בפרוטוקול זה, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש של Epimedii folium (EF) עברה אופטימיזציה על ידי יישום מתודולוגיית תכנון-תגובה ניסיונית של Box-Behnken, וההשפעה של EF גולמי וממוטב המופק במים על התפתחות עוברית של דגי זברה נחקרה באופן ראשוני.

כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל- Epimedii folium (EF) יש היסטוריה ברפואה ובמזון בת > 2,000 שנה. מבחינה קלינית, EF מעובד עם שמן כבש משמש לעתים קרובות כתרופה. בשנים האחרונות התרבו בהדרגה הדיווחים על סיכוני בטיחות ותגובות שליליות של מוצרים המשתמשים ב-EF כחומר גלם. עיבוד יכול לשפר ביעילות את הבטיחות של TCM. על פי תיאוריית TCM, עיבוד שמן כבש יכול להפחית את הרעילות של EF ולשפר את ההשפעה המחזקת שלו על הכליות. עם זאת, קיים מחסור במחקר שיטתי והערכה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF. במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken כדי למטב את הפרמטרים העיקריים של טכנולוגיית העיבוד על ידי הערכת התוכן של רכיבים מרובים. התוצאות הראו כי הטכנולוגיה האופטימלית לעיבוד שמן כבש של EF הייתה כדלקמן: חימום שמן הכבש ב 120 ° C ± 10 ° C, הוספת EF גולמי, מוקפץ אותו בעדינות ל 189 ° C ± 10 ° C עד שהוא מבריק באופן שווה, ולאחר מכן להסיר אותו מגניב. על כל 100 ק"ג של EF, יש להשתמש ב-15 ק"ג שמן כבש. הרעילות והטרטוגניות של תמצית מימית של EF מעובד של שמן גולמי ושמן כבש הושוו במודל התפתחותי של עוברים של דגי זברה. התוצאות הראו כי קבוצת העשבים הגולמי הייתה בעלת סיכוי גבוה יותר לגרום לעיוותים בדגי זברה, וריכוז ה-EF הקטלני החצי מקסימלי שלה היה נמוך יותר. לסיכום, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש האופטימלית הייתה יציבה ואמינה, עם חזרתיות טובה. במינון מסוים, התמצית המימית של EF הייתה רעילה להתפתחות עוברים של דגי זברה, והרעילות הייתה חזקה יותר עבור התרופה הגולמית מאשר עבור התרופה המעובדת. התוצאות הראו כי עיבוד שמן כבש הפחית את הרעילות של EF גולמי. ממצאים אלה יכולים לשמש לשיפור האיכות, האחידות והבטיחות הקלינית של EF מעובד בשמן כבש.

Epimedii folium (EF) הוא העלים המיובשים של Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., או Epimedium koreanum Nakai. EF יכול לשמש לטיפול אוסטאופורוזיס, תסמונת גיל המעבר, גושים בשד, יתר לחץ דם, מחלת לב כלילית, ומחלות אחרות¹. כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל-EF יש היסטוריה ברפואה ובמזון של יותר מ-2,000 שנה. בשל מחירו הנמוך והשפעתו יוצאת הדופן של חיטוב הכליות, הוא נמצא בשימוש נרחב בתרופות ובמזון בריאות. EF מעובד על ידי הקפצה עם שמן כבש, תהליך שתואר לראשונה בתורת עיבוד ליי גונג שנכתבה על ידי ליי שיאו בתקופת ליו סונג². היעילות של EF גולמי ו-EF מוקפץ שונה לגמרי. EF גולמי בעיקר מפיג שיגרון, בעוד EF מוקפץ מחמם את הכליות כדי לחזק יאנג³. כיום, EF נמצא בשימוש נרחב כחומר גלם בתרופות ומזון בריאות; ישנם 399 תרופות פטנט סיניות רשומות, תשעה מזונות בריאות מיובאים, ו 455 מזונות בריאות מקומיים עם EF כחומר גלם⁴. חומר מרפא זה יש לקוחות פוטנציאליים יישום גדול. עם זאת, בשנים האחרונות התרבו הדיווחים על תופעות לוואי ופגיעה בכבד האנושי שנגרמו על ידי מזון בריאות ותרופות פטנט סיניות המשתמשות ב-EF כחומר גלם, ומחקרי רעילות קשורים ^5,6,7 דיווחו כי ל-EF כחומר גלם יש סיכוני בטיחות פוטנציאליים.

עיבוד רפואי סיני מתייחס לטכניקות פרמצבטיות שיכולות להפחית או לחסל ביעילות את הרעילות ולשפר את הבטיחות של TCMs. שיטת העיבוד המסורתית של EF היא הקפצה עם שמן כבש, אשר מפחית את הרעילות של EF ומגביר את השפעתו של חימום הכליות וקידום יאנג⁸. שיטת עיבוד זו כלולה בפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד שונים¹. התהליך של EF מוגדר רק כדלקמן: על כל 100 ק"ג של EF, 20 ק"ג שמן שפיר (מזוקק) מתווסף, והוא נורה בעדינות עד אחיד ומבריק¹. אין פרמטרים קפדניים של שיטת עיבוד EF בתקנים לעיל, ולכן מפרטי עיבוד מקומיים לא אוחדו כדי לספק עקביות. לכן, זה יהיה שימושי לנהל מחקר שיטתי של תהליך EF. במאמר זה, שיטת משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken שימשה לאופטימיזציה של טכנולוגיית העיבוד של EF.

התכנון הניסיוני של Box-Behnken הוא שיטה המשמשת בדרך כלל לאופטימיזציה של הגורמים בתהליך. ניתן למטב את פרמטרי החילוץ על ידי קביעת הקשר הפונקציונלי בין גורמים המתאימים למשוואות רגרסיה מרובות לבין ערכי אפקט. לאחרונה, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקר מיצוי TCM ^5,6,7 ועיבוד 9,10,11. מחקרים שונים דיווחו על שיטות הכנת TCM הכוללות עיבוד מלח, עיבוד יין והקפצה בעקבות עיצוב Box-Behnken, כגון Psoraleae fructus ¹² מעובד במלח, Cnidii fructus¹³ מעובד יין, ו Cinnamomi ramulus¹⁴ קלוי. שיטה זו צמצמה את זמן הבדיקה, דיוק בדיקה גבוה, והיא מתאימה לבדיקות מרובות גורמים ורב-שכבתיים. השיטה פשוטה יותר משיטת בדיקת התכנון האורתוגונלי ומקיפה יותר משיטת התכנון האחיד¹⁵. הקשרים המתקבלים יכולים לקבוע את הערך החזוי של כל נקודת בדיקה בטווח הבדיקה, וזה יתרון גדול. מודל דג זברה יכול לשמש כדי לבדוק אם EF הוא פחות רעיל לאחר עיבוד.

