В этом протоколе технология переработки бараньего масла Epimedii folium (EF) была оптимизирована с применением экспериментальной методологии поверхности Бокса-Бенкена, а также предварительно исследовано влияние сырого и оптимизированного EF, экстрагированного водой, на эмбриональное развитие рыбок данио.

Как традиционная китайская медицина (ТКМ), Epimedii folium (EF) имеет историю в медицине и еде, которая насчитывает > 2000 лет. Клинически EF, обработанный бараньим маслом, часто используется в качестве лекарства. В последние годы сообщения о рисках безопасности и побочных реакциях продуктов, в которых EF используется в качестве сырья, постепенно увеличиваются. Обработка может эффективно повысить безопасность ТКМ. Согласно теории ТКМ, обработка бараньего масла может снизить токсичность ЭФ и усилить его тонизирующее действие на почки. Тем не менее, отсутствуют систематические исследования и оценка технологии переработки бараньего масла EF. В этом исследовании мы использовали экспериментальную методологию Бокса-Бенкена для оптимизации ключевых параметров технологии обработки путем оценки содержания нескольких компонентов. Результаты показали, что оптимальная технология обработки бараньего масла EF была следующей: нагревание бараньего масла при 120 °C ± 10 °C, добавление сырого EF, осторожное обжаривание до 189 °C ± 10 °C до тех пор, пока оно не станет равномерно блестящим, а затем удаление и охлаждение. На каждые 100 кг EF следует использовать 15 кг бараньего масла. Токсичность и тератогенность водного экстракта сырого и бараньего масла, обработанного EF, сравнивали в модели развития эмбриона рыбок данио. Результаты показали, что группа сырых трав с большей вероятностью вызывала уродства рыбок данио, а ее полумаксимальная смертельная концентрация EF была ниже. В заключение, оптимизированная технология переработки бараньего масла была стабильной и надежной, с хорошей повторяемостью. В определенной дозе водный экстракт EF был токсичен для развития эмбрионов рыбок данио, и токсичность была сильнее для сырого препарата, чем для обработанного препарата. Результаты показали, что переработка бараньего масла снижает токсичность сырого EF. Эти результаты могут быть использованы для улучшения качества, однородности и клинической безопасности EF, обработанных бараньим маслом.

Epimedii folium (EF) — высушенные листья Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., или Epimedium koreanum Nakai. EF можно использовать для лечения остеопороза, климактерического синдрома, опухолей молочной железы, гипертонии, ишемической болезни сердца и других заболеваний¹. Как традиционная китайская медицина (ТКМ), EF имеет более чем 2000-летнюю историю в медицине и питании. Благодаря своей низкой цене и замечательному эффекту тонизирования почек, он широко используется в лекарствах и здоровом питании. EF обрабатывается путем обжаривания его с бараньим маслом, процесс, впервые описанный в «Теории обработки Лэй Гун», написанной Лэй Сяо в период² Лю Сун. Эффективность сырого EF и жареного EF совершенно разная. Сырой EF в основном рассеивает ревматизм, тогда как жареный EF согревает почки, усиливая ян³. В настоящее время EF широко используется в качестве сырья в лекарствах и здоровой пище; В Китае зарегистрировано 399 патентованных лекарств, девять импортных продуктов здорового питания и 455 отечественных продуктов здорового питания с EF в качестве сырья⁴. Этот лекарственный материал имеет большие перспективы применения. Однако в последние годы появляется все больше сообщений о побочных реакциях и повреждении печени человека, вызванных здоровой пищей и китайскими патентованными лекарствами, использующими EF в качестве сырья, и соответствующие исследования токсичности ^5,6,7 сообщили, что EF в качестве сырья имеет потенциальные риски для безопасности.

Китайская лекарственная обработка относится к фармацевтическим методам, которые могут эффективно снизить или устранить токсичность и повысить безопасность ТКМ. Традиционным методом обработки EF является обжаривание с бараньим маслом, что снижает токсичность EF и усиливает его эффект согревания почек и стимулирования yang⁸. Этот метод обработки включен в Китайскую фармакопею и различные спецификации обработки¹. Процесс EF определяется только следующим образом: на каждые 100 кг EF добавляется 20 кг амниотического масла (рафинированного), и оно обжигается мягким огнем до однородной и блестящей¹. В приведенных выше стандартах нет строгих параметров метода обработки EF, поэтому локальные спецификации обработки не были унифицированы для обеспечения согласованности. Поэтому было бы полезно провести систематическое исследование процесса ЭФ. В данной работе был использован экспериментальный метод поверхности дизайна и отклика Бокса-Бенкена для оптимизации технологии обработки EF.

Экспериментальный дизайн Бокса-Бенкена — это метод, обычно используемый для оптимизации факторов процесса. Параметры извлечения могут быть оптимизированы путем установления функциональной зависимости между несколькими факторами соответствия уравнений регрессии и значениями эффектов. В последнее время этот метод широко используется для изучения экстракции^ТКМ 5,6,7 и обработки 9,10,11. В различных исследованиях сообщалось о методах приготовления ТКМ, включающих обработку соли, обработку вина и жарку в соответствии с дизайном Box-Behnken, например, для обработанного солью Psoraleae fructus 12, обработанного вином Cnidii fructus¹³ и жареного Cinnamomi ramulus¹⁴. Этот метод имеет сокращенное время тестирования, высокую точность тестирования и подходит для многофакторных и многоуровневых тестов. Этот метод является более простым, чем метод испытания ортогонального дизайна, и более всеобъемлющим, чем метод¹⁵ однородного проектирования. Полученные соотношения позволяют определить прогнозируемое значение любой контрольной точки в пределах тестового диапазона, что является большим преимуществом. Модель рыбок данио-рерио может быть использована для проверки того, является ли EF менее токсичным после обработки.

