이 프로토콜에서는 Box-Behnken 실험 설계-반응 표면 방법론을 적용하여 Epimedii folium(EF)의 양고기 오일 가공 기술을 최적화하고, 제브라피쉬 배아 발달에 대한 조잡하고 최적화된 물 추출 EF의 영향을 예비 조사했습니다.

중국 전통 의학(TCM)인 에피메디 폴리움(EF)은 2,000년 > 된 의학 및 식품 분야에서 역사를 가지고 있습니다. 임상적으로 양고기 기름으로 가공한 EF는 약으로 사용되는 경우가 많습니다. 최근에는 EF를 원료로 사용하는 제품의 안전 위험과 부작용에 대한 보고가 점차 증가하고 있습니다. 처리는 TCM의 안전성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다. TCM 이론에 따르면 양고기 기름 가공은 EF의 독성을 줄이고 신장에 대한 강장제 효과를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 EF 양고기 기름 가공 기술에 대한 체계적인 연구와 평가가 부족하다. 이 연구에서는 Box-Behnken 실험 설계-반응 표면 방법론을 사용하여 여러 구성 요소의 내용을 평가하여 처리 기술의 주요 매개변수를 최적화했습니다. 그 결과 EF의 최적 양고기 기름 가공 기술은 다음과 같다: 양고기 기름을 120°C ± 10°C에서 가열하고, 조잡한 EF를 첨가하고, 고르게 광택이 날 때까지 189°C ± 10°C로 부드럽게 볶은 다음, 그것을 제거하고 식힌다. EF 100kg 당 15kg의 양고기 기름을 사용해야합니다. 원유 및 양고기 기름 가공 EF의 수성 추출물의 독성 및 최기형성을 제브라피쉬 배아 발달 모델에서 비교했습니다. 결과는 조잡한 허브 그룹이 제브라 피쉬 기형을 일으킬 가능성이 더 높았으며 최대 치사 EF 농도가 더 낮았다는 것을 보여주었습니다. 결론적으로, 최적화 된 양고기 기름 가공 기술은 안정적이고 신뢰할 수 있으며 반복성이 우수했습니다. 특정 용량에서, EF의 수성 추출물은 제브라 피쉬 배아의 발달에 독성이 있었고, 독성은 가공 된 약물보다 생약에 대해 더 강했다. 결과는 양고기 기름 가공이 원유 EF의 독성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 양고기 기름 가공 EF의 품질, 균일성 및 임상적 안전성을 개선하는 데 사용될 수 있습니다.

Epimedii folium (EF)은 Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.)의 말린 잎입니다. Maxim., Epimedium pubescens Maxim., 또는 Epimedium koreanum Nakai. EF는 골다공증, 갱년기 증후군, 유방 덩어리, 고혈압, 관상 동맥 심장 질환 및 기타 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다¹. 중국 전통 의학(TCM)인 EF는 2,000년 이상의 의학 및 식품 분야의 역사를 가지고 있습니다. 저렴한 가격과 신장을 강화하는 현저한 효과로 인해 의약품 및 건강 식품에 널리 사용됩니다. EF는 양고기 기름으로 볶아서 가공하는데, 이는 Liu Song 시대²의 Lei Xiao가 쓴 Lei Gong Processing Theory에서 처음 설명한 과정입니다. 조잡한 EF와 볶은 EF의 효능은 상당히 다릅니다. 조잡한 EF는 주로 류머티즘을 없애는 반면, 볶은 EF는 신장을 따뜻하게 하여 양³을 강화합니다. 현재 EF는 의약품 및 건강 식품의 원료로 널리 사용되고 있습니다. 중국 특허 의약품 399개, 수입 건강식품 9개, EF를 원료로 하는 국내 건강식품 455개소가^있다. 이 의약 재료는 큰 응용 전망을 가지고 있습니다. 그러나 최근 EF를 원료로 사용하는 건강식품 및 중국 특허의약품으로 인한 이상반응 및 인체간 손상에 대한 보고가 증가하고 있으며, 관련 독성 연구 ^5,6,7에서는 EF를 원료로 하여 잠재적인 안전성 위험이 있다고 보고하고 있습니다.

한약 가공은 독성을 효과적으로 감소 또는 제거하고 TCM의 안전성을 향상시킬 수 있는 제약 기술을 말합니다. EF의 전통적인 가공 방법은 양고기 기름으로 볶는 것인데, 이는 EF의 독성을 감소시키고 신장을 따뜻하게하고 양을 촉진시키는 효과를 향상시킵니다⁸. 이 가공 방법은 중국 약전 및 다양한 가공 사양¹에 포함되어 있습니다. EF의 과정은 다음과 같이 지정됩니다 : EF 100kg 당 양수 20kg (정제 된)을 첨가하고 균일하고 광택이 날 때까지 온화하게 소성합니다¹. 위의 표준에는 엄격한 EF 처리 방법 매개 변수가 없으므로 일관성을 제공하기 위해 로컬 처리 사양이 통합되지 않았습니다. 따라서 EF 프로세스에 대한 체계적인 연구를 수행하는 것이 유용 할 것입니다. 본 논문에서는 EF의 처리 기술을 최적화하기 위해 Box-Behnken 실험 설계-반응 표면 방법을 사용하였다.