במחקרי רעילות TCM, למודל דגי הזברה יש את היתרונות הכפולים של התפוקה הגבוהה של ניסויים בתאים ואת הדמיון לניסויים במכרסמים¹⁶. מודל זה מאופיין בגודלו הקטן, קצב השרצה גבוה, מחזור רבייה קצר וקלות הרבייה. ניתן להשתמש במודל בניסויים סינכרוניים בקנה מידה גדול בצלחות תרבית תאים, ומינון התרופה הניסיונית קטן, מחזור הניסוי קצר, העלות נמוכה, וכל תהליך הניסוי קל לצפייה ולתפעול¹⁷. עוברי דגי זברה הם שקופים ומתפתחים במהירות. לכן, את הרעילות ואת ההשפעות הטרטוגניות של תרופות על רקמות הקרביים בשלבים התפתחותיים שונים ניתן לראות ישירות תחת מיקרוסקופ¹⁸. ההומולוגיה הגנטית בין דגי זברה לבני אדם היא גבוהה עד 85%¹⁸. מסלול העברת האותות של דגי זברה דומה לזה של בני אדם¹⁸. המבנה הביולוגי והתפקוד הפיזיולוגי של דגי הזברה דומים מאוד לאלה של יונקים¹⁸. לכן, מודל דגי זברה לבדיקות סמים יכול לספק חיות ניסוי אמינות וישימות באופן מלא לבני אדם¹⁹.

במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken כדי למטב את הכמות והטמפרטורה של שמן כבש ואת טמפרטורת הטיגון המשמשת בטכנולוגיית עיבוד EF, עם התוכן של icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C ו- baohuoside I כמדדי הערכה. מודל דגי הזברה שימש לחקירה ראשונית של ההשפעה של תמצית מים EF על התפתחות עוברית של דגי זברה לפני ואחרי עיבוד כדי להעריך את השפעת ההנחתה של העיבוד על EF.

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים נערכו באישור ועדת האתיקה של הניסויים של מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית (מספר תעודת סקירת אתיקה של חיות מעבדה: ZJS2022-03).

1. קביעת המרכיבים הביו-אקטיביים

הערה: המין ששימש במחקר זה היה Epimedium sagittatum, והדגימות נאספו במחוז פנגדו, צ'ונגצ'ינג. הדגימה זוהתה כחלק יבש מעל פני הקרקע של E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) מקסים. על ידי חוקרי המכון לרפואה ביולוגית, מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית.

1. הכן את פתרון מוצר הבקרה על ידי שקילה מדויקת של הכמות המתאימה של כל חומר ייחוס, כלומר, icariin, epimedin A (EA), epimedin B (EB), epimedin C (EC), ו baohuoside I (BI), באמצעות איזון אנליטי אלקטרוני, ולהמיס מתנול. באמצעות אלה, הכן תמיסת מלאי ייחוס מעורבת המכילה 381.61 מיקרוגרם/מ"ל איקריאין, 124.14 מיקרוגרם/מ"ל EA, 110.24 מיקרוגרם/מ"ל EB, 1091.75 מיקרוגרם/מ"ל EC ו-184.98 מיקרוגרם/מ"ל BI.
2. הכן את פתרון מוצר הבדיקה על ידי ריסוק EF דרך מסננת מס '3. מניחים כ-0.2 גרם (באמצעות איזון אנליטי אלקטרוני) של EF כתוש לתוך בקבוק ארלנמאייר עם פקק, מוסיפים 20 מ"ל אתנול מדולל, ולאחר מכן אולטרסאונד בהספק של 400 ואט ובתדר 50 קילוהרץ למשך שעה אחת. נערו היטב, ועברו דרך מסנן קרום 0.22 מיקרומטר כדי לקבל את פתרון הבדיקה.
3. בצע את הכרומטוגרפיה באופן הבא. השתמש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודת C₁₈ בממדים של 4.6 מ"מ x 250 מ"מ וקוטר פנימי של 5 מיקרומטר. השתמש אצטוניטריל כשלב A נייד ומים אולטרה-טהורים כשלב נייד B. השתמש בפרמטרי האלוציה ההדרגתיים הבאים: 0-30 דקות, 24% A עד 26% A; 30-31 דקות, 26% A עד 45% A; 31-45 דקות, 45% A עד 47% A. השתמש באורך גל גילוי של 220 ננומטר (עבור הגלאי שבו נעשה שימוש, ראה טבלת חומרים). שמור על טמפרטורת העמודה על 30°C ועל המהירות הנוכחית על 1.0 מ"ל/דקה, והשתמש בגודל דגימה של 10 μL.
4. כדי לחקור את הקשר הליניארי, השתמש בפתרון הייחוס המעורב כמו בשלב 1.1 מדולל פעמיים, 4 פעמים, 8 פעמים, 16 פעמים ו- 32 פעמים, עבור icariin, EA, EB, EC ו- BI, בהתאמה. השתמש אצטוניטריל כשלב A נייד ומים אולטרה-טהורים כשלב B נייד.
5. השתמש בפרמטרים הבאים של הדרגתיות elution: 0-30 דקות, 24% A עד 26% A; 30-31 דקות, 26% A עד 45% A; 31-45 דקות, 45% A עד 47% A. השתמש באורך גל גילוי של 220 ננומטר (עבור הגלאי שבו נעשה שימוש, ראה טבלת חומרים). שמור על טמפרטורת העמודה ב- 30 ° C ואת המהירות הנוכחית על 1.0 מ"ל / דקה והשתמש בגודל דגימה של 10 μL. לבסוף, תעד את אזורי השיא. שרטט את הרגרסיה הליניארית עם ריכוז הייחוס (ציר x, μg/mL) כאבסקיסה ואת אזור השיא (ציר y) כאורדינטה באמצעות תוכנה מקצועית (ראה טבלת חומרים).
6. בצע את הבדיקה המדויקת על ידי מדידת תמיסת הבקרה המעורבת שש פעמים רצופות על ידי HPLC באמצעות התנאים הכרומטוגרפיים המוצגים בשלב 1.3. רשום את זמן הגילוי ואת אזורי השיא של כל הרכב כימי, וחשב את סטיות התקן היחסיות (RSD) של אזורי השיא כדי להעריך את הדיוק (יכולת השחזור) באמצעות הנוסחה הבאה:
   RSD% = סטיית תקן (SD)/ממוצע אריתמטי של תוצאות מחושבות (X) x 100%
7. כדי לבצע את בדיקת השחזור, יש לשקול במדויק את אבקת ה-EF ולהכין שישה חלקים של תמיסת מוצר הבדיקה במקביל בהתאם לשיטה בשלב 1.2. נושא את הפתרונות המוכנים ל- HPLC בתנאים הכרומטוגרפיים המוצגים בשלב 1.3. רשום את זמני השמירה ואזורי השיא של כל הרכב כימי וחשב את הכמויות של כל תרכובת מעקומה סטנדרטית (אזורי שיא לעומת ריכוזים). חשב את ה- RSD% כמפורט לעיל.
8. כדי לבצע את בדיקת היציבות, אחסן את תמיסות הבדיקה בטמפרטורת החדר, ומדוד את תכולתן בשיטת HPLC המתוארת בשלב 1.3 ב- 0 שעות, שעתיים, 4 שעות, 8 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות לאחר ההכנה כדי להעריך את היציבות. רשום את זמני השמירה ואזורי השיא של כל הרכב כימי וחשב את ה- RSD% של אזורי השיא כמפורט לעיל.
9. כדי לבצע את בדיקת התאוששות הדגימה, לשקול 0.2 גרם של אבקת EF לתוך בקבוק Erlenmeyer פקק עבור שישה עותקים משוכפלים. הוסף כמות מתאימה של תמיסת הייחוס (כמות חומר הייחוס שנוספה למדגם שווה ל -100% מהתוכן הידוע של המדגם) והכן את פתרון הבדיקה בהתאם לשיטה המוצגת בשלב 1.2.
10. הזריקו את הדגימות לכרומטוגרף ונתחו בהתאם לתנאים הכרומטוגרפיים בשלב 1.3. רשום את אזורי השיא וחשב את ממוצע ההתאוששות ואת ערכי ה- RSD% כמפורט להלן:
    שיעור שחזור דגימה ספייק = (תוכן דגימה קוצנית - תוכן דגימה)/כמות דגימה x 100%