В исследованиях токсичности ТКМ модель рыбок данио-рерио имеет двойные преимущества: высокую пропускную способность клеточных экспериментов и сходство с экспериментами на грызунах¹⁶. Эта модель отличается небольшими размерами, высокой скоростью нереста, коротким циклом размножения, простотой разведения. Модель может быть использована в крупномасштабных синхронных экспериментах на планшетах для клеточных культур, а экспериментальная дозировка препарата невелика, экспериментальный цикл короткий, стоимость низкая, а весь экспериментальный процесс легко наблюдать и эксплуатировать¹⁷. Эмбрионы рыбок данио-рерио прозрачны и быстро развиваются. Таким образом, токсичность и тератогенное действие лекарственных средств на висцеральные ткани на разных стадиях развития можно непосредственно наблюдать под микроскопом¹⁸. Гомология генов между рыбками данио-рерио и человеком достигает 85%¹⁸. Путь передачи сигнала рыбок данио-рерио аналогичен пути человека¹⁸. Биологическая структура и физиологические функции рыбок данио-рерио очень похожи на таковые у млекопитающих¹⁸. Таким образом, модель рыбок данио-рерио для тестирования лекарств может предоставить экспериментальных животных, которые являются надежными и полностью применимыми к людям¹⁹.

В этом исследовании мы использовали методологию поверхности «дизайн-отклик» Бокса-Бенкена для оптимизации количества и температуры бараньего масла и температуры жарки, используемой в технологии обработки EF, с содержанием икариина, эпимедина А, эпимедина В, эпимедина С и баохуозида I в качестве индексов оценки. Модель рыбок данио-рерио была использована для предварительного изучения влияния водного экстракта EF на эмбриональное развитие рыбок данио-рерио до и после обработки, чтобы оценить эффект ослабления обработки на EF.

Все эксперименты, связанные с животными, проводились с одобрения Комитета по этике экспериментов Чунцинского института ТКМ (номер сертификата проверки этики лабораторных животных: ZJS2022-03).

1. Определение биологически активных компонентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Вид, использованный в этом исследовании, был Epimedium sagittatum, и образцы были собраны в округе Фэнду, Чунцин. Образец был идентифицирован как сухая надземная часть E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Сентенция. исследователями Института биологической медицины, Чунцинского института традиционной китайской медицины.

1. Готовят раствор контрольного продукта путем точного взвешивания соответствующего количества каждого эталонного вещества, а именно икариина, эпимедина А (ЭА), эпимедина В (ЭБ), эпимедина С (ЕС) и баохуозида I (БИ), используя электронные аналитические весы, и растворяют в метаноле. Используя их, приготовьте смешанный эталонный исходный раствор, содержащий 381,61 мкг/мл икариина, 124,14 мкг/мл EA, 110,24 мкг/мл EB, 1091,75 мкг/мл EC и 184,98 мкг/мл BI.
2. Приготовьте раствор исследуемого продукта, измельчив EF через сито No 3. Поместите примерно 0,2 г (с использованием электронных аналитических весов) измельченного EF в закупоренную колбу Эрленмейера, добавьте 20 мл разбавленного этанола, а затем ультразвук мощностью 400 Вт и частотой 50 кГц в течение 1 часа. Хорошо встряхните и пропустите через мембранный фильтр 0,22 мкм для получения испытуемого раствора.
3. Выполните хроматографию следующим образом. Используйте высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с колонкой C₁₈ с размерами 4,6 мм x 250 мм и внутренним диаметром 5 мкм. Используйте ацетонитрил в качестве подвижной фазы А и сверхчистую воду в качестве подвижной фазы В. Используйте следующие параметры градиентного элюирования: 0-30 мин, от 24% А до 26% А; 30-31 мин, от 26% А до 45% А; 31-45 мин, от 45% А до 47% А. Используйте длину волны детектирования 220 нм (для используемого детектора см. Таблицу материалов). Поддерживайте температуру колонки на уровне 30 °C и скорость тока на уровне 1,0 мл/мин и используйте образец размером 10 мкл.
4. Чтобы исследовать линейную зависимость, используйте смешанный эталонный раствор, как показано на шаге 1.1, разбавленный в 2 раза, 4 раза, 8 раз, 16 раз и 32 раза, для икариина, EA, EB, EC и BI соответственно. Используйте ацетонитрил в качестве подвижной фазы А и сверхчистую воду в качестве подвижной фазы В.
5. Используйте следующие параметры градиентного элюирования: 0-30 мин, от 24% А до 26% А; 30-31 мин, от 26% А до 45% А; 31-45 мин, от 45% А до 47% А. Используйте длину волны детектирования 220 нм (для используемого детектора см. Таблицу материалов). Поддерживайте температуру колонки на уровне 30 °C и скорость тока на уровне 1,0 мл/мин и используйте образец размером 10 мкл. Наконец, запишите пиковые области. Постройте линейную регрессию с эталонной концентрацией (ось x, мкг/мл) в качестве абсцисс и площадью пика (ось y) в качестве ордината с помощью профессионального программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
6. Проведите прецизионное испытание, измерив смешанный контрольный раствор шесть раз подряд с помощью ВЭЖХ с использованием хроматографических условий, показанных на шаге 1.3. Запишите время обнаружения и пиковые площади каждого химического состава и рассчитайте относительные стандартные отклонения (RSD) пиковых областей, чтобы оценить точность (воспроизводимость), используя приведенную ниже формулу:
   RSD% = стандартное отклонение (SD)/среднее арифметическое вычисленных результатов (X) x 100 %
7. Чтобы выполнить испытание на воспроизводимость, точно взвесьте порошок EF и параллельно приготовьте шесть частей раствора испытуемого продукта в соответствии со способом, описанным на шаге 1.2. Приготовленные растворы подвергают ВЭЖХ в хроматографических условиях, представленных на шаге 1.3. Запишите время удержания и пиковые площади каждого химического состава и рассчитайте количество каждого соединения по стандартной кривой (площади пиков в зависимости от концентраций). Рассчитайте RSD%, как указано выше.
8. Чтобы провести испытание на стабильность, храните испытуемые растворы при комнатной температуре и измеряйте их содержание методом ВЭЖХ, описанным на этапе 1.3, через 0 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч и 24 ч после подготовки для оценки стабильности. Запишите время удержания и пиковые площади каждого химического состава и рассчитайте RSD% пиковых областей, как указано выше.
9. Чтобы выполнить тест на восстановление образца, взвесьте 0,2 г порошка EF в колбу Эрленмейера с пробкой для шести повторений. Добавляют соответствующее количество эталонного раствора (количество эталонного вещества, добавленного в образец, эквивалентно 100% от известного содержания образца) и готовят испытуемый раствор в соответствии со способом, представленным на этапе 1.2.
10. Введите образцы в хроматограф и проанализируйте в соответствии с хроматографическими условиями на шаге 1.3. Запишите пиковые области и рассчитайте средние значения восстановления и RSD%, как показано ниже:
    Коэффициент извлечения образца с шипами = (содержимое образца с шипами − содержимое образца)/количество образца x 100%

