hiPSC y rompa los agregados.
4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL. Añadir 4,5 mL de medio DMEM/F12. Pipetear suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 10 ml cinco veces para disociar las células en una suspensión de una sola célula. Evita generar burbujas.
5. Centrifugar a 100 x g durante 3 min a temperatura ambiente para recoger las células.
6. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células con 1 mL de medio de siembra hiPSC utilizando una pipeta P1000.
7. Mezcle 10 μL de suspensión celular con 10 μL de solución de azul de tripano para el recuento de células. Transfiera 10 μL de la mezcla al portaobjetos del hematocitómetro y cúbralo con un cubreobjetos. Monte la corredera en el soporte e insértela en el contador de celdas automatizado. Después de que el instrumento encuentre el enfoque, presione el botón Capturar y use la lectura de densidad celular EN VIVO para determinar la concentración de la suspensión hiPSC.
8. Siembre las células en la placa de micropocillos de fondo redondo de ultra baja adherencia con una densidad de 2,7 × 10⁵ células/pocillo para producir entre 500 y 1.000 células por EB.
9. Agregue 2 mL de medio de siembra hiPSC a cada pocillo y mezcle la solución suavemente para distribuir las células de manera uniforme.
10. Cultivar las células a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h.

3. Diferenciación vascular (Día 1 - 5)

1. El día 1, prepare el medio de inducción del mesodermo (MIM) como se describe en la Tabla 3 y la Tabla 4 y precaliéntelo a 37 °C durante 20 min. El medio MIM debe estar hecho fresco.
2. Utilice una pipeta P200 para aspirar cuidadosamente el medio de la placa de micropocillos sin alterar los EB del fondo.
3. Añada 2,5 mL de MIM lentamente con una pipeta P200. Cultivar los EBs en MIM a 37 °C con 5% de CO₂ durante 2 días.
4. En el día 3, reemplace suavemente el medio con 2,5 mL precalentados y recién hechos del medio de diferenciación vascular 1 (VDM1, Tabla 5) sin alterar los EB en el fondo del micropocillo. Cultive las células a 37 °C con 5% de CO₂ durante otros 2 días.

4. Inclusión de hidrogel (Día 5)

1. Prepare la mezcla de colágeno I como se describe en la Tabla 6. Coloque un tubo de 50 ml sobre hielo y agregue la solución de colágeno I, H₂O, medio DMEM 10× / F12, bicarbonato de sodio y HEPES posteriormente. Mezcle bien agitando el tubo suavemente. Agregue 1 M de solución de NaOH gota a gota mientras agita la solución mezclada para ajustar el valor de pH a 7.3 y verifique el valor de pH de la mezcla con un medidor de pH.
   NOTA: Todas las soluciones deben enfriarse previamente en hielo antes de su uso. Realice el procedimiento en hielo en la cabina de bioseguridad todo el tiempo. La adición de la solución de NaOH es fundamental, y se necesita una dispersión rápida para crear una solución homogénea para evitar el curado local del colágeno I. El volumen de NaOH puede variar según el número de lote de la solución de colágeno I utilizada. No pipetee vigorosamente para mezclar, ya que el esfuerzo cortante podría causar un precurado no deseado.
2. Prepare la mezcla de matriz de colágeno I-membrana basal como se describe en la Tabla 7. Añadir 1,25 mL de matriz de membrana basal a la mezcla de 5 mL de colágeno I preparada a partir del paso 4.1. Mezcle la solución suavemente agitando el tubo.
3. Coloque un plato de 12 pocillos sobre hielo durante 2 min.
4. Agregue lentamente la mezcla de matriz de membrana basal de colágeno I a la placa de 12 pocillos (1,5 mL/pocillo) utilizando las puntas de diámetro ancho. Asegúrate de que la mezcla se distribuya uniformemente.
5. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C durante 2 h para solidificar la primera capa de hidrogel.
6. Mantenga la mezcla restante de la matriz de la membrana basal de colágeno I en hielo para su uso posterior.
7. Transfiera ~ 60 agregados de celdas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y enfríe el tubo con hielo durante 5 minutos. Retire con cuidado el medio con una punta de pipeta P200.
   NOTA: Inicie este paso 1,5 horas después del paso 4.5.
8. Gota a gota, añada 1,5 ml de mezcla de colágeno I-membrana basal a los agregados y mézclelos suavemente con las puntas de pipeta P200 de diámetro ancho.
9. Transfiera la placa con la primera capa de hidrogel de la incubadora (paso 4.5) a la cabina de bioseguridad.
10. Añadir 1,5 mL de la suspensión de áridos sobre la capa curada. Agite suavemente la placa para distribuir los agregados de manera uniforme. Evite generar burbujas.
11. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO₂ durante otras 2 h.
12. Preparar el medio de diferenciación vascular 2 (VDM2; Tabla 8) y precalentar el medio en un baño de agua a 37 °C durante 20 minutos antes de su uso.
13. Añadir 2 mL de VDM2 a cada pocillo y cultivar las células a 37 °C con 5% de CO₂.
14. Cambie el medio cada 3 días con VDM2 precalentado y recién hecho.
    NOTA: (Opcional) Los organoides vasculares pueden liberarse de la mezcla de gel retirando el gel con una aguja de jeringa. Los organoides vasculares recuperados del gel se pueden mantener individualmente en una placa de 96 pocillos con VDM2 (200 μL/pocillo). Cambie el medio cada 2-3 días.