2. אופטימיזציה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF באמצעות מתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken

1. בחר את הפרמטרים העיקריים בעיבוד EF, כגון כמות שמן הכבש (A; 15%-35%), טמפרטורת שמן הכבש (B; 50-120 ° C) וטמפרטורת הטיגון (C; 80-300 ° C), כגורמים משפיעים. השתמש בציונים המקיפים של תוכן icariin, EA, EB, EC ו- BI כאינדקסי הערכה. אחוז שמן הכבש כאן הוא אחוז המסה.
2. השתמש בתוכנה לניתוח משטח תגובה (ראה טבלת חומרים) כדי לתכנן את ניסויי משטח התגובה Box-Behnken, לחקור את משטח התגובה הריבועי ולבנות מודל פולינומי מסדר שני. בחרו בעיצוב Box-Behnken החדש והגדירו את האפשרות 'גורמים מספריים' על 3; הגדר את הגורמים A, B ו- C. לחץ על המשך. הגדר את האפשרות תגובות ל- 1 (שהיה הציון המקיף). לחץ על המשך כדי להשלים את העיצוב. סה"כ תוכננו 17 ניסויים (ראו טבלה 1).
   הערה: עבור המשתנים הבלתי תלויים והתלויים, יחד עם רמתם הנמוכה, האמצעית והגבוהה, ראה טבלה 2.
3. לעבד את ה-EF בהתאם לפרמטרים הספציפיים בטבלה 1; לדוגמה, בהזמנה מספר 1, שקלו שמן כבש מזוקק כ-15% V/V, ולאחר מכן חממו ל-50°C כדי להמיס אותו. מוסיפים את ה-EF הגולמי לכבש המומס, מקפיצים על אש עדינה (190°) עד שהוא מבריק באופן שווה, ואז מסירים ומצננים. ביצע 17 פעולות ניסיוניות. בסך הכל התקבלו בעבודה זו 17 קבוצות של מוצרים מעובדים EF.
   הערה: שמן כבש מוצק בטמפרטורת החדר (25°C) ונמס לנוזל בעת חימום. שמן כבש במצב נוזלי יכול לשמש כמעורר.
4. הכן את פתרונות הבדיקה של המוצרים המעובדים בהתאם לשיטה המתוארת בשלב 1.2. לאחר מכן, נתח אותם באמצעות HPLC בהתאם לתנאים הכרומטוגרפיים המתוארים בשלב 1.3. רשום את זמני השמירה ואזורי השיא של כל הרכב כימי, וחשב את תכולת האיקרין, EA, EB, EC ו- BI בכל פתרון בדיקה מול עקומת תקן חיצונית. השתמש בנוסחת חישוב הניקוד המקיפה להלן כדי לחשב את הציונים המקיפים של 17 קבוצות הניסוי:
   ציון כולל = Z/Z_{מקסימום} × 0.5 + BI/BI_מרבי × 0.5
   כאשר Z הוא סכום התוכן icariin, EA, EB ו- EC; Z_max הוא הערך המרבי של סכום התוכן icariin, EA, EB ו- EC ב- 17 קבוצות הניסוי; BI הוא תוכן ה-BI; ו- BI_max הוא הערך המרבי של תוכן BI ב- 17 קבוצות הניסוי.
5. ייבא את תוצאות הניקוד המקיפות עבור 17 קבוצות הניסויים לתוכנת ניתוח הנתונים (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח את נתוני הניסוי. תחת פריטי ההערכה, בחר באפשרות סדר התהליך הריבועי ובאפשרות סוג מודל פולינומי.