2. Оптимизация технологии переработки бараньего масла EF с использованием методологии Box-Behnken design-response surface

1. Выберите ключевые параметры обработки EF, такие как количество бараньего масла (A; 15%-35%), температура бараньего масла (B; 50-120 °C) и температура жарки (C; 80-300 °C), в качестве влияющих факторов. В качестве оценочных индексов используйте комплексные оценки содержимого icariin, EA, EB, EC и BI. Процентное содержание бараньего масла здесь является массовым процентом.
2. Используйте программное обеспечение для анализа поверхности отклика (см. Таблицу материалов) для разработки экспериментов с поверхностью отклика Бокса-Бенкена, исследования квадратичной поверхности отклика и построения полиномиальной модели второго порядка. Выберите новый дизайн Box-Behnken и установите для параметра «Числовые множители» значение 3; установите множители A, B и C. Нажмите «Продолжить». Установите для параметра «Ответы» значение 1 (это была общая оценка). Нажмите « Продолжить », чтобы завершить проектирование. Всего было запланировано 17 экспериментов (см. табл. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Независимые и зависимые переменные, а также их низкие, средние и высокие уровни см. в таблице 2.
3. Обработайте EF в соответствии с конкретными параметрами, указанными в таблице 1; например, для заказа No 1 взвесьте рафинированное баранье масло как 15% об./об., а затем нагрейте до 50 ° C, чтобы растопить его. Добавьте сырой EF к растопленной баранине, обжарьте на слабом огне (190 ° C), пока она не станет равномерно блестящей, а затем выньте и остудите. Выполнил 17 экспериментальных операций. Всего в этой работе было получено 17 групп продуктов, обработанных EF.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Баранье масло твердое при комнатной температуре (25 °C) и плавится в жидкость при нагревании. В качестве вспомогательного вещества можно использовать баранье масло в жидком состоянии.
4. Готовят испытуемые растворы продуктов переработки в соответствии со способом, описанным в шаге 1.2. Затем проанализируйте их с помощью ВЭЖХ в соответствии с хроматографическими условиями, описанными в шаге 1.3. Запишите время удержания и пиковые площади каждого химического состава и рассчитайте содержание икариина, EA, EB, EC и BI в каждом тестовом растворе по внешней стандартной кривой. Используйте приведенную ниже формулу расчета всеобъемлющих баллов для расчета комплексных баллов 17 экспериментальных групп:
   Совокупный балл =_Z /Z макс. × 0,5 + BI/BI_макс. × 0,5
   где Z — сумма содержания икариина, EA, EB и EC; Z_max – максимальное значение суммы содержания икариина, EA, EB и EC в 17 экспериментальных группах; BI — это содержимое бизнес-аналитики; и_{BI max} — максимальное значение содержимого BI в 17 экспериментальных группах.
5. Импортируйте полные результаты оценки для 17 групп экспериментов в программное обеспечение для анализа данных (см. Таблицу материалов) для анализа экспериментальных данных. В элементах оценки выберите квадратичный порядок процессов и тип полиномиальной модели.