Box-Behnken 실험 설계는 공정의 요인을 최적화하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 추출 매개변수는 다중 회귀 방정식 피팅 요인과 효과 값 간의 기능적 관계를 설정하여 최적화할 수 있습니다. 최근에, 이 방법은 TCM 추출 5,6,7 및 처리 ^9,10,11을 연구하는데 널리 이용되고 있다. 다양한 연구에서 소금 가공 Psoraleae fructus¹², 와인 가공 Cnidii fructus¹³ 및 볶은 Cinnamomi ramulus¹⁴와 같은 Box-Behnken 설계에 따라 소금 가공, 와인 가공 및 볶음을 포함하는 TCM 준비 방법이 보고되었습니다. 이 방법은 테스트 시간을 단축하고 테스트 정확도를 높이며 다단계 및 다단계 테스트에 적합합니다. 이 방법은 직교 설계 시험 방법보다 간단하고 균일 설계 방법¹⁵보다 포괄적이다. 얻은 관계는 테스트 범위 내의 모든 테스트 포인트의 예측 값을 결정할 수 있으며 이는 큰 이점입니다. 제브라피쉬 모델은 처리 후 EF의 독성이 덜한지 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

TCM 독성 연구에서, 제브라피쉬 모델은 세포 실험의 높은 처리량과 설치류 실험과의 유사성이라는 두 가지 장점을 가지고 있다¹⁶. 이 모델은 작은 크기, 높은 산란 속도, 짧은 번식주기 및 번식 용이성이 특징입니다. 이 모델은 세포 배양 플레이트에서 대규모 동기 실험에 사용할 수 있으며 실험 약물 투여량이 적고 실험 주기가 짧으며 비용이 저렴하며 전체 실험 과정을 관찰하고 작동하기 쉽습니다¹⁷. 제브라피쉬 배아는 투명하고 빠르게 발달합니다. 그러므로, 상이한 발달 단계에서 내장 조직에 대한 약물의 독성 및 기형 유발 효과는 현미경으로 직접 관찰할 수 있다¹⁸. 제브라피쉬와 인간 사이의 유전자 상동성은 85%에 달합니다¹⁸. 제브라피쉬의 신호 전달 경로는 인간의 신호 전달 경로와 유사하다¹⁸. 제브라피쉬의 생물학적 구조와 생리적 기능은 포유류의 그것과 매우 유사하다¹⁸. 그러므로, 약물 실험을 위한 제브라피쉬 모델은 인간에게 신뢰할 수 있고 완전히 적용할 수 있는 실험 동물을 제공할 수 있다¹⁹.

본 연구에서는 Box-Behnken 설계-반응 표면 방법론을 사용하여 EF 가공 기술에 사용되는 양고기 기름의 양과 온도, 튀김 온도를 최적화하였으며, 이카리인, 에피메딘 A, 에피메딘 B, 에피메딘 C, 바오후오사이드 I의 함량을 평가 지표로 하였다. 제브라피쉬 모델은 EF에 대한 처리의 감쇠 효과를 평가하기 위해 처리 전후에 제브라피쉬 배아 발달에 대한 EF 물 추출물의 효과를 예비 적으로 탐색하는 데 사용되었습니다.

모든 동물 관련 실험은 충칭 중의학연구소 실험윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다(실험동물윤리심의인증서 번호: ZJS2022-03).

1. 생리 활성 성분의 결정

참고: 이 연구에 사용된 종은 Epimedium sagittatum이었고 샘플은 충칭 Fengdu County에서 수집되었습니다. 샘플은 E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) 격언. 충칭 중국 전통 의학 연구소 생물 의학 연구소의 연구원에 의해.

1. 전자 분석 저울을 사용하여 각 기준 물질, 즉 icariin, epimedin A(EA), epimedin B(EB), epimedin C(EC) 및 baohuoside I(BI)의 적정량을 정확하게 칭량하여 대조 제품 용액을 준비하고 메탄올에 용해시킵니다. 이를 사용하여 381.61 μg/mL 이카리인, 124.14 μg/mL EA, 110.24 μg/mL EB, 1091.75 μg/mL EC 및 184.98 μg/mL BI를 포함하는 혼합 기준 원액을 제조합니다.
2. EF를 3번 체로 분쇄하여 시험산물을 준비한다. 약 0.2g(전자 분석 저울 사용)의 분쇄된 EF를 마개가 있는 삼각 플라스크에 넣고 20mL의 묽은 에탄올을 첨가한 다음 400W 전력 및 50kHz 주파수에서 1시간 동안 초음파를 처리합니다. 잘 흔들어 0.22μm 멤브레인 필터를 통과시켜 시험액을 얻었다.
3. 다음과 같이 크로마토그래피를 수행합니다. 크기가 4.6mm x 250mm이고 내경이 5μm인 C₁₈ 컬럼의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용합니다. 아세토니트릴을 이동상 A로, 초순수를 이동상 B로 사용하십시오. 다음 구배 용출 파라미터를 사용하십시오: 0-30분, 24% A에서 26% A; 30-31분, 26% A 내지 45% A; 31-45분, 45% A - 47% A. 220nm의 감지 파장을 사용합니다(사용된 검출기의 경우 재료 표 참조). 컬럼 온도를 30°C로 유지하고 전류 속도를 1.0mL/분으로 유지하고 10μL의 샘플 크기를 사용합니다.
4. 선형 관계를 조사하기 위해 1.1단계와 같이 혼합된 기준 용액을 사용하여 이카리인, EA, EB, EC, BI에 대해 각각 2배, 4배, 8배, 16배, 32배로 희석한다. 아세토니트릴을 이동상 A로, 초순수를 이동상 B로 사용합니다.
5. 다음의 그래디언트 용출 파라미터 사용: 0-30분, 24% A - 26% A; 30-31분, 26% A 내지 45% A; 31-45분, 45% A - 47% A. 220nm의 감지 파장을 사용합니다(사용된 검출기의 경우 재료 표 참조). 컬럼 온도를 30°C로 유지하고 전류 속도를 1.0mL/분으로 유지하고 10μL의 샘플 크기를 사용합니다. 마지막으로 피크 영역을 기록합니다. 전문 소프트웨어를 사용하여 기준 농도(x축, μg/mL)를 가로좌표로, 피크 면적(y축)을 세로좌표로 하여 선형 회귀를 플로팅합니다( 재료 표 참조).
6. 단계 1.3에 나타낸 크로마토그래피 조건을 사용하여 HPLC로 혼합된 대조 용액을 6회 연속으로 측정하여 정밀 테스트를 수행합니다. 각 화학 성분의 검출 시간과 피크 면적을 기록하고 피크 면적의 상대 표준 편차(RSD)를 계산하여 아래 공식을 사용하여 정밀도(재현성)를 평가합니다.
   RSD% = 계산된 결과의 표준 편차(SD)/산술 평균(X) x 100%
7. 재현성 시험을 수행하기 위해, EF 분말을 정확하게 칭량하고, 단계 1.2의 방법에 따라 시험 생성물 용액의 6개 부분을 병렬로 제조한다. 준비된 용액을 단계 1.3에 제시된 크로마토그래피 조건 하에서 HPLC에 적용한다. 각 화학 성분의 머무름 시간과 피크 면적을 기록하고 표준 곡선(피크 면적 대 농도)에서 각 화합물의 양을 계산합니다. 위와 같이 RSD%를 계산합니다.
8. 안정성 시험을 수행하기 위해, 시험 용액을 실온에서 저장하고, 제조 후 0시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간에서 단계 1.3에 기재된 HPLC 방법으로 이들의 함량을 측정하여 안정성을 평가한다. 각 화학 성분의 머무름 시간과 피크 면적을 기록하고 위와 같이 피크 면적의 RSD %를 계산합니다.
9. 샘플 회수 테스트를 수행하려면 0.2g의 EF 분말을 마개가 있는 삼각 플라스크에 넣고 6회 반복합니다. 적절한 양의 기준 용액을 첨가하고(시료에 첨가된 기준 물질의 양은 시료의 알려진 함량의 100%에 해당함) 1.2단계에서 제시된 방법에 따라 시험 용액을 준비합니다.
10. 시료를 크로마토그래피에 주입하고 단계 1.3의 크로마토그래피 조건에 따라 분석한다. 피크 면적을 기록하고 아래와 같이 평균 회복 및 RSD% 값을 계산합니다.
    스파이크 샘플 회수율 = (스파이크 샘플 함량 - 샘플 함량)/샘플 양 x 100%