3. בדיקת השפעת העיבוד על התפתחות עוברית של דגי זברה

1. הכנת דוגמאות
   1. כתשו את ה-EF הגולמי והמעובד דרך מסננת מס' 3 (ראו טבלת חומרים). ל-100 גרם מכל דגימת EF, יש להוסיף 1,000 מ"ל מים טהורים במיוחד. משרים את ה-EF למשך שעה וחצי, מרתיחים את המים פעמיים למשך 30 דקות כל אחד, ולאחר מכן מסננים עם נייר סינון.
   2. מערבבים את התסנין ומרכזים את הדגימה בחימום. הוסף מים טהורים במיוחד לנפח סופי של 100 מ"ל כדי לקבל את פתרונות המלאי המעובדים EF (PEF, 1 גרם/מ"ל) וה-EF הגולמי (CEF,1 גרם/מ"ל). למדוד את כמות התרופה הגולמית בכל פתרון מלאי.
   3. הניחו תמיסות מלאי של 1 מ"ל, 1.5 מ"ל, 2.5 מ"ל, 5 מ"ל ו-7.5 מ"ל בצלוחיות נפחיות של 10 מ"ל, ולאחר מכן הוסיפו מים אולטרה-טהורים לנפח כדי להכין את תמיסות הבדיקה בריכוזים של 100 מ"ג/מ"ל, 150 מ"ג/מ"ל, 200 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/מ"ל, 500 מ"ג/מ"ל ו-750 מ"ג/מ"ל למחקר רעילות העוברים של דגי הזברה.
      הערה: הריכוזים של תמיסות הבדיקה הוכנו על ידי הפניה לספרות הרלוונטית ^20,21 ועל ידי ביצוע ניסויים מקדימים כדי לתת את שיפוע הריכוז פי¹⁰ המשמש בטוקסיקולוגיה רגילה. CEF היה מדגם לא מעובד, ו- PEF היה מדגם שהוכן עם טכנולוגיית העיבוד הטובה ביותר המתוארת בסעיף 2.
2. גידול דגי זברה וטיפול בעוברים²¹
   1. התאימו דגי זברה מסוג בר (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה מבוקרת למשך יומיים, שמרו אותם באקווריום זורם ב-pH 7.0-7.4 והאכילו אותם פעמיים ביום.
      הערה: עיכוב היווצרות המלנין בדגי זברה הושג על ידי הוספת 1-פניל-2-תיאוריאה בריכוז של 0.003% (מסה/נפח) למדיום התרבית, אשר שמר על גופם שקוף לתצפית מורפולוגית.
   2. בחרו דגי זברה פוריים בוגרים בערב והפרידו ביניהם באמצעות מבוכים בתיבות הזדווגות. הסירו את המבוכים למחרת בבוקר, והניחו לדגים להשריץ במשך 30 דקות. אסף את הביציות המופרות עם טפטפת כל 15 דקות. בסך הכל נאספו 520 עוברים בריאים מסוג בר. שמור את עוברי דגי הזברה באינקובטור ב 28.5 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
   3. הקצו באופן אקראי את העוברים הבריאים ב-24 שעות לאחר ההפריה (hpf) ל-13 קבוצות, ויחד עם קבוצת ביקורת אחת, השרו בנפרד 10 מ"ל מכל אחד מהפתרונות הבאים בצלחת תרבית: PEF: 100 מיקרוגרם/מ"ל, 150 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 750 מיקרוגרם/מ"ל; CEF: 100 מיקרוגרם/מ"ל, 150 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 750 מיקרוגרם/מ"ל. התייחס לקבוצת הבקרה הריקה עם המדיום כפתרון. כל קבוצה הכילה 40 עוברים במחקר זה.
      הערה: ההרכב הבינוני הוא 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 0.25 mM Na 2 HPO 4,0.45 mM KH 2 PO 4, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO 4 ו- ₄ mM NaHCO₃.
   4. תרבית את דגי הזברה באינקובטור טמפרטורה קבועה עד 120 כיפות. ספרו את מספר הזחלים המתים מדי יום, צפו במורפולוגיית האיברים העיקרית של הזחלים בכל קבוצת ניסוי תחת סטריאומיקרוסקופ (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר, ראו טבלת חומרים), וחשבו את ריכוז מחצית המוות (LC₅₀) של דגי זברה ב-72 HPF באמצעות תוכנת ניתוח נתונים (ראו טבלת חומרים).

תוצאות חקירה מתודולוגית
נצפה קשר ליניארי בין ריכוז איקרין, EA, EB, EC, BI ואזורי שיא כרומטוגרפיים (ראה טבלה 3). ערכי ה-RSD% (n = 6) של אזורי השיא הכרומטוגרפיים של icariin, EA, EB, EC ו-BI היו 0.28%, 1.22%, 0.65%, 1.67% ו-1.06%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שהדיוק של מדידות HPLC היה טוב. ערכי RSD% (n = 6) של התוכן של icariin, EA, EB, EC ו- BI היו 1.59%, 1.46%, 1.86%, 2.29% ו- 0.98%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שלשיטה הייתה יכולת חזרה טובה. ערכי ה-RSD% (n = 6) של אזורי השיא של icariin, EA, EB, EC ו-BI בדגימות היו 1.49%, 1.96%, 1.42%, 0.96% ו-0.81%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שתמיסת הדגימה הייתה יציבה תוך 24 שעות. שיעורי ההתאוששות הממוצעים של icariin, EA, EB, EC ו- BI היו 99.98%, 100.14%, 100.09%, 100.75% ו- 100.94%, בהתאמה, וערכי RSD% היו 0.56%, 0.78%, 0.84%, 1.10% ו- 1.47%, בהתאמה (ראה טבלה 4). תוצאות אלה מראות כי דיוק השיטה עמד בדרישות.

תוצאות הניסוי לעיל הראו כי השיטה האנליטית סיפקה תוצאות בעלות דיוק, יכולת שחזור ודיוק מעולים והיו מקובלות לניתוח האיכות של המוצרים המעובדים על ידי EF.

אופטימיזציה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש של EF על ידי יישום מתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken
ביצענו התאמה של רגרסיה פולינומית ריבועית לנתונים הנ"ל כדי לקבל את המודל הבא: Y = 0.86 − 0.11 x A + 0.025 x B − 0.078 x C − 0.023 x A x B − 0.037 x A x C + 0.037 x B x C − 0.045 x A 2 + 2.5 x ^10-3 x B 2 − 0.14 x C². ניתוח השונות נתן ערך של P < 0.01, מה שמצביע על כך שהמודל היה משמעותי. ערך P של חוסר ההתאמה היה P > 0.05, מה שמצביע על כך שחוסר ההתאמה לא היה משמעותי. ערך R² היה 0.9300, מה שמצביע על כך שההתאמה של המודל הייתה טובה, והשגיאה הייתה קטנה. ניתן היה להשתמש במודל זה כדי לנתח ולחזות את ההשפעה של תכולת ההרכב הכימי של ה-EF המוקפץ בשמן כבש. בנוסף, A 2 ו- D² השפיעו על תוכן המוצרים המעובדים, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (P < 0.01). ההשפעות של A ו-C של המונח החד-מעמדי ו-C² של המונח מסדר שני על הציון הכולל היו משמעותיות. המונח בדרגה אחת B, הטווח השני A 2, B² וכל פריטי האינטראקציה לא השפיעו באופן משמעותי על הציון המקיף. ניתוח ערכי P הראה כי מבין הפרמטרים הניסיוניים, לכמות שמן הכבש (A) הייתה ההשפעה הגדולה ביותר על הציון המקיף, ואחריו טמפרטורת הטיגון (C), ולאחר מכן טמפרטורת שמן הכבש (B). התוצאות לעיל מוצגות בטבלה 5.

התוכנה שימשה לקביעת כמות שמן הכבש, טמפרטורת שמן הכבש וטמפרטורת הטיגון לחציון ולשימוש בציון המקיף כמדד כדי לצייר דיאגרמת השפעה חד-גורמית של גורם אחד (איור 1). העלאת טמפרטורת הטיגון הגדילה תחילה את הציון הכולל ולאחר מכן הורידה אותו (איור 1). לטמפרטורת שמן הכבש הייתה השפעה זניחה על הציון המקיף. כמות שמן הכבש הייתה הגורם המשמעותי העיקרי שהשפיע על השינוי בניקוד המקיף, וככל שהכמות גדלה, התכולה ירדה כלפי מטה.