3. Тестирование влияния обработки на эмбриональное развитие рыбок данио-рерио

1. Пробоподготовка
   1. Сырой и обработанный EF измельчить через сито No 3 (см. Таблицу материалов). К 100 г каждого образца EF добавьте 1,000 мл сверхчистой воды. Замочите EF на 0,5 часа, дважды вскипятите воду по 30 мин, а затем процедите фильтровальной бумагой.
   2. Смешайте фильтраты и сконцентрируйте образец путем нагревания. Добавьте сверхчистую воду в конечный объем 100 мл для получения обработанных исходных растворов EF (PEF, 1 г / мл) и сырого EF (CEF, 1 г / мл). Измерьте количество сырого лекарственного средства в каждом исходном растворе.
   3. Поместите аликвоты 1 мл, 1,5 мл, 2,5 мл, 5 мл и 7,5 мл исходных растворов в мерные колбы объемом 10 мл, а затем добавьте сверхчистую воду до объема для приготовления тестовых растворов с концентрациями 100 мг / мл, 150 мг / мл, 200 мг / мл, 250 мг / мл, 500 мг / мл и 750 мг / мл для исследования эмбриотоксичности рыбок данио.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации испытуемых растворов были получены путем ссылки на соответствующую литературу 20,21 и путем проведения предварительных экспериментов для получения^{10-кратного} градиента концентрации^, используемого в нормальной токсикологии. CEF был необработанным образцом, а PEF был образцом, приготовленным с использованием наилучшей технологии обработки, описанной в разделе 2.
2. Разведение рыбок данио-рерио и лечение эмбрионов²¹
   1. Приспосабливайте рыбок данио-рерио дикого типа (см. Таблицу материалов) при контролируемой температуре в течение 2 дней, держите их в проточном аквариуме при рН 7,0-7,4 и кормите два раза в день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибирование образования меланина у рыбок данио-рерио было достигнуто путем добавления 1-фенил-2-тиомочевины в концентрации 0,003% (масса/объем) в питательную среду, что сохраняло прозрачность их тел для морфологического наблюдения.
   2. Вечером отбирайте взрослых фертильных рыбок данио дикого типа и разделяйте их с помощью перегородок в брачных ящиках. Снимите перегородки на следующее утро и дайте рыбе нереститься в течение 30 минут. Собирают оплодотворенные яйца капельницей каждые 15 мин. Всего было собрано 520 здоровых эмбрионов дикого типа. Хранить эмбрионы рыбок данио-рерио в инкубаторе при температуре 28,5 °C в течение 24 часов.
   3. Случайным образом распределите здоровые эмбрионы через 24 часа после оплодотворения (hpf) на 13 групп и вместе с одной контрольной группой отдельно замочите по 10 мл каждого из следующих растворов в чашке для культивирования: PEF: 100 мкг/мл, 150 мкг/мл, 200 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл, 750 мкг/мл; CEF: 100 мкг/мл, 150 мкг/мл, 200 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл, 750 мкг/мл. Обработайте заготовку контрольной группы средой в качестве раствора. Каждая группа содержала 40 эмбрионов в этом исследовании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды составляет 0,15 М NaCl, 5 мМ KCl, 0,25 мМ Na 2 HPO 4, 0,45 мМ KH 2 PO 4, 1,3 мМ CaCl₂, 1,0 мМ MgSO₄ и₄ мМ NaHCO₃.
   4. Культивируйте рыбок данио-рерио в инкубаторе с постоянной температурой до 120 л.с. Подсчитайте количество мертвых личинок каждый день, наблюдайте за морфологией основных органов личинок в каждой экспериментальной группе под стереомикроскопом (масштабная линейка = 500 мкм, см. Таблицу материалов) и рассчитайте концентрацию полусмерти (LC₅₀) рыбок данио-рерио при 72 hpf с помощью программного обеспечения для анализа данных (см. Таблицу материалов).

Результаты методологического исследования
Наблюдалась линейная зависимость между концентрацией икариина, ЭА, ЭБ, ЭК, БИ и хроматографическими пиковыми площадями (см. табл. 3). Значения RSD% (n = 6) хроматографических пиковых площадей икариина, EA, EB, EC и BI составляли 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% и 1,06% соответственно, что указывает на то, что точность измерений ВЭЖХ была хорошей. Значения RSD% (n = 6) содержания икариина, EA, EB, EC и BI составляли 1,59%, 1,46%, 1,86%, 2,29% и 0,98% соответственно, что указывает на хорошую повторяемость метода. Значения RSD% (n = 6) пиковых областей икариина, EA, EB, EC и BI в образцах составляли 1,49%, 1,96%, 1,42%, 0,96% и 0,81% соответственно, что указывает на то, что раствор образца был стабильным в течение 24 часов. Средние показатели восстановления икариина, ЭА, ЭБ, ЭК и BI составили 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% и 100,94% соответственно, а значения RSD% составили 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% и 1,47% соответственно (см. Таблицу 4). Эти результаты показывают, что точность метода соответствовала требованиям.

Приведенные выше экспериментальные результаты показали, что аналитический метод дал результаты, обладающие превосходной точностью, воспроизводимостью и точностью и приемлемые для анализа качества продуктов, обработанных EF.

Оптимизация технологии переработки бараньего масла EF с применением методологии Box-Behnken design-response surface
Мы выполнили квадратичную полиномиальную регрессионную подгонку приведенных данных для получения следующей модели: Y = 0,86 − 0,11 x A + 0,025 x B − 0,078 x C − 0,023 x A x B − 0,037 x A x C + 0,037 x B^x C − 0,045 x A 2 + 2,5 x ^10-3 x B 2 − 0,14 x C². Дисперсионный анализ дал значение P < 0,01, что указывает на то, что модель была значимой. Значение P отсутствия соответствия составило P > 0,05, что указывает на то, что отсутствие соответствия не было значительным. Значение R² составило 0,9300, что указывает на то, что модель хорошо подогналась, а погрешность была небольшой. Эту модель можно было использовать для анализа и прогнозирования влияния химического состава EF, обжаренного с бараньим маслом. Кроме того, А2 и^D2 влияли на содержание продуктов переработки, и разница была статистически значимой (Р < 0,01). Влияние A и C одноградусного члена^{и C 2} члена второго порядка на комплексную оценку было значительным. Член одной степени B, второй порядок A 2, B² и все элементы взаимодействия не оказали существенного влияния на общую оценку. Анализ значений P показал, что из экспериментальных параметров наибольшее влияние на комплексную оценку оказало количество бараньего масла (А), за которым следует температура жарки (С), а затем температура бараньего масла (В). Приведенные выше результаты приведены в таблице 5.