2. Box-Behnken 설계-반응 표면 방법론을 이용한 EF 양고기 기름 가공 기술 최적화

1. 양고기 기름의 양(A; 15%-35%), 양고기 기름 온도(B; 50-120 °C) 및 튀김 온도(C; 80-300 °C)와 같은 EF 가공의 주요 매개변수를 영향 요인으로 선택합니다. icariin, EA, EB, EC 및 BI 콘텐츠의 종합 점수를 평가 지표로 사용합니다. 여기서 양고기 기름의 비율은 질량 비율입니다.
2. 반응 표면 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 Box-Behnken 반응 표면 실험을 설계하고, 2차 반응 표면을 탐색하고, 2차 다항식 모델을 생성합니다. 새 Box-Behnken 설계를 선택하고 숫자 계수 옵션을 3으로 설정합니다. 요소 A, B, C를 설정합니다. 계속을 클릭합니다. 응답 옵션을 1(종합 점수)로 설정합니다. 계속 을 클릭하여 디자인을 완성합니다. 총 17개의 실험이 계획되었다( 표 1 참조).
   참고: 독립 변수와 종속 변수, 그리고 그 하위, 중간 및 상위 수준에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
3. 표 1의 특정 파라미터에 따라 EF를 처리하고; 예를 들어, 주문 번호 1의 경우 정제된 양고기 기름을 15% v/v로 칭량한 다음 50°C로 가열하여 녹입니다. 녹인 양고기에 조잡한 EF를 넣고 불(190°C)에서 고르게 윤기가 날 때까지 볶은 다음 꺼내 식힌다. 17 개의 실험 작업을 수행했습니다. 이 작업에서 총 17 개의 EF 가공 제품 그룹이 얻어졌습니다.
   알림: 양고기 기름은 실온(25°C)에서 고체이며 가열하면 액체로 녹습니다. 액체 상태의 양고기 오일은 부형제로 사용될 수 있습니다.
4. 단계 1.2에 기술된 방법에 따라 가공된 제품의 시험 용액을 준비한다. 이어서, 단계 1.3에 기술된 크로마토그래피 조건에 따라 HPLC를 사용하여 이들을 분석한다. 각 화학 성분의 머무름 시간과 피크 면적을 기록하고 외부 표준 곡선에 대해 각 테스트 용액의 icariin, EA, EB, EC 및 BI의 함량을 계산합니다. 아래의 종합 점수 계산 공식을 사용하여 17개 실험 그룹의 종합 점수를 계산하십시오.
   종합 점수 = Z/Z 최대 × 0.5 + BI/BI_최대 × 0.5
   여기서 Z는 icariin, EA, EB 및 EC 내용의 합계입니다. _Zmax 는 17개 실험군에서 이카리인, EA, EB 및 EC 함량의 합에 대한 최대값이다. BI는 BI 콘텐츠입니다. BI_max 는 17개 실험군에서 BI 콘텐츠의 최대값입니다.
5. 17개 실험 그룹에 대한 종합 채점 결과를 데이터 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)로 가져와 실험 데이터를 분석합니다. 평가 항목에서 2차 공정 순서 옵션과 다항식 모델 유형 옵션을 선택합니다.