5. 3D Ensayo inmunofluorescente

1. Los organoides vasculares deben madurar aproximadamente el día 13. En el caso de los organoides incrustados en el hidrogel, aspire el medio con cuidado y lávese con 2 ml de PBS tres veces (10 min cada vez). En el caso de los organoides extraídos del gel (después del paso 4.14), recoja de 6 a 10 organoides en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, aspire el medio y lave con 2 ml de PBS tres veces (10 min cada una).
2. Añadir 2 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% a la muestra e incubar a 4 °C durante la noche con sellado de película de parafina.
3. Retire la solución de PFA y lave la muestra con 2 mL de PBS cuatro veces (15 min cada vez).
4. Añadir 2 mL de tampón de bloqueo (Tabla 9) e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
5. Retire el tampón de bloqueo y agregue 1,5 mL de anticuerpos primarios (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre anticuerpos; los anticuerpos deben diluirse en el tampón de bloqueo). Incubar la muestra con anticuerpos primarios a 4 °C durante 2 días agitando suavemente.
   NOTA: Se recomienda diluir el anticuerpo primario (CD31, PDGFRβ y ERG1) en el tampón de bloqueo en una proporción de 1:400 (consulte la Tabla de materiales para obtener más información).
6. Retire la solución de anticuerpos primarios y lávese con 2 ml de PBST durante 1 h seis veces.
7. Añada 2 mL de anticuerpos secundarios (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre anticuerpos; los anticuerpos deben diluirse en PBST) a la muestra. Envuelva la placa con papel de aluminio e incube a 4 °C durante 2 días agitando suavemente.
   NOTA: Se recomienda diluir el anticuerpo secundario en PBST en una proporción de 1:1000 (consulte la Tabla de materiales para obtener más información). Mantenga la placa alejada de la luz durante la incubación y lave a partir de este paso después.
8. Retire la solución de anticuerpos secundarios y lávese con 2 ml de TBST seis veces (1 h cada vez). Agregue DAPI (1 μg/mL) en el tampón de lavado utilizado para el último paso de lavado si es necesario tintar los núcleos.
9. Para estos organoides incrustados en gel, corte el gel en 4 trozos y transfiéralos con cuidado a tubos de microcentrífuga de 2 ml con una espátula. Para los organoides recuperados, retire el tampón de lavado.
10. Use toallitas para absorber la solución restante sin tocar el gel o los organoides.
11. Añada 2 ml de reactivo de limpieza de tejidos soluble en agua (índice de refracción = 1,49) a cada tubo. Incubar las muestras con reactivo de aclarado a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que los organoides se aclaren (generalmente durante la noche). No agite las muestras.
12. Transfiera los organoides con el reactivo de aclarado con cuidado al centro del plato con fondo de vidrio con una espátula.
13. Cubra los organoides o la pieza de gel con un cubreobjetos de 24 mm × 24 mm.
14. Empuje suavemente el cubreobjetos hacia abajo hasta que quede plano y coloque las muestras con el fondo de vidrio.
15. Retire el reactivo limpiador redundante de la placa y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas.
16. Para obtener imágenes en 3D, utilice un microscopio confocal con un objetivo de 10×. Utilice el escaneo de mosaicos y el escaneo de pila Z para obtener imágenes de montaje completo de organoides.