Программное обеспечение использовалось для установки количества бараньего масла, температуры бараньего масла и температуры жарки на медианы и использования комплексной оценки в качестве индекса для построения однофакторной диаграммы влияния одного фактора (рис. 1). Повышение температуры жарки сначала увеличивало общий балл, а затем уменьшало его (рис. 1). Температура бараньего масла оказала незначительное влияние на общую оценку. Количество бараньего масла было основным значимым фактором, повлиявшим на изменение совокупного балла, и по мере увеличения количества содержание имело тенденцию к снижению.

Чтобы помочь лучше понять результаты, прогнозируемые модели представлены на рисунке 2 в виде 3D-графиков поверхности отклика. С точки зрения наклона поверхности отклика, чем больше значимость эффекта взаимодействия между факторами, тем пологий наклон и тем менее значим эффект. Эллипс в форме контурной линии указывает на сильное взаимодействие между факторами, тогда как круг указывает на обратное. Поверхность отклика количества бараньего масла и температуры жарки была круче по сравнению с другими тестируемыми факторами, а контурные линии, как правило, были более эллиптическими (см. рис. 2C, D), что указывает на то, что взаимодействие между этими двумя факторами было более значительным; напротив, взаимодействия между другими факторами не были значимыми (см. рис. 2A, B, E, F).

Оптимальная технология переработки бараньего масла EF была выбрана следующим образом: количество бараньего масла 15%; температура бараньего масла 120 °C; и температура жарки 189 °C. Учитывая, что температура не может быть очень точно отрегулирована в реальной работе, значение температуры указывается как переменная ±10 °C. Таким образом, итоговые параметры были следующими: количество бараньего масла 15%; баранье масло температурой 120 °C ± 10 °C; и температура жарки 189 °C ± 10 °C. Оптимальный процесс был следующим: нагревание бараньего масла при 120 °C ± 10 °C, добавление сырого EF, обжаривание его на слабом огне (189 °C ± 10 °C) до равномерного блеска, а также удаление и охлаждение. На каждые 100 кг EF следует использовать 15 кг бараньего масла (рафинированного масла). Используя эти условия, были проведены три параллельных эксперимента, и полученные баллы составили 0,96, 0,97 и 0,94 (RSD% = 1,60%), что указывает на стабильные и выполнимые условия. Типичные хроматограммы ВЭЖХ сырых, обработанных и смешанных эталонных веществ EF показаны на рисунке 3.

Испытание влияния обработки на эмбриональное развитие рыбок данио-рерио
Рыбки данио-рерио вылупились в молодь при 72 hpf. Развитие каждого органа было в основном завершено. Тела рыб оставались прозрачными, и их было легко уложить на бок на предметное стекло. Формы органов было легко наблюдать и идентифицировать при просмотре под микроскопом. В холостой контрольной группе не было смерти или отравления органов в течение периода введения. По сравнению с контрольной группой, при концентрации препарата 100 мкг/мл явных отклонений не было обнаружено в группе сырой ФВ (S) и обработанной группе (P) при 72 hpf. При 96 hpf и позже неполнота плавательного пузыря и потеря плавательного пузыря были более распространены у молоди рыб в сырой группе, но были редки у молоди рыб в обработанной группе. При концентрации лекарственного средства 150 мкг/мл у молоди рыб в сырой группе наблюдались явные деформации позвоночника, деформации искривления тела, отек перикарда и деформация печени при 72 hpf, но эти изменения были редки у молоди рыб в обработанной группе, а степень тератогенности была слабее, чем в сырой группе. При концентрации препарата 200 мкг/мл вся молодь рыб в сырой группе погибала, а у молоди рыб в обработанной группе появлялась очевидная тератогенность. При концентрации препарата 250 мкг/мл небольшое количество рыбок данио-рерио выжило в обработанной группе. Результаты микроскопического исследования рыбок данио-рерио показаны на рисунке 4.

Показатели смертности рыбок данио-рерио в сырых и обработанных травах Epimedium зависели от концентрации и времени введения. Соотношение время-доза-смертность показано на рисунке 5. Результаты смертности рыбок данио-рерио показали, что через 24 часа после введения (48 hpf) при концентрации препарата 200 мкг / мл все рыбки данио-рерио в группе сырого лекарства умерли, тогда как смертность в обработанной группе составила всего 6,67%. Через 48 ч после введения ФВ (72 л..ф.) концентрация, вызвавшая гибель всех рыбок данио-рерио в группе сырых лекарств, составляла 200 мкг/мл, а концентрация, вызвавшая гибель всех рыбок данио-рерио в обработанной группе, составляла 500 мкг/мл. Рассчитана медиана летальной концентрации двух экспериментальных групп при 72 hpf. Результаты показали, что LC₅₀ (см. рис. 6) составлял 151,3 мкг/мл в сырой группе (S) и 219,8 мкг/мл в обработанной группе (P).