כדי לעזור להבין טוב יותר את התוצאות, המודלים החזויים מוצגים באיור 2 כתרשימי שטח של תגובה תלת-ממדית. מבחינת שיפוע משטח התגובה, ככל שהשפעת האינטראקציה בין הגורמים גדולה יותר, כך השיפוע עדין יותר וההשפעה פחות משמעותית. אליפסה בצורת קו מתאר מציינת אינטראקציה חזקה בין גורמים, ואילו עיגול מציין את ההפך. משטח התגובה של כמות שמן הכבש וטמפרטורת הטיגון היה תלול יותר בהשוואה לגורמים האחרים שנבדקו, וקווי המתאר נטו להיות אליפטיים יותר (ראו איור 2C,D), מה שמצביע על כך שהאינטראקציה בין שני הגורמים האלה הייתה משמעותית יותר; לעומת זאת, יחסי הגומלין בין גורמים אחרים לא היו מובהקים (ראו איור 2A,B,E,F).

טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש האופטימלית של EF נבחרה כדלקמן: כמות שמן כבש של 15%; טמפרטורת שמן כבש של 120 מעלות צלזיוס; וטמפרטורת טיגון של 189 מעלות צלזיוס. בהתחשב בכך הטמפרטורה לא ניתן לשלוט במדויק מאוד בפעולה בפועל, ערך הטמפרטורה מוגדר כמשתנה ±10 ° C. לכן, הפרמטרים הסופיים היו כדלקמן: כמות שמן כבש של 15%; טמפרטורת שמן כבש של 120 °C (75 °F) ± 10 °C (75 °F); וטמפרטורת טיגון של 189 מעלות צלזיוס ± 10 מעלות צלזיוס. התהליך האופטימלי היה כדלקמן: חימום שמן הכבש ב 120 ° C ± 10 ° C, הוספת EF גולמי, טיגון אותו עם אש עדינה (189 ° C ± 10 ° C) עד שהוא מבריק באופן שווה, והסרה וקירור. על כל 100 ק"ג של EF, יש להשתמש ב-15 ק"ג שמן כבש (שמן מזוקק). בתנאים אלה נערכו שלושה ניסויים מקבילים, והציונים שהתקבלו היו 0.96, 0.97 ו-0.94 (RSD% = 1.60%), מה שמצביע על תנאים יציבים ואפשריים. כרומטוגרמות HPLC טיפוסיות של חומרי הייחוס הגולמיים, המעובדים והמעורבים של EF מוצגות באיור 3.

בדיקת השפעת העיבוד על ההתפתחות העוברית של דגי זברה
דג הזברה בקע לצעירים במהירות של 72 כ"ס. התפתחותו של כל איבר הושלמה ביסודה. גופי הדגים נותרו שקופים, וקל היה להניח אותם על צדם על מגלשת הזכוכית. צורות האיברים היו קלות לצפייה ולזיהוי כאשר צפו בהן תחת מיקרוסקופ. קבוצת הביקורת הריקה לא חוותה מוות או הרעלת איברים במהלך תקופת הניהול. בהשוואה לקבוצת הביקורת, בריכוז תרופתי של 100 מק"ג/מ"ל, לא נמצאו חריגות ברורות בקבוצת ה-EF הגולמי (S) ובקבוצת המעובד (P) ב-72 hpf. ב-96 כ"ס ואילך, חוסר שלמות שלפוחית השחייה ואובדן שלפוחית השחייה היו שכיחים יותר בדגים הצעירים בקבוצת הגולמיות, אך היו נדירים בדגים הצעירים בקבוצה המעובדת. בריכוז תרופתי של 150 מק"ג/מ"ל נצפו עיוותים ברורים בעמוד השדרה, עיוותים בעקמומיות הגוף, בצקת קרום הלב ועיוותים בכבד בדגים הצעירים בקבוצה הגולמית ב-72 hpf, אך שינויים אלה היו נדירים בדגים הצעירים בקבוצה המעובדת, ומידת הטרטוגניות הייתה חלשה יותר מזו של הקבוצה הגולמית. בריכוז סמים של 200 מק"ג/מ"ל מתו כל הדגים הצעירים בקבוצה הגולמית, וטרטוגניות ברורה הופיעה בדגים הצעירים בקבוצה המעובדת. בריכוז תרופה של 250 מק"ג/מ"ל, מספר קטן של דגי זברה שרדו בקבוצה המעובדת. תוצאות הבדיקה המיקרוסקופית של דגי הזברה מוצגות באיור 4.

שיעורי התמותה של דגי זברה בקבוצות צמחי האפימדיום הגולמי והמעובד היו תלויים בריכוז ובזמן הנטילה. הקשר בין מינון זמן לתמותה מוצג באיור 5. תוצאות התמותה מדגי זברה הראו כי 24 שעות לאחר מתן התרופה (48 hpf), בריכוז תרופה של 200 מיקרוגרם/מ"ל, מתו כל דגי הזברה בקבוצת התרופה הגולמית, בעוד התמותה בקבוצה המעובדת הייתה רק 6.67%. ב-48 שעות לאחר מתן EF (72 hpf), הריכוז שגרם למותם של כל דגי הזברה בקבוצת התרופות הגולמיות היה 200 מיקרוגרם/מ"ל, והריכוז שגרם למותם של כל דגי הזברה בקבוצה המעובדת היה 500 מיקרוגרם/מ"ל. הריכוז הקטלני החציוני של שתי קבוצות הניסוי עמד על 72 HPF. התוצאות הראו כי LC₅₀ (ראה איור 6) היה 151.3 מיקרוגרם / מ"ל בקבוצה הגולמי (S) ו 219.8 מיקרוגרם / מ"ל בקבוצה המעובדת (P).