3. 제브라피쉬 배아 발달에 대한 처리 효과 테스트

1. 시료 전처리
   1. 원유와 가공된 EF를 3번 체로 분쇄합니다( 재료 표 참조). 각 EF 샘플 100g에 초순수 1,000mL를 추가합니다. EF를 0.5 시간 동안 담그고 물을 각각 30 분 동안 두 번 끓인 다음 여과지로 걸러냅니다.
   2. 여과액을 결합하고 가열하여 샘플을 농축합니다. 최종 부피 100mL에 초순수를 첨가하여 처리된 EF(PEF, 1g/mL) 및 원유 EF(CEF, 1g/mL) 원액을 얻습니다. 각 원액에서 원료 약물의 양을 측정합니다.
   3. 10mL 부피 플라스크에 1mL, 1.5mL, 2.5mL, 5mL 및 7.5mL 원액의 분취액을 넣은 다음 부피에 초순수를 추가하여 제브라피쉬 배아 독성 연구를 위해 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL, 250mg/mL, 500mg/mL 및 750mg/mL 농도의 테스트 용액을 준비합니다.
      참고: 시험 용액의 농도는 관련 문헌 ^20,21을 참조하고 예비 실험을 수행하여 일반 독성학에서 사용되는¹⁰배 농도 구배를 수득하여 제조되었습니다. CEF는 처리되지 않은 샘플이었고, PEF는 섹션 2에 설명된 최상의 처리 기술로 제조된 샘플이었습니다.
2. 제브라피쉬 축산 및 배아 처리²¹
   1. 야생형 제브라 피쉬 ( 재료 표 참조)를 2 일 동안 제어 된 온도에서 적응시키고 pH 7.0-7.4의 통과 수족관에 보관하고 하루에 두 번 먹이십시오.
      참고: 제브라피쉬의 멜라닌 형성 억제는 배양 배지에 0.003%(질량/부피) 농도의 1-페닐-2-티오우레아를 첨가하여 형태학적 관찰을 위해 몸을 투명하게 유지함으로써 달성되었습니다.
   2. 저녁에 성체 비옥 야생형 제브라 피쉬를 선택하고 짝짓기 상자에 배플을 사용하여 분리하십시오. 다음날 아침 배플을 제거하고 물고기가 30분 동안 산란할 수 있도록 합니다. 15분마다 점적기로 수정란을 모았습니다. 총 520 개의 건강한 야생형 배아가 수집되었습니다. 제브라피쉬 배아를 28.5°C의 인큐베이터에서 24시간 동안 보관합니다.
   3. 수정 후 24시간(hpf)에 건강한 배아를 13개 그룹에 무작위로 할당하고 한 대조군과 함께 배양 접시에 다음 각 용액 10mL에 별도로 담근다: PEF: 100μg/mL, 150μg/mL, 200μg/mL, 250μg/mL, 500μg/mL, 750μg/mL; CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL. 블랭크 대조군을 배지로 용액으로 처리한다. 이 연구에는 각 그룹에 40개의 배아가 포함되어 있습니다.
      참고: 배지 조성은 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.45 mM_KH2PO4, 1.3mM_CaCl2, 1.0 mM_MgSO4, 및 4 mM NaHCO3이다.
   4. 최대 120hpf의 항온 인큐베이터에서 제브라피쉬를 배양합니다. 매일 죽은 유충의 수를 세고, 각 실험군에서 유충의 주요 장기 형태를 실체현미경(스케일 바 = 500μm, 재료 표 참조)으로 관찰하고, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 72hpf에서 제브라피쉬의 반감기 농도(LC₅₀)를 계산합니다(재료 표 참조).

방법론적 조사 결과
이카리인, EA, EB, EC, BI 및 크로마토그래피 피크 영역의 농도 사이의 선형 관계가 관찰되었다( 표 3 참조). 이카리인, EA, EB, EC 및 BI의 크로마토그래피 피크 영역의 RSD%값(n=6)은 각각 0.28%, 1.22%, 0.65%, 1.67%, 1.06%였으며, 이는 HPLC 측정의 정밀도가 양호함을 나타낸다. 이카리인, EA, EB, EC, BI의 함량의 RSD%값(n=6)은 각각 1.59%, 1.46%, 1.86%, 2.29%, 0.98%로 되어 반복성이 양호한 것을 알 수 있었다. 시료 중의 이카리인, EA, EB, EC, BI의 피크 면적의 RSD%값(n=6)은 각각 1.49%, 1.96%, 1.42%, 0.96%, 0.81%였으며, 이는 시료 용액이 24시간 이내에 안정함을 나타내는 것이다. 이카리인, EA, EB, EC, BI의 평균 회수율은 각각 99.98%, 100.14%, 100.09%, 100.75%, 100.94%였으며, RSD% 값은 각각 0.56%, 0.78%, 0.84%, 1.10%, 1.47%였다( 표 4 참조). 이 결과는 방법의 정확도가 요구 사항을 충족한다는 것을 보여줍니다.

위의 실험 결과는 분석 방법이 정밀도, 재현성 및 정확도가 우수하고 EF 가공 제품의 품질 분석에 적합한 결과를 제공하는 것으로 나타났습니다.

Box-Behnken 설계-반응 표면 방법론을 적용한 EF의 양고기 기름 가공 기술 최적화
Y = 0.86 − 0.11 x A + 0.025 x B − 0.078 x C − 0.023 x A x B − 0.037 x A x C + 0.037 x B x C − 0.045 x A 2 + 2.5 x ^{10-3 x B 2} − 0.14 x C². 분산 분석에서 P < 0.01의 값을 제공했는데, 이는 모형이 유의하다는 것을 나타냅니다. 적합 결여의 P 값은 P > 0.05로, 적합 결여가 유의하지 않다는 것을 나타낸다. R2 값은 0.9300으로, 모형의 적합치가 양호하고 오차가 작다는 것을 나타냅니다. 이 모델을 사용하여 양고기 기름으로 볶은 EF의 화학 조성 함량의 영향을 분석하고 예측하는 것이 가능했습니다. 또한, A2 및^D2는 가공품의 함량에 영향을 미쳤으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(P < 0.01). 1도 항의 A와 C와 2차 항의^C2가 종합 점수에 미치는 영향은 유의하였다. 1도 항 B, 2차 A2,^B2 및 모든 상호작용 항목은 종합 점수에 유의한 영향을 미치지 않았습니다. P 값을 분석 한 결과, 실험 매개 변수 중 양고기 기름 양 (A)이 종합 점수에 가장 큰 영향을 미쳤으며, 튀김 온도 (C), 양고기 기름 온도 (B)가 그 뒤를 이었다. 이상의 결과를 표 5에 나타내었다.