Рисунок 1: Одномерный анализ. На рисунке показана однофакторная диаграмма влияния. A - однофакторный результат количества бараньего (сало) масла; B - однофакторный результат температуры бараньего (сало) масла; а C - однофакторный результат температуры жарки. С повышением температуры жарки общий балл сначала увеличивается, а затем уменьшается. Температура бараньего масла мало влияет на счет. Количество бараньего масла было основным значимым фактором, повлиявшим на изменение комплексной оценки, и содержание показало тенденцию к снижению с увеличением количества бараньего масла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Поверхность отклика и контурная диаграмма влияния взаимодействий различных факторов на комплексную оценку . (A) На этом рисунке показан 3D-график поверхности отклика взаимодействия между количеством бараньего масла и температурой. (B) На этом рисунке показан контурный график взаимодействия между количеством бараньего масла и температурой. (C) На этом рисунке показан 3D-график поверхности отклика взаимодействия между количеством бараньего масла и температурой обработки. (D) На этом рисунке показан контурный график взаимодействия между дозировкой бараньего масла и температурой обработки. (E) На этом рисунке показан 3D-график поверхности отклика взаимодействия между количеством бараньего масла и температурой обработки. (F) На этом рисунке показана контурная диаграмма взаимодействия между количеством бараньего масла и температурой обработки. Результат показывает, что поверхность отклика количества бараньего масла и температуры жарки была крутой, чем другие тестируемые параметры, а контурные линии, как правило, были эллиптическими (см. C, D), что указывает на то, что взаимодействие между этими двумя факторами было значительным, тогда как взаимодействие между другими факторами не было значимым (см. A, B, E, F). Термин салового масла, используемый на рисунке, относится к бараньему маслу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: ВЭЖХ-хроматограммы сырых, обработанных и смешанных эталонных веществ EF. (A) На этом рисунке показана хроматограмма ВЭЖХ смешанного эталонного вещества. (B) На этом рисунке показана хроматограмма ВЭЖХ сырого Epimedii folium. (C) На этом рисунке показана хроматограмма ВЭЖХ продуктов переработки Epimedii folium. Эти три рисунка демонстрируют, что содержимое бизнес-аналитики в необработанном EF является низким, в то время как после обработки оно увеличивается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Микрофотографии рыбок данио. На этом рисунке показаны микрофотографии рыбок данио. (A) На этом рисунке показаны результаты наблюдения за рыбками данио-рерио под микроскопом в пустой группе. (B) На этом рисунке показаны результаты наблюдения за рыбками данио-рерио под микроскопом в сырой группе. (C) На этом рисунке показаны результаты наблюдения за рыбками данио-рерио под микроскопом в обработанной группе. В холостой контрольной группе не было смерти или отравления органов в течение периода введения. При концентрации препарата EF 150 мкг / мл очевидные деформации позвоночника, искривление тела, отек перикарда и деформация печени наблюдались у молоди рыб в сырой группе при 72 hpf, тогда как эти изменения были редкими у молоди рыб в обработанной группе, а степень тератогенности была слабее, чем в сырой группе. При концентрации препарата 200 мкг/мл вся молодь рыб в сырой группе погибала, а в обработанной группе появлялась очевидная тератогенность. При концентрации препарата 250 мкг/мл в обработанной группе выжило лишь небольшое количество рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Зависимость времени дозирования, дозы и смертности. На этом рисунке показана зависимость времени дозирования, дозы и смертности. (A) На этом рисунке показана зависимость времени дозирования, дозы и смертности в сырой группе. (B) На этом рисунке показана зависимость времени дозирования, дозы и смертности обработанной группы. n = 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Диаграмма LC₅₀ сырой и переработанной EF. Показана диаграмма LC₅₀ сырой и переработанной EF. Были рассчитаны медианные летальные концентрации двух экспериментальных групп при 72 hpf. LC₅₀ составлял 151,3 мкг/мл в сырой группе (S) и 219,8 мкг/мл в группе обработки (P). n = 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Дизайн эксперимента и результаты метода поверхности отклика Бокса-Бенкена в 17 группах экспериментов. В таблице 1 показаны 17 групп экспериментов, разработанных с помощью метода поверхности «дизайн-отклик» Бокса-Бенкена, и их комплексные результаты оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Переменные, используемые в конструкции Бокса-Бенкена. Здесь перечислены независимые и зависимые переменные, а также их низкий, средний и высокий уровни. Конструкция Box-Behnken позволила определить наиболее влиятельные факторы в обработке EF, при этом количество бараньего масла (A) (15%-35%), температура бараньего масла (B) (50 °C-120 °C) и температура жарки (C) (80 °C-300 °C) являются влияющими факторами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Уравнения регрессии и линейные диапазоны химических составляющих ЭФ. Результаты уравнения регрессии и линейного диапазона химического состава EF показывают, что между каждой из концентраций икариина, EA, EB, EC и BI и их хроматографическими пиковыми площадями была хорошая линейность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Частота испытаний на восстановление образцов. Средние показатели восстановления икариина, ЭА, ЭБ, ЭК и BI составили 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% и 100,94% соответственно, а значения RSD% составили 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% и 1,47% соответственно. Результаты показывают, что точность метода была подходящей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 5: Коэффициенты регрессии прогнозируемой квадратичной модели. Значение P модели составляло P < 0,01, что указывает на то, что модель была значимой. Значение P отсутствия соответствия составило P > 0,05, что указывает на то, что отсутствие соответствия не было значительным. Значение R² составило 0,9300, что указывает на то, что модель хорошо подходит, а погрешность невелика, поэтому модель подходит для анализа и прогнозирования влияния химического состава EF, обжаренного с бараньим маслом. Кроме того, А2 и^D2 оказывали существенное влияние на содержание продуктов переработки (Р < 0,01). Влияние A и C одноградусного члена^{и C 2} члена второго порядка на общий балл было значительным. Одностепенный член B, второй порядок A 2, B² и все элементы взаимодействия не оказали существенного влияния на общую оценку. Анализ значения P показал, что из экспериментальных параметров наибольшее влияние на комплексную оценку оказывало количество бараньего масла (А), за которым следовала температура жарки (С), а затем температура бараньего масла (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Независимые переменные и определение их уровней
Технология обработки EF описана только в издании Китайской фармакопеи 2020 года и местных спецификациях обработки китайских лекарств, опубликованных 26 провинциями, муниципалитетами и автономными районами по всей стране¹. Описание включает в себя следующие шаги: взять баранье масло и нагреть его до плавления, добавить кусочки EF, обжарить на медленном огне, пока оно не станет однородным и блестящим, вынуть его и дать остыть. Кроме того, на каждые 100 кг эпимедиума используется 20 кг (сокращенно 20%) бараньего масла (рафинированного). Однако параметры процесса обработки EF не уточняются. Среди независимых переменных в этом эксперименте три ключевых фактора могут быть количественно определены в процессе производства: дозировка бараньего масла, температура бараньего масла и температура жарки. Диапазон значений должен быть установлен в соответствии с приведенным выше описанием. Из результатов предварительного теста видно, что при количестве бараньего масла 15% листья EF можно равномерно покрыть бараньим маслом. Когда дозировка превышает 35%, бараньего масла становится слишком много. Наконец, диапазон количества бараньего масла должен составлять 15% -35%. Когда температура достигает 50 °C, баранье масло тает. Когда температура достигает >120 °C, баранье масло начинает дымиться, и температура становится слишком высокой. Поэтому температурный диапазон бараньего масла должен составлять 50 °C -120 °C. В издании Китайской фармакопеи 2020 года указано, что EF следует жарить на медленном огне. Медленный огонь не должен превышать 200 °C, а температура жарки должна колебаться от 80 °C до 300 °C.