איור 1: ניתוח חד-משתני. האיור מציג את דיאגרמת ההשפעה החד-גורמית. A היא התוצאה החד-פקטורית של כמות שמן הכבש (suet); B היא התוצאה החד-פקטורית של טמפרטורת שמן הכבש (סואט); ו-C היא התוצאה החד-גורמית של טמפרטורת הטיגון. עם עליית טמפרטורת הטיגון, הציון הכולל עולה תחילה ולאחר מכן יורד. לטמפרטורת שמן הכבש יש השפעה מועטה בלבד על הציון. כמות שמן הכבש הייתה הגורם המשמעותי העיקרי שהשפיע על השינוי בציון המקיף, והתכולה הראתה מגמת ירידה עם כמות הולכת וגדלה של שמן כבש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: משטח התגובה ותרשים קווי המתאר של השפעת אינטראקציות גורמים שונים על הציון המקיף. (A) איור זה מראה תרשים משטח תגובה תלת-ממדי של האינטראקציה בין כמות שמן הכבש לטמפרטורה. (B) איור זה מראה תרשים מתאר של האינטראקציה בין כמות שמן הכבש לטמפרטורה. (C) איור זה מציג תרשים משטח תגובה תלת-ממדי של האינטראקציה בין כמות שמן הכבש לטמפרטורת העיבוד. (D) איור זה מראה תרשים מתאר של האינטראקציה בין מינון שמן כבש וטמפרטורת עיבוד. (E) איור זה מציג תרשים משטח תגובה תלת-ממדי של האינטראקציה בין כמות שמן הכבש לטמפרטורת העיבוד. (F) איור זה מציג תרשים מתאר של האינטראקציה בין כמות שמן הכבש לטמפרטורת העיבוד. התוצאה מראה כי משטח התגובה של כמות שמן הכבש וטמפרטורת הטיגון היה תלול, בהשוואה לפרמטרים האחרים שנבדקו וקווי המתאר נטו להיות אליפטיים (ראו C,D), דבר המצביע על כך שהאינטראקציה בין שני גורמים אלה הייתה משמעותית, בעוד שהאינטראקציות בין גורמים אחרים לא היו מובהקות (ראו A,B,E, ו). המונח שמן סואט המשמש באיור מתייחס לשמן כבש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כרומטוגרמות HPLC של חומרי הייחוס הגולמיים, המעובדים והמעורבים של EF. (A) איור זה מראה את כרומטוגרמה HPLC של חומר הייחוס המעורב. (B) איור זה מראה את כרומטוגרמה HPLC של עלווה אפימדית גולמית. (C) איור זה מציג את כרומטוגרמה HPLC של מוצרים מעובדים Epimedii folium. שלוש תמונות אלה מדגימות כי תוכן ה- BI ב- EF גולמי נמוך, בעוד שהוא גדל לאחר העיבוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מיקרוגרפים של דגי זברה. איור זה מציג מיקרוגרפים של דגי הזברה. (A) איור זה מראה את התוצאות לתצפית של דגי הזברה תחת מיקרוסקופ בקבוצה הריקה. (B) איור זה מראה את התוצאות לתצפית של דגי הזברה תחת מיקרוסקופ בקבוצה הגולמית. (C) איור זה מציג את התוצאות לתצפית של דגי הזברה תחת מיקרוסקופ בקבוצה המעובדת. קבוצת הביקורת הריקה לא חוותה מוות או הרעלת איברים במהלך תקופת הניהול. בריכוז תרופת EF של 150 מק"ג/מ"ל נצפו עיוותים ברורים בעמוד השדרה, עקמומיות הגוף, בצקת קרום הלב ועיוות כבד בדגים הצעירים בקבוצה הגולמית ב-72 hpf, בעוד ששינויים אלה היו נדירים בדגים צעירים בקבוצה המעובדת, ומידת הטרטוגניות הייתה חלשה יותר מזו שבקבוצת הגולמיות. בריכוז תרופה של 200 מק"ג/מ"ל מתו כל הדגים הצעירים בקבוצה הגולמית, וטרטוגניות ברורה הופיעה בקבוצה המעובדת. בריכוז תרופה של 250 מק"ג/מ"ל, רק מספר קטן של דגי זברה שרדו בקבוצה המעובדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הקשר בין מינון למנה-תמותה. נתון זה מראה את הקשר בין מינון למינון ולתמותה. (A) איור זה מראה את יחסי המינון-זמן-מנה-תמותה של הקבוצה הגולמית. (B) איור זה מראה את הקשר בין מינון למינון ולתמותה של הקבוצה המעובדת. n = 40. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דיאגרמת LC₅₀ של EF גולמי ומעובד. דיאגרמת LC₅₀ של ה- EF הגולמי והמעובד מוצגת. חושבו הריכוזים הקטלניים החציוניים של שתי קבוצות הניסוי ב-72 HPF. LC₅₀ היה 151.3 מיקרוגרם/מ"ל בקבוצת הנפט הגולמי (S) ו-219.8 מיקרוגרם/מ"ל בקבוצת העיבוד (P). n = 40. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: תכנון הניסוי ותוצאות שיטת משטח התגובה Box-Behnken של 17 קבוצות הניסויים. טבלה 1 מציגה את 17 קבוצות הניסויים שתוכננו בשיטת משטח התכנון-תגובה Box-Behnken ואת תוצאות הניקוד המקיפות שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: משתנים המשמשים בעיצוב Box-Behnken. המשתנים הבלתי תלויים והתלויים מפורטים כאן יחד עם רמתם הנמוכה, האמצעית והגבוהה. תכנון Box-Behnken איפשר לזהות את הגורמים המשפיעים ביותר בעיבוד EF, כאשר כמות שמן הכבש (A) (15%-35%), טמפרטורת שמן הכבש (B) (50°C-120°C) וטמפרטורת הטיגון (C) (80°C-300°C) הם הגורמים המשפיעים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: משוואות רגרסיה וטווחים ליניאריים של המרכיבים הכימיים של EF. תוצאות משוואת הרגרסיה והטווח הליניארי של ההרכב הכימי EF מראות שהייתה ליניאריות טובה בין כל אחד מהריכוזים של איקרין, EA, EB, EC ו-BI לבין אזורי השיא הכרומטוגרפיים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: שיעורי בדיקות שחזור לדוגמה. שיעורי ההתאוששות הממוצעים של icariin, EA, EB, EC ו- BI היו 99.98%, 100.14%, 100.09%, 100.75% ו- 100.94%, בהתאמה, וערכי RSD% היו 0.56%, 0.78%, 0.84%, 1.10% ו- 1.47%, בהתאמה. התוצאות מראות כי דיוק השיטה היה מתאים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 5: מקדמי רגרסיה של המודל הריבועי החזוי. ערך P של המודל היה P < 0.01, מה שמצביע על כך שהמודל היה משמעותי. ערך P של חוסר ההתאמה היה P > 0.05, מה שמצביע על כך שחוסר ההתאמה לא היה משמעותי. ערך R² היה 0.9300, מה שמצביע על כך שההתאמה של המודל הייתה טובה, והשגיאה הייתה קטנה, ולכן המודל התאים לניתוח וחיזוי ההשפעה של תכולת ההרכב הכימי של EF מוקפץ בשמן כבש. בנוסף, A 2 ו- D² היו השפעות משמעותיות על התוכן של מוצרים מעובדים (P < 0.01). ההשפעות של A ו-C של המונח החד-מעמדי ו-C² של המונח מסדר שני על הציון הכולל היו משמעותיות. המונח בדרגה אחת B, הטווח השני A 2, B² וכל פריטי האינטראקציה לא השפיעו באופן משמעותי על הציון המקיף. ניתוח ערך P הראה כי מבין הפרמטרים הניסיוניים, לכמות שמן הכבש (A) הייתה ההשפעה הגדולה ביותר על הציון המקיף, ואחריו טמפרטורת הטיגון (C), ולאחר מכן הטמפרטורה של שמן הכבש (B). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