이 소프트웨어를 사용하여 양고기 기름 양, 양고기 기름 온도 및 튀김 온도를 중앙값으로 설정하고 종합 점수를 지표로 사용하여 한 요인의 단일 요인 영향 다이어그램을 그렸습니다(그림 1). 튀김 온도를 높이면 먼저 종합 점수가 증가한 다음 감소했습니다(그림 1). 양고기 기름 온도는 종합 점수에 무시할 수있는 영향을 미쳤습니다. 양고기 기름 양은 종합 점수의 변화에 영향을 미치는 주요 요인이었고, 양이 증가함에 따라 내용은 하향 추세를 보였다.

결과를 더 잘 이해할 수 있도록 예측된 모형은 그림 2 에 3D 반응 표면도에 표시됩니다. 반응 표면의 기울기 측면에서, 요인 간 교호작용 효과의 유의성이 클수록, 기울기가 완만해지고, 효과가 덜 유의합니다. 등고선 모양의 타원은 요인 간의 강한 교호작용을 나타내고 원은 그 반대를 나타냅니다. 양고기 기름의 양과 튀김 온도의 반응 표면은 다른 테스트 요인에 비해 더 가파르고 등고선은 더 타원형인 경향이 있으며( 그림 2C, D 참조), 이는 이 두 요인 간의 상호 작용이 더 중요하다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, 다른 요인 간의 상호 작용은 유의하지 않았습니다( 그림 2A, B, E, F 참조).

EF의 최적 양고기 기름 가공 기술은 다음과 같이 선택되었습니다 : 양고기 기름 양 15 %; 120°C의 양고기 기름 온도; 및 튀김 온도는 189°C이다. 실제 운전에서는 온도를 매우 정확하게 제어할 수 없다는 점을 감안하여 온도 값은 변수 ±10°C로 지정됩니다. 그러므로, 최종 파라미터는 다음과 같았다: 양고기 기름 양 15%; 120°C ± 10°C의 양고기 기름; 튀김 온도는 189°C ± 10°C이다. 최적의 공정은 다음과 같다: 양고기 기름을 120°C ± 10°C로 가열하고, 미정제 EF를 첨가하고, 고르게 광택이 날 때까지 온화한 불(189°C ± 10°C)로 볶고, 제거하고 냉각한다. EF 100kg 당 15kg의 양고기 기름 (정제 된 기름)을 사용해야합니다. 이러한 조건을 이용하여 3회의 병렬 실험을 실시하였으며, 얻어진 점수는 0.96, 0.97, 0.94(RSD%=1.60%)로 안정적이고 실현 가능한 조건을 나타냈다. EF의 원유, 가공 및 혼합 표준 물질의 일반적인 HPLC 크로마토그램은 그림 3에 나와 있습니다.

제브라 피쉬의 배아 발달에 대한 가공의 영향 시험
제브라피쉬는 72hpf의 속도로 새끼로 부화했습니다. 각 장기의 발달은 기본적으로 완료되었습니다. 물고기 몸은 투명하게 유지되었으며 유리 슬라이드에서 옆으로 눕히는 것이 쉬웠습니다. 장기의 모양은 현미경으로 볼 때 관찰하고 식별하기 쉬웠습니다. 블랭크 대조군은 투여 기간 동안 어떠한 사망 또는 장기 독성도 경험하지 않았다. 대조군과 비교하여 100μg/mL의 약물 농도에서 72hpf의 조잡한 EF 그룹(S)과 처리된 그룹(P)에서 뚜렷한 이상이 발견되지 않았습니다. 96 hpf 이상에서 수영 방광 불완전성과 수영 방광의 손실은 조잡한 그룹의 어린 물고기에서 더 흔했지만 가공 된 그룹의 어린 물고기에서는 드물었습니다. 150 μg/mL의 약물 농도에서 72 hpf의 원유 그룹의 어린 어류에서 명백한 척추 기형, 신체 만곡 기형, 심낭 부종 및 간 변형이 나타났지만 이러한 변화는 가공군의 어린 어류에서는 드물었고 기형 유발 정도는 조잡한 그룹보다 약했습니다. 200 μg/mL의 약물 농도에서, 원유 그룹의 모든 어린 물고기가 죽었고, 가공된 그룹의 어린 물고기에서 명백한 최기형성이 나타났다. 250μg/mL의 약물 농도에서 소수의 제브라피쉬가 처리군에서 생존했습니다. 제브라피쉬의 현미경 검사 결과는 그림 4에 나와 있습니다.

원유 및 가공 된 Epimedium 허브 그룹의 제브라 피쉬 사망률은 투여 농도와 시간에 따라 다릅니다. 시간-용량-사망률 관계는 그림 5에 나와 있습니다. 제브라피쉬 폐사 결과는 투여 후 24시간(48hpf)에 200μg/mL의 약물 농도에서 생약 그룹의 모든 제브라피쉬가 사망한 반면 처리군의 폐사율은 6.67%에 불과한 것으로 나타났습니다. EF 투여 후 48시간(72hpf)에서 생약군에서 모든 제브라피쉬의 사망을 초래한 농도는 200μg/mL였고, 처리군에서 모든 제브라피쉬의 사망을 초래한 농도는 500μg/mL였습니다. 72 hpf에서 두 실험군의 치사 농도 중앙값을 계산하였다. 그 결과 LC₅₀ ( 그림 6 참조)은 조군(S)에서 151.3μg/mL, 처리군(P)에서 219.8μg/mL인 것으로 나타났습니다.