La Figura 1A presenta el esquema de este protocolo, incluidos los componentes clave utilizados en cada etapa. La diferenciación comenzó con la formación de EB, seguida de la inducción del mesodermo y la especificación del linaje vascular (Figura 1B-D). Los agregados se hicieron más grandes y menos esféricos con el tiempo. Los organoides comenzaron a mostrar bordes ásperos el día 5. Después de incrustarse en la mezcla de colágeno I-membrana basal, las células endoteliales vasculares y los pericitos brotaron y crecieron para formar redes vasculares complejas ya en el día 7 (Figura 1E). Como el objetivo principal de este método modificado es minimizar las variaciones entre los diferentes lotes de generación, medimos el tamaño de EB de dos lotes independientes, y tanto las mediciones de tamaño como el análisis estadístico confirmaron la consistencia y uniformidad con este método (Figura 1F).

Para validar la diferenciación vascular, los organoides se recolectaron el día 5 antes de la inclusión y se tiñeron con marcadores vasculares, incluidos CD31, ERG1 y PDGFRβ. Los organoides expresaron CD31, ERG1 y PDGFRβ (Figura 2), lo que indica la presencia de células endoteliales vasculares y pericitos.

Después del aclaramiento del tejido, las redes vasculares se analizaron con microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo (Figura 3A). Los organoides maduros se tiñeron con CD31, ERG1 y PDGFRβ el día 17 (Figura 3B, muestra en el bloque de gel) y el día 28 (Figura 3C, la muestra se extrajo del bloque de gel y se cultivó individualmente en una placa de 96 pocillos; nótese que la red vascular en los bordes envolvía los esferoides en lugar de expandirse radialmente después de recuperarse del bloque de gel).

Figura 1: Generación de organoides vasculares. (A) Esquema de los pasos y cronograma para la generación de organoides vasculares. (B-E) Imágenes representativas de campo claro de organoides vasculares en diferentes etapas. Barras de escala: 100 μm. (F) Análisis estadístico en tamaño EB de dos lotes diferentes de generación de EB utilizando el método de micropocillos presentado en este trabajo. Para la generación de EB se utilizaron 1.000 celdas por micropocillo, y para los lotes 1 y 2, n = 42 y n = 40, respectivamente. La significación se presenta como ns, no significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Inmunotinción de organoides vasculares antes de la inclusión en gel. Imágenes fluorescentes representativas de organoides teñidos con los marcadores endoteliales (A) CD31 (verde) y (B) ERG1 (verde), así como con (C) el marcador de pericitos, PDGFRβ (verde), respectivamente. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterizaciones inmunofluorescentes de la red vascular en organoides vasculares. (A) Una imagen representativa muestra organoides vasculares incrustados en gel en la placa de vidrio después de la limpieza del tejido. Los organoides eran transparentes pero visibles bajo una luz ultravioleta de 385 nm. (B) Una imagen representativa en 3D de montaje completo del organoide vascular en el día 17. El organoide vascular se tiñó con DAPI (azul), el marcador de células endoteliales vasculares, CD31 (verde) y el marcador de pericitos, PDGFRβ (magenta). (C) Una imagen 3D representativa de montaje completo de un organoide vascular recuperado en el día 28, teñida con los marcadores endoteliales CD31 (rojo) y ERG1 (verde). Barras de escala: 150 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición del medio de expansión hiPSC.

Tabla 2: Composición del medio de siembra hiPSC.

Tabla 3: Composición del medio N2B27.

Tabla 4: Composición del medio de inducción del mesodermo (MIM).

Tabla 5: Composición del medio de diferenciación vascular 1 (VDM1).

Tabla 6: Composición de la mezcla de colágeno I.

Tabla 7: Composición de la mezcla de matriz de colágeno I-membrana basal.

Tabla 8: Composición del medio de diferenciación vascular 2 (VDM2).

Tabla 9: Composición del tampón bloqueante para inmunotinción.