Комплексная оценка
Во время обработки эпимедиума гликозидные связи разрываются, и гликозидные компоненты превращаются в более низкие гликозидные компоненты. Определение содержания продуктов, обработанных ЭФ, в издании Китайской фармакопеи 2020 года основано на определении общего содержания икариина, ЭА, ЭБ и ЭК в исходных лекарственных материалах, а отдельно в качестве показателя указан моногликозидный компонент БИ. В этом эксперименте общий вес икариина, ЭА, ЭБ и КЭ в обработанных ФВ составлял 50%, вес БИ составлял 50%, и на основе этих значений была установлена комплексная оценка.

Методология поверхности отклика (RSM) — это статистический метод определения оптимальных параметров процесса и решения многомерных задач. В этом методе разумный экспериментальный дизайн используется для получения определенных данных с помощью экспериментов, а многомерное уравнение квадратичной регрессии используется для вывода функциональной зависимости между факторами и реакциями²². Обычно используются унифицированный дизайн и оптимизация процесса ортогонального проектирования, но точность их испытаний невысока, а математическая модель не очень предсказуема. Математическая модель, лежащая в основе RSM, очень предсказуема. RSM требует меньшего количества экспериментов и более коротких циклов, что не только может устранить проблемы, связанные с традиционной математической статистикой, но также может прояснить взаимосвязи между факторами и реакциями²³. RSM концептуализирует реакцию системы как функцию одного или нескольких факторов и использует графические методы для отображения этой функциональной взаимосвязи, чтобы помочь пользователю выбрать оптимальные условия в экспериментальном дизайне с помощью интуитивного визуального наблюдения. Эти преимущества привели к широкому использованию этого метода в химической промышленности²⁴, биологической инженерии, пищевой промышленности²⁵, фармацевтической промышленности и препаратах ТКМ.

Хотя RSM может идентифицировать функциональную взаимосвязь между ответами (индексами, подлежащими исследованию) и факторами (независимыми переменными), не все эксперименты подходят для оптимизации поверхности отклика, поскольку не всегда существует сильная функциональная связь между ответом и факторами. RSM часто получает непрерывные соотношения функций, которые требуют, чтобы все факторы были непрерывными переменными. Тем не менее, не все факторы, подлежащие исследованию, являются непрерывными переменными или оказывают существенное влияние на значения отклика в начале экспериментального дизайна. Чтобы сократить количество экспериментов и повысить точность моделирования поверхности отклика, скрининг необходим для выбора значимых факторов и определения их уровней с помощью факторного дизайна, однородного дизайна или ортогонального дизайна перед проведением методологии проектирования поверхности отклика. Самым большим преимуществом методологии поверхности отклика является то, что после того, как модель правильно установлена, значение отклика при любой комбинации условий может быть предсказано, а функциональная взаимосвязь может быть видна более интуитивно и визуально через поверхность 3D-отклика. Эта визуализация очень помогает исследователям в поиске оптимальных условий обработки²⁶.

В этом исследовании использовался принцип дизайна RSM Бокса-Бенкена для разработки 17 комбинированных экспериментов с использованием комплексной оценки химического содержания EF в качестве значения ответа. Наконец, наилучшие результаты оптимизации процессов были получены с помощью регрессионного анализа. Технология обработки была оптимизирована следующим образом: нагревание бараньего масла при 120 °C ± 10 °C, добавление сырого EF, обжаривание его на слабом огне (189 °C ± 10 °C) до равномерного блеска, а затем удаление и охлаждение. На каждые 100 кг EF следует использовать 15 кг бараньего масла (рафинированного масла). Наши результаты показали, что процесс EF был стабильным, надежным и воспроизводимым. Кроме того, были проанализированы взаимодействия факторов, и взаимодействие между количеством бараньего масла и температурой жарки, но не взаимодействие между другими факторами, было значительным. Данное исследование показало, что дизайн поверхности отклика, как метод анализа взаимодействий между факторами и взаимосвязей между факторами и значениями их поверхностей отклика, позволяет оптимизировать условия обработки за короткий период времени с минимальным количеством экспериментов. Выбранные факторы в этом исследовании были ключевыми факторами, выявленными в эксперименте по однофакторному скринингу, и их уровни были определены в предварительном эксперименте. Тестовые образцы соответствовали характеристикам метода поверхности отклика, поэтому в исследовании удалось использовать методологию поверхности отклика для создания прогностической модели. Результаты экспериментов могут служить ориентиром для улучшения качества и однородности обрабатываемых EF.