그림 1: 일변량 분석. 그림은 단일 요인 영향 다이어그램을 보여줍니다. A는 양고기(suet) 오일의 양에 대한 단일 요인 결과입니다. B는 양고기 (suet) 기름의 온도에 대한 단일 요인 결과입니다. C는 튀김 온도의 단일 요인 결과입니다. 튀김 온도가 증가함에 따라 종합 점수가 먼저 증가한 다음 감소합니다. 양고기 기름 온도는 점수에 거의 영향을 미치지 않습니다. 양고기 기름의 양은 종합 점수의 변화에 영향을 미치는 주요 요인이었고, 양고기 기름의 양이 증가함에 따라 함량이 하락 추세를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 다양한 요인 상호 작용이 종합 점수에 미치는 영향에 대한 반응 표면 및 등고선도. (A) 이 그림은 양고기 기름의 양과 온도 사이의 교호작용에 대한 3D 반응 표면 플롯을 보여줍니다. (B) 이 그림은 양고기 기름의 양과 온도 사이의 상호 작용에 대한 등고선을 보여줍니다. (C) 이 그림은 양고기 기름 양과 가공 온도 사이의 상호 작용에 대한 3D 반응 표면 플롯을 보여줍니다. (D) 이 그림은 양고기 기름 복용량과 가공 온도 사이의 상호 작용에 대한 등고선을 보여줍니다. (E) 이 그림은 양고기 기름 양과 가공 온도 간의 상호 작용에 대한 3D 반응 표면 플롯을 보여줍니다. (F) 이 그림은 양고기 기름 양과 가공 온도 사이의 상호 작용에 대한 등고선을 보여줍니다. 결과는 양고기 기름의 양과 튀김 온도의 반응 표면이 다른 테스트 된 매개 변수보다 가파르고 등고선이 타원형인 경향이 있음을 보여줍니다 (C, D 참조).이 두 요인 간의 상호 작용은 유의한 반면 다른 요인 간의 상호 작용은 유의하지 않았습니다 (A, B, E, F). 그림에서 이용된 suet 기름 기간은 양고기 기름을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: EF의 원유, 가공 및 혼합 표준 물질의 HPLC 크로마토그램. (A) 이 그림은 혼합 기준 물질의 HPLC 크로마토그램을 보여줍니다. (B) 이 그림은 미정제 Epimedii folium의 HPLC 크로마토그램을 보여줍니다. (C) 이 그림은 Epimedii folium 가공 제품의 HPLC 크로마토그램을 보여줍니다. 이 세 그림은 원시 EF의 BI 콘텐츠가 낮지만 처리 후 증가한다는 것을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 제브라피쉬의 현미경 사진. 이 그림은 제브라 피쉬의 현미경 사진을 보여줍니다. (A) 이 그림은 블랭크 그룹에서 제브라피쉬를 현미경으로 관찰한 결과를 보여줍니다. (B) 이 그림은 제브라피쉬를 현미경으로 관찰한 결과를 보여줍니다. (C) 이 그림은 제브라피쉬를 처리군에서 현미경으로 관찰한 결과를 보여준다. 블랭크 대조군은 투여 기간 동안 어떠한 사망 또는 장기 독성도 경험하지 않았다. 150 μg/mL의 EF 약물 농도에서, 72 hpf의 조잡한 그룹의 어린 어류에서 명백한 척추 기형, 신체 만곡, 심낭 부종 및 간 변형이 관찰된 반면, 이러한 변화는 가공된 그룹의 어린 어류에서는 드물었고, 최기형성의 정도는 조잡한 그룹보다 약했습니다. 200 μg/mL의 약물 농도에서, 원유 그룹의 모든 어린 물고기가 죽었고, 가공된 그룹에서 명백한 최기형성이 나타났다. 250μg/mL의 약물 농도에서 소수의 제브라피쉬만이 처리된 그룹에서 생존했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 투여 시간-용량-사망률 관계. 이 그림은 투여 시간-투여량-사망률 관계를 보여줍니다. (A) 이 그림은 조군의 투여 시간-투여량-사망률 관계를 보여줍니다. (B) 이 그림은 처리된 그룹의 투여 시간-용량-사망률 관계를 보여줍니다. n = 40입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 원유 및 가공 EF의 LC₅₀ 다이어그램. 미정제 및 가공된 EF의 LC₅₀ 다이어그램이 도시되어 있다. 72 hpf에서 두 실험 그룹의 중간 치사 농도를 계산했습니다. LC₅₀ 은 조군(S)에서 151.3μg/mL, 처리군(P)에서 219.8μg/mL였습니다. n = 40입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 17개 실험 그룹의 실험 설계 및 Box-Behnken 반응 표면 방법 결과. 표 1 은 Box-Behnken 설계-반응 표면 방법에 의해 설계된 17개의 실험 그룹과 이들의 종합적인 점수 결과를 보여준다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: Box-Behnken 설계에 사용된 변수. 독립 변수와 종속 변수가 낮음, 중간 및 높음 수준과 함께 여기에 나열됩니다. Box-Behnken 설계는 양고기 기름 양 (A) (15 % -35 %), 양고기 기름 온도 (B) (50 °C-120 °C) 및 튀김 온도 (C) (80 °C-300 °C)를 영향 요인으로 삼아 EF 가공에서 가장 영향력있는 요인을 식별 할 수있었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3 : EF의 화학 성분의 회귀 방정식 및 선형 범위. 회귀 방정식의 결과와 EF 화학 조성의 선형 범위는 이카리인, EA, EB, EC 및 BI의 각 농도와 크로마토그래피 피크 영역 사이에 양호한 선형성이 있음을 보여줍니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 샘플 회수 테스트 속도. 이카리인, EA, EB, EC, BI의 평균 회수율은 각각 99.98%, 100.14%, 100.09%, 100.75%, 100.94%였으며, RSD% 값은 각각 0.56%, 0.78%, 0.84%, 1.10%, 1.47%였다. 결과는 방법의 정확도가 적합하다는 것을 보여줍니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 예측된 2차 모델의 회귀 계수. 모형의 P 값은 P < 0.01로, 모형이 유의하다는 것을 나타냅니다. 적합 결여의 P 값은 P > 0.05로, 적합 결여가 유의하지 않다는 것을 나타낸다. R2값은 0.9300으로 모형의 적합도가 양호하고 오차가 작았음을 나타내므로 양고기 기름으로 볶은 EF의 화학성분 함량의 영향을 분석하고 예측하는 데 적합한 모형이었다. 또한, A2 및^D2는 가공품의 함량에 유의한 영향을 미쳤다(P< 0.01). 1도 항의 A와 C와 2차 항의^C2가 종합 점수에 미치는 영향은 유의했다. 1도 항 B, 2차 A 2, B² 및 모든 상호 작용 항목은 종합 점수에 유의한 영향을 미치지 않았습니다. P값을 분석한 결과, 실험 파라미터 중 양고기 기름의 양(A)이 종합 점수에 가장 큰 영향을 미쳤고, 튀김 온도(C), 양고기 기름의 온도(B)가 그 뒤를 이었다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