El protocolo descrito incluye dos modificaciones clave para la generación homogénea y reproducible de organoides vasculares de alta calidad. La primera modificación es el uso de una placa de micropocillos para permitir un mejor control de la uniformidad del EB. Como punto de partida de la diferenciación vascular, el tamaño de las EB es crítico, ya que regula el destino de las células madre y la eficacia de la diferenciación hacia diferentes linajes. Las variaciones en el tamaño de la EB suelen dar lugar a organoides heterogéneos con estructura y organización inconsistentes^16,17. El método convencional de generación de EB mediante el levantamiento de colonias de hiPSC^11,12 dificulta el control del número de células para EB individuales y, por lo general, resulta en la formación heterogénea de EB. En este protocolo, las hiPSCs se disocian en suspensión unicelular y se reagregan en micropocillos^16,18. Al ajustar el número de células de siembra, se puede optimizar el tamaño de las EB para garantizar una diferenciación mesodérmica consistente y efectiva. Para la siembra de micropocillos, se utilizan 500-1.000 celdas, y esto puede producir EB relativamente pequeños (con un diámetro de 100-200 μm). Este método podría generar EBs uniformes con los tamaños deseados de un lote a otro (Figura 1F) y entre varias líneas celulares¹³. Desde el día 0, la morfología del EB ha cambiado con el tiempo durante la diferenciación: la forma se vuelve menos esférica y la superficie se vuelve más rugosa (Figura 1), pero el volumen no aumenta significativamente. La morfología de la vasculatura 3D depende de la densidad de inclusión y del tamaño de los organoides incrustados. Los organoides demasiado grandes (>500 μm) suelen dar lugar a una diferenciación insuficiente de las células vasculares, mientras que los organoides demasiado pequeños tienden a tener una vasculatura poco desarrollada.

La segunda modificación es la incorporación del cóctel CEPT para mejorar la viabilidad de la hiPSC durante la formación de EB. La viabilidad celular es crucial, además de la calidad de las colonias de hiPSC durante este proceso. Cuando las hiPSC se disocian en una suspensión de una sola célula, generalmente se agrega el inhibidor de ROCK Y27632 para mejorar la viabilidad celular. Sin embargo, se ha demostrado que Y27632 no es óptimo para las hiPSCs de baja densidad y puede causar estrés no deseado en la membrana, mientras que el cóctel CEPT (compuesto por cromán 1, emricasan, poliaminas y trans-ISRIB) podría reducir significativamente el estrés celular y mejorar la viabilidad durante este proceso de formación de EB con hiPSCs en una densidad más baja¹⁵.

Antes de la inclusión del organoide en el gel, los organoides se mantienen en la placa de micropocillos, y el cambio de medio debe ser suave para evitar posibles interrupciones. Sería mejor utilizar una pipeta de 200 μL para cambiar el medio durante los primeros 5 días. Todos los medios utilizados para la generación de organoides vasculares deben precalentarse antes de su uso. Especialmente después de la inclusión en gel, el uso de medios fríos podría licuar parcialmente la matriz de la membrana basal y afectar el nicho de hidrogel 3D para la formación de redes vasculares. La densidad de inclusión y la distribución uniforme de los organoides también son factores críticos para la formación de la red vascular. La inclusión densa de organoides podría conducir a una fusión excesiva de redes vasculares, mientras que la baja densidad de inclusión podría conducir a una formación de redes insuficiente. Sembrar entre 60 y 80 organoides por pocillo y mover suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás inmediatamente después de agregarlos a la primera capa del gel 3D puede distribuir mejor estos organoides.

Este protocolo se puede modificar aún más para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, las señales de la barrera hematoencefálica (BBB) se pueden aplicar para restringir aún más las células endoteliales vasculares de la formación de la interfaz BBB 19,20,21,22,23,24,25. La composición del hidrogel 3D también se puede ajustar. Por ejemplo, la fibrina y la vitronectina se utilizan comúnmente para la formación de redes vasculares in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. La matriz de membrana basal sin colágeno I puede utilizarse para la incrustación, lo que puede simplificar el proceso de inclusión y proporcionar diferentes estímulos mecánicos.

Aunque los organoides vasculares generados a partir de este protocolo podrían usarse potencialmente para aplicaciones de modelado de enfermedades o detección de fármacos, una limitación es que estos organoides solo recapitulan principalmente la vasculatura capilar con pocos vasos más grandes. Para la investigación centrada en vasos más grandes, la generación de organoides puede requerir estímulos mecánicos adicionales 24,31,32,33. La conexión de los organoides vasculares con la recirculación, como el trasplante a animales³⁴ o los dispositivos micro/macrofluídicos con bombas de perfusión³³, podría abordar este problema.

Los autores declaran no tener ningún interés financiero contrapuesto.

Nos gustaría agradecer el apoyo técnico del Recurso Compartido de Microscopía Confocal y Especializada del Centro Oncológico Integral Herbert Irving de la Universidad de Columbia, financiado en parte a través de la Subvención del Centro de los NIH (P30CA013696). Este trabajo cuenta con el apoyo de los NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). La Figura 1A se creó utilizando BioRender.