משתנים בלתי תלויים וקביעת רמתם
טכנולוגיית עיבוד EF מתוארת רק במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד הרפואה הסינית המקומיים שפורסמו על ידי 26 מחוזות, עיריות ואזורים אוטונומיים ברחבי המדינה¹. התיאור כולל את השלבים הבאים: לקיחת שמן כבש וחימום להמסתו, הוספת שברי EF, הקפצה באש איטית עד שהוא אחיד ומבריק, הוצאתו ונתונה לו להתקרר. בנוסף, 20 ק"ג (מקוצר כמו 20%) של שמן כבש (מזוקק) משמש עבור כל 100 ק"ג של אפימדיום. עם זאת, הפרמטרים של תהליך העיבוד של EF אינם מוגדרים. בין המשתנים הבלתי תלויים בניסוי זה, ניתן לכמת שלושה גורמים מרכזיים בתהליך הייצור: מינון שמן הכבש, טמפרטורת שמן הכבש וטמפרטורת הטיגון. יש להגדיר את טווח הערכים בהתאם לתיאור לעיל. מתוצאות הבדיקה הראשונית ניתן לראות כי כאשר כמות שמן הכבש היא 15%, ניתן לצפות את עלי ה-EF באופן שווה בשמן כבש. כאשר המינון עולה על 35%, יש יותר מדי שמן כבש. לבסוף, טווח כמות שמן הכבש צריך להיות 15%-35%. כאשר הטמפרטורה מגיעה 50 °C (75 °F), שמן כבש נמס. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל >120 מעלות צלזיוס, שמן הכבש מתחיל לעשן, והטמפרטורה גבוהה מדי. לכן, טווח הטמפרטורה של שמן כבש צריך להיות 50 °C (75 °F-120 °F). מהדורת הפרמקופיאה הסינית 2020 קובעת כי יש להקפיץ את EF באש איטית. האש האיטית לא תעלה על 200 מעלות צלזיוס, וטמפרטורת הטיגון צריכה לנוע בין 80 °C (80°C-300 °F).

ניקוד מקיף
במהלך העיבוד של אפימדיום, הקשרים הגליקוזידים נשברים, והרכיבים הגליקוזידים הופכים לרכיבים גליקוזידים נמוכים יותר. קביעת התוכן של מוצרים מעובדים EF במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית מבוססת על קביעת התוכן הכולל של icariin, EA, EB ו- EC בחומרים הרפואיים המקוריים, ורכיב מונוגליקוזיד, BI, מופיע בנפרד כאינדיקטור. בניסוי זה, המשקל הכולל של icariin, EA, EB ו- EC ב- EF המעובד היה 50%, משקל ה- BI היה 50%, והציון הכולל נקבע על סמך ערכים אלה.

מתודולוגיית משטח התגובה (RSM) היא טכניקה סטטיסטית לזיהוי פרמטרים אופטימליים של תהליך ופתרון בעיות מרובות משתנים. בטכניקה זו, תכנון ניסויי סביר משמש להשגת נתונים מסוימים באמצעות ניסויים, ומשוואת רגרסיה ריבועית רב-משתנית משמשת כדי לגזור קשר פונקציונלי בין הגורמים והתגובות²². עיצוב אחיד ואופטימיזציה של תהליכי תכנון אורתוגונליים נמצאים בשימוש נפוץ, אך דיוק הבדיקה שלהם אינו גבוה, והמודל המתמטי אינו צפוי במיוחד. המודל המתמטי העומד בבסיס RSM צפוי מאוד. RSM דורש פחות ניסויים ומחזורים קצרים יותר, אשר לא רק יכולים לחסל את הבעיות הקשורות לסטטיסטיקה מתמטית מסורתית, אלא גם יכולים להבהיר את היחסים בין גורמים ותגובות²³. RSM המשגה את תגובת המערכת כפונקציה של גורם אחד או יותר ומשתמשת בטכניקות גרפיות כדי להציג קשר פונקציונלי זה כדי לסייע למשתמש לבחור את התנאים האופטימליים בתכנון הניסוי על ידי תצפית חזותית אינטואיטיבית. יתרונות אלו הביאו לשימוש נרחב בשיטה זו בתעשייה הכימית²⁴, בהנדסה ביולוגית, בתעשיית המזון²⁵, בתעשיית התרופות ובתכשירים לרפואה סינית מסורתית.

למרות ש-RSM יכול לזהות את הקשר הפונקציונלי בין תגובות (אינדקסים שיש לחקור) לבין גורמים (משתנים בלתי תלויים), לא כל הניסויים מתאימים לאופטימיזציה של משטח התגובה מכיוון שלא תמיד יש קשר פונקציונלי חזק בין התגובה לגורמים. RSM משיג לעתים קרובות יחסי פונקציה רציפים, אשר דורשים שכל הגורמים יהיו משתנים רציפים. עם זאת, לא כל הגורמים שיש לחקור הם משתנים רציפים או בעלי השפעה משמעותית על ערכי התגובה בתחילת תכנון הניסוי. כדי להפחית את מספר הניסויים ולשפר את הדיוק של מידול משטח התגובה, יש צורך בסינון כדי לבחור את הגורמים המשמעותיים ולקבוע את רמתם באמצעות תכנון פקטוריאלי, עיצוב אחיד או תכנון אורתוגונלי לפני ביצוע מתודולוגיית תכנון משטח תגובה. היתרון הגדול ביותר של מתודולוגיית משטח התגובה הוא שברגע שהמודל מבוסס נכון, ניתן לחזות את ערך התגובה בכל שילוב של תנאים, וניתן לראות את הקשר הפונקציונלי באופן אינטואיטיבי וחזותי יותר דרך משטח התגובה התלת-ממדי. הדמיה זו מסייעת רבות לחוקרים במציאת תנאי העיבוד האופטימליים²⁶.

מחקר זה השתמש בעקרון התכנון Box-Behnken של RSM כדי לתכנן 17 ניסויים משולבים תוך שימוש בניקוד התוכן הכימי המקיף של EF כערך התגובה. לבסוף, התוצאות הטובות ביותר של אופטימיזציה של תהליכים התקבלו על ידי ניתוח רגרסיה. טכנולוגיית העיבוד הותאמה כדלקמן: חימום שמן הכבש ב 120 ° C ± 10 ° C, הוספת EF גולמי, טיגון אותו עם אש עדינה (189 ° C ± 10 ° C) עד שהוא מבריק באופן שווה, ולאחר מכן להסיר וקירור אותו. על כל 100 ק"ג של EF, יש להשתמש ב-15 ק"ג שמן כבש (שמן מזוקק). התוצאות שלנו הראו שתהליך ה-EF היה יציב, אמין וניתן לחזור עליו. בנוסף, נותחו אינטראקציות בין גורמים, והאינטראקציה בין כמות שמן הכבש לטמפרטורת הטיגון, אך לא האינטראקציות בין גורמים אחרים, הייתה משמעותית. מחקר זה הראה כי תכנון משטח התגובה, כשיטה לניתוח יחסי הגומלין בין גורמים והיחסים בין גורמים וערכי משטח התגובה שלהם, איפשר אופטימיזציה של תנאי העיבוד בתקופה קצרה עם מספר מינימלי של ניסויים. הגורמים שנבחרו במחקר זה היו גורמי המפתח שזוהו בניסוי הסינון החד-גורמי, ורמתם נקבעה בניסוי מקדים. דגימות הבדיקה תאמו את המאפיינים של שיטת משטח התגובה, ולכן המחקר היה מסוגל להשתמש במתודולוגיית משטח התגובה כדי לבסס מודל חיזוי. תוצאות הניסוי יכולות לספק התייחסות לשיפור האיכות והאחידות של ה- EF המעובד.