독립 변수 및 그 수준의 결정
EF 가공 기술은 중국 약전 2020년판과 전국 26개 성, 시, 자치구에서 발표한 현지 한약 가공 사양에만 설명되어 있습니다¹. 설명에는 양고기 기름을 가져다가 녹일 때까지 가열하고, EF 조각을 넣고, 균일하고 광택이 날 때까지 천천히 불로 볶고, 꺼내서 식히는 단계가 포함됩니다. 또한 Epimedium 100kg당 20kg(정제된 양고기 기름 20%)이 사용됩니다. 그러나 EF 처리 프로세스의 매개 변수는 지정되지 않습니다. 이 실험의 독립 변수 중 생산 공정에서 양고기 기름 복용량, 양고기 기름 온도 및 튀김 온도의 세 가지 핵심 요소를 정량화할 수 있습니다. 값 범위는 위의 설명에 따라 설정해야 합니다. 예비 시험 결과, 양고기 기름의 양이 15 % 일 때, EF 잎은 양고기 기름으로 고르게 코팅 될 수 있음을 알 수 있습니다. 복용량이 35 %를 초과하면 양고기 기름이 너무 많습니다. 마지막으로 양고기 기름 양의 범위는 15%-35%여야 합니다. 온도가 50 °C에 도달하면 양고기 기름이 녹습니다. 온도가 >120 °C에 도달하면 양고기 기름에서 연기가 나기 시작하고 온도가 너무 높습니다. 따라서 양고기 기름의 온도 범위는 50°C-120°C여야 합니다. 중국 약전 2020년판은 EF를 천천히 불에 볶아야 한다고 규정하고 있습니다. 느린 불은 200 °C를 초과해서는 안되며 튀김 온도는 80 °C-300 °C 범위여야 합니다.

종합 채점
Epimedium을 처리하는 동안 글리코시드 결합이 끊어지고 글리코시드 성분이 더 낮은 글리코시드 성분으로 변형됩니다. 중국 약전 2020년판의 EF 가공 제품 함량 결정은 원래 의약 재료에 포함된 이카리인, EA, EB 및 EC의 총 함량 측정을 기반으로 하며, 모노글리코시드 성분인 BI는 지표로 별도로 나열됩니다. 본 실험에서는 처리된 EF에서 이카리인, EA, EB, EC의 총 중량은 50%, BI의 중량은 50%였으며, 이 값을 토대로 종합 점수를 설정하였다.

반응 표면 방법론(RSM)은 최적의 공정 모수를 식별하고 다변량 문제를 해결하기 위한 통계적 기법입니다. 이 기술에서는 실험을 통해 특정 데이터를 얻기 위해 합리적인 실험 설계가 사용되며, 요인과 응답²² 사이의 기능적 관계를 도출하기 위해 다변량 2 차 회귀 방정식이 사용됩니다. 균일 설계 및 직교 설계 프로세스 최적화가 일반적으로 사용되지만 테스트 정확도가 높지 않고 수학적 모델을 예측할 수 없습니다. RSM의 기반이 되는 수학적 모델은 예측 가능성이 높습니다. RSM은 더 적은 수의 실험과 더 짧은 주기를 필요로 하는데, 이는 전통적인 수학적 통계와 관련된 문제를 제거할 수 있을 뿐만 아니라 요인과 반응 사이의 관계를 명확히 할 수 있다²³. RSM은 시스템의 응답을 하나 이상의 요인의 함수로 개념화하고 그래픽 기술을 사용하여 이 기능적 관계를 표시하여 사용자가 직관적인 시각적 관찰을 통해 실험 설계에서 최적의 조건을 선택할 수 있도록 도와줍니다. 이러한 장점들은 화학 산업(²⁴), 생물 공학, 식품 산업⁽²⁵), 제약 산업, 및 TCM 제제에서 이 방법의 광범위한 사용을 이끌었다.