Эмбрионы рыбок данио-рерио используются в качестве модельных организмов в области генетики развития, потому что они прозрачны, развиваются in vitro и их легко наблюдать²⁷. Обычно используемые индикаторы токсичности рыбок данио-рерио в исследованиях токсичности развития включают,^{среди прочего,} эмбриональную смертность, частоту пороков развития эмбрионов, отек желточного мешка, образование пигмента, конденсацию яиц, удлинение хвоста, морфологию головы и формирование сегмента тела. По сравнению с методами оценки токсичности для млекопитающих, специфичность эмбрионов рыбок данио-рерио для обнаружения токсичности соединений составляет 70-80%, а чувствительность превышает 80%¹⁸. Ton et ^al.29 обнаружили, что точность оценки токсичности для развития нетератогенных соединений с эмбрионами рыбок данио-рерио составила 75%. Тератогенные соединения оценивались здесь со 100% точностью. Несмотря на то, что ТКМ обладает характеристиками сложных компонентов и неясных органов-мишеней токсичности, эмбрионы рыбок данио-рерио все еще могут использоваться в качестве экспериментальной модели животных для точной и быстрой оценки токсичности развития. He et ^al.30 обнаружили, что эмодин влияет на выживаемость и скорость вылупления эмбрионов рыбок данио, вызывая изгиб туловища и отек желточного мешка. Chen et ^al.31 обнаружили, что мускон вызывает отек перикарда эмбриона рыбок данио, искривление позвоночника и отек желточного мешка. He et ^al.32 обнаружили, что Arnebiae Radix оказывает летальное воздействие на рыбок данио-рерио на всех стадиях развития, а 1,0 мг/л Arnebiae Radix ингибирует эмбриональное развитие, что приводит к уменьшению количества сомитов, деформациям хвоста, изгибу тела и снижению меланина у эмбрионов рыбок данио.

Для изучения влияния сырой и обработанной ФВ на развитие эмбрионов рыбок данио-рерио в этом исследовании был проведен эксперимент по токсичности развития эмбрионов рыбок данио. Данные показали, что значения LC₅₀ составляли 151,3 мкг/мл для сырой группы (S) и 219,8 мкг/мл для обработанной группы (P). Наблюдение за телами рыбок данио-рерио в каждой экспериментальной группе через микроскоп показало очевидную степень тератогенности рыбок данио-рерио в сырой группе. Большинство рыб показали различную степень тератогенности, включая деформацию позвоночника, деформацию искривления тела, отек перикарда, неполноту плавательного пузыря или деформацию печени, и эти наблюдения были редкими в обработанной группе. Эти эксперименты показали, что токсичность EF была значительно снижена после обработки, что позволяет предположить, что обработка может снизить токсичность лекарств для людей. Результаты эксперимента служат ориентиром для повышения клинической безопасности лекарственных препаратов ЭФ, обработанных бараньим маслом.

Традиционная китайская медицина предполагает, что функция почек тесно связана с ростом, развитием и размножением человеческого тела³³. В древних книгах традиционной китайской медицины записано, что почка является костным мозгом организма. Почка хранит эссенцию, а костный мозг находится в полости кости, чтобы питать кость. При дефиците почечной эссенции костный мозг уменьшается³⁴. Традиционная китайская медицина тонизирования почечной ян может лечить поясничную слабость, остеопороз, импотенцию, преждевременную эякуляцию и холодовое бесплодие матки³⁵. EF является одним из репрезентативных лекарственных материалов для тонизирования почечной ян. Современные фармакологические исследования показали, что ФВ оказывает очевидное влияние на костную систему, иммунную систему, репродуктивную систему, сердечно-сосудистую систему и нервную систему, а также оказывает противоопухолевое действие³⁶. С точки зрения активности на костную систему, икариин³⁷ может улучшать уровень сывороточного_Е2 у крыс с овариэктомией и повышать экспрессию мРНК ERβ в костной ткани крыс с овариэктомией. Синтез ERβ увеличивается, тем самым улучшая биологический эффект ER, ослабляя костную резорбционную активность остеокластов и усиливая костеобразование остеобластов. Изменения в резорбции костной ткани больше, чем отрицательный баланс костного метаболизма. Эпимедин А может улучшать микроструктуру кости и маркеры обновления костной ткани в сыворотке крови у мышей модели остеопороза, ингибируя образование, дифференцировку и резорбцию остеокластов и играя роль в защите кости³⁸. Эпимедин С обладает очевидной антиостеопорозной активностью, главным образом с точки зрения увеличения костной массы и улучшения трабекулярной микроструктуры, что в конечном итоге увеличивает прочность костей³⁹. Другие исследования показали, что эпимедин B⁴⁰ и баохуозид I⁴¹ обладают антиостеопорозной активностью.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа поддерживается Бизнес-проектом фундаментальных научных исследований Чунцинской академии традиционной китайской медицины (номер проекта: jbky20200013), Проектом руководства по стимулированию производительности научно-исследовательских институтов Чунцина (номер проекта: cstc2021jxjl 130025) и Проектом строительства ключевой дисциплины Комиссии по здравоохранению Чунцина по переработке китайской Materia Medica.