עוברי דגי זברה משמשים כאורגניזמי מודל בתחום הגנטיקה ההתפתחותית משום שהם שקופים, מתפתחים במבחנה וקלים לצפייה²⁷. מדדי רעילות נפוצים של דגי זברה במחקרי רעילות התפתחותית כוללים תמותה עוברית, שיעור מומים עובריים, בצקת שק חלמון, היווצרות פיגמנטים, עיבוי ביצים, הארכת זנב, מורפולוגיה של ראש והיווצרות מקטע גוף, בין היתר²⁸. בהשוואה לטכניקות הערכת רעילות של יונקים, הספציפיות של עוברי דגי זברה לזיהוי רעילות מורכבת היא 70%-80%, והרגישות עולה על 80%¹⁸. Ton et ^al.29 מצאו כי הדיוק של הערכת הרעילות ההתפתחותית של תרכובות לא טרטוגניות עם עוברים של דגי זברה היה 75%. תרכובות טרטוגניות הוערכו בדיוק של 100% כאן. למרות שלרפואה סינית מסורתית יש מאפיינים של רכיבים מורכבים ואיברי מטרה לא ברורים של רעילות, עוברים של דגי זברה עדיין יכולים לשמש כמודל ניסיוני של בעלי חיים להערכה מדויקת ומהירה של רעילות התפתחותית. הוא ועמיתיו ^{מצאו כי} אמודין השפיע על שיעורי ההישרדות והבקיעה של עוברי דגי זברה, וגרם לכיפוף תא המטען ולבצקת בשק החלמון. Chen et ^al.31 מצאו כי מוסקון גרם לבצקת פריקרדיאלית של עובר דג זברה, עקמומיות בעמוד השדרה ובצקת בשק החלמון. הוא ועמיתיו ^{מצאו כי} ל-Arnebiae Radix היו השפעות קטלניות על דגי זברה בכל שלבי ההתפתחות, ו-1.0 מ"ג/ליטר Arnebiae Radix עיכב את ההתפתחות העוברית, וכתוצאה מכך מספר הסומיטים, עיוותים בזנב, כיפוף הגוף וירידה במלנין בעוברים של דגי זברה.

כדי לחקור את ההשפעות של EF גולמי ומעובד על התפתחות עוברים של דגי זברה, נערך במחקר זה ניסוי רעילות התפתחותית של עוברים של דגי זברה. הנתונים הראו כי ערכי LC₅₀ היו 151.3 מיקרוגרם/מ"ל עבור הקבוצה הגולמי (S) ו-219.8 מיקרוגרם/מ"ל עבור הקבוצה המעובדת (P). התבוננות בגופי דגי הזברה בכל קבוצת ניסוי דרך מיקרוסקופ הראתה מידה ברורה של טרטוגניות של דגי זברה בקבוצה הגולמית. רוב הדגים הראו דרגות שונות של טרטוגניות, כולל עיוות בעמוד השדרה, עיוות עקמומיות הגוף, בצקת קרום הלב, חוסר שלמות בשלפוחית השחייה או עיוות בכבד, ותצפיות אלה היו נדירות בקבוצה המעובדת. ניסויים אלה הראו כי הרעילות של EF הופחתה באופן משמעותי לאחר העיבוד, דבר המצביע על כך שעיבוד יכול להפחית את רעילות התרופות בבני אדם. תוצאות הניסוי מספקות סימוכין לשיפור בטיחות התרופות הקליניות של EF מעובד בשמן כבש.

הרפואה הסינית המסורתית מציעה כי תפקוד הכליה קשור קשר הדוק לצמיחה, התפתחות ורבייה של גוף האדם³³ . הספרים העתיקים של הרפואה הסינית המסורתית רושמים כי הכליה היא מח העצם של הגוף. הכליה אוגרת מהות, והמח שוכן בחלל העצם כדי להזין את העצם. כאשר תמצית הכליה חסרה, מח העצם מופחת³⁴. הרפואה הסינית המסורתית של חיטוב יאנג הכליות יכולה לטפל בחולשה מותנית, אוסטאופורוזיס, אימפוטנציה, שפיכה מוקדמת ואי פוריות קרה ברחם³⁵. EF הוא אחד החומרים הרפואיים המייצגים לחיטוב יאנג הכליה. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הראו כי ל- EF יש השפעות ברורות על מערכת השלד, המערכת החיסונית, מערכת הרבייה, מערכת הלב וכלי הדם ומערכת העצבים, כמו גם השפעות אנטי סרטניות³⁶. מבחינת הפעילות על מערכת השלד, איקריין³⁷ יכול לשפר את רמת הסרום E₂ בחולדות שעברו כריתת שחלות ולהעלות את הביטוי של ERβ mRNA ברקמת העצם של חולדות שעברו כריתת שחלות. הסינתזה של ERβ מוגברת, ובכך משפרת את ההשפעה הביולוגית של ER, מחלישה את פעילות ספיגת העצם של אוסטאוקלסטים, ומשפרת את היווצרות העצם של אוסטאובלסטים. השינויים בספיגת העצם גדולים יותר מהאיזון השלילי של חילוף החומרים בעצם. אפימדין A יכול לשפר את מבנה העצם ואת סמני תחלופת העצם בסרום בעכברי מודל אוסטאופורוזיס על ידי עיכוב היווצרות אוסטאוקלסט, התמיינות וספיגת עצם וממלא תפקיד בהגנה על העצם³⁸. לאפימדין C פעילות אנטי-אוסטאופורוזיס ברורה, בעיקר במונחים של הגדלת מסת העצם ושיפור המיקרו-מבנה הטרבקולרי כדי להגדיל בסופו של דבר את חוזק העצם³⁹. מחקרים אחרים הראו כי אפימדין B⁴⁰ ו baohuoside I⁴¹ יש פעילות נגד אוסטאופורוזיס.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר המדעי הבסיסי של האקדמיה לרפואה סינית מסורתית של צ'ונגצ'ינג (מספר פרויקט: jbky20200013), פרויקט הנחיית תמריץ ביצועים של מוסדות המחקר המדעי של צ'ונגצ'ינג (מספר פרויקט: cstc2021jxjl 130025), ופרויקט בניית משמעת מפתח של ועדת הבריאות העירונית של צ'ונגצ'ינג של עיבוד Materia Medica הסיני.