RSM은 반응(조사할 지수)과 요인(독립 변수) 간의 기능적 관계를 식별할 수 있지만, 반응과 요인 사이에 항상 강한 기능적 관계가 있는 것은 아니기 때문에 모든 실험이 반응 표면 최적화에 적합한 것은 아닙니다. RSM은 모든 요인이 연속 변수여야 하는 연속 함수 관계를 얻는 경우가 많습니다. 그럼에도 불구하고 조사할 모든 요인이 계량형 변수이거나 실험 설계 시작 시 반응 값에 유의한 영향을 미치는 것은 아닙니다. 실험 횟수를 줄이고 반응 표면 모델링의 정확도를 향상시키기 위해서는 반응 표면 설계 방법론을 수행하기 전에 요인 설계, 균일 설계 또는 직교 설계를 통해 유의한 요인을 선택하고 그 수준을 결정하는 스크리닝이 필요합니다. 반응 표면 방법론의 가장 큰 장점은 모델이 올바르게 설정되면 모든 조건 조합에서 반응 값을 예측할 수 있고 3D 반응 표면을 통해 기능적 관계를 보다 직관적이고 시각적으로 볼 수 있다는 것입니다. 이러한 시각화는 연구자들이 최적의 처리 조건을 찾는데 큰 도움이 된다²⁶.

본 연구에서는 RSM의 Box-Behnken 설계 원리를 이용하여 EF의 종합 화학물질 함량 점수를 반응값으로 사용하여 17개의 결합 실험을 설계하였다. 마지막으로, 회귀 분석을 통해 최상의 공정 최적화 결과를 얻었습니다. 가공 기술은 다음과 같이 최적화되었다: 양고기 기름을 120°C ± 10°C에서 가열하고, 미정제 EF를 첨가하고, 균일하게 광택이 날 때까지 부드러운 불(189°C ± 10°C)로 볶은 다음, 그것을 제거하고 냉각시킨다. EF 100kg 당 15kg의 양고기 기름 (정제 된 기름)을 사용해야합니다. 우리의 결과는 EF 프로세스가 안정적이고 신뢰할 수 있으며 반복 가능하다는 것을 보여주었습니다. 또한 요인 상호 작용이 분석되었으며 양고기 기름 양과 튀김 온도 사이의 상호 작용은 유의했지만 다른 요인 간의 상호 작용은 유의하지 않았습니다. 이 연구는 요인 간의 상호 작용 및 요인과 반응 표면 값 간의 관계를 분석하는 방법으로서 반응 표면 설계가 최소한의 실험으로 단기간에 처리 조건을 최적화할 수 있음을 입증했습니다. 본 연구에서 선정된 요인은 단일 요인 선별 실험에서 확인된 핵심 요인이었으며, 그 수준은 예비 실험에서 결정되었습니다. 테스트 샘플은 반응 표면 방법의 특성을 따랐기 때문에 연구는 반응 표면 방법론을 사용하여 예측 모델을 설정할 수 있었습니다. 실험 결과는 처리된 EF의 품질 및 균일성을 개선하기 위한 기준을 제공할 수 있다.

제브라피쉬 배아는 투명하고 체외에서 발달하며 관찰하기 쉽기 때문에 발달 유전학 분야에서 모델 유기체로 사용됩니다²⁷. 발달 독성 연구에서 일반적으로 사용되는 제브라피쉬 독성 지표에는 배아 사망률, 배아 기형율, 난황 부종, 색소 형성, 알 응축, 꼬리 확장, 머리 형태 및 신체 분절 형성 등이 포함됩니다²⁸. 포유류 독성 평가 기술과 비교하여 화합물 독성 검출에 대한 제브라피쉬 배아의 특이도는 70%-80%이고 민감도는 80%를 초과합니다¹⁸. Ton et ^al.29 는 제브라피쉬 배아를 사용한 비기형 유발 화합물의 발달 독성을 평가하는 정확도가 75%임을 발견했습니다. 기형 유발 화합물은 여기에서 100% 정확도로 평가되었습니다. TCM은 복잡한 성분과 불분명한 표적 독성 기관의 특성을 가지고 있지만 제브라피쉬 배아는 여전히 발달 독성의 정확하고 신속한 평가를 위한 실험 동물 모델로 사용될 수 있습니다. 그는 et ^al.30 에모딘이 제브라피쉬 배아의 생존율과 부화율에 영향을 미쳐 몸통 굽힘과 난황낭 부종을 유발한다는 것을 발견했습니다. Chen et ^al.31 은 무스콘이 제브라피쉬 배아 심낭 부종, 척추 만곡 및 난황낭 부종을 유발한다는 것을 발견했습니다. 그는 et ^al.32 Arnebiae Radix가 모든 발달 단계에서 제브라피쉬에 치명적인 영향을 미치고 1.0mg/L Arnebiae Radix가 배아 발달을 억제하여 제브라피쉬 배아의 체체 수, 꼬리 기형, 신체 굽힘 및 멜라닌 감소를 초래한다는 것을 발견했습니다.

제브라피쉬 배아 발달에 대한 조잡하고 가공된 EF의 효과를 조사하기 위해 본 연구에서는 제브라피쉬 배아 발달 독성 실험을 수행하였다. 데이터에 따르면 LC₅₀ 값은 조잡한 그룹(S)의 경우 151.3μg/mL이고 처리된 그룹(P)의 경우 219.8μg/mL였습니다. 각 실험군의 제브라피쉬 사체를 현미경을 통해 관찰한 결과, 제브라피쉬 조군에서 명백한 정도의 제브라피쉬 기형형성이 나타났다. 대부분의 물고기는 척추 기형, 신체 만곡 기형, 심낭 부종, 수영 방광 불완전성 또는 간 변형을 포함하여 다양한 정도의 최기형성을 보였으며 이러한 관찰은 처리군에서 드물었습니다. 이러한 실험은 가공 후 EF의 독성이 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 가공이 인간의 약물 독성을 감소시킬 수 있음을 시사합니다. 실험 결과는 양고기 기름 가공 EF의 임상 약물 안전성 향상을 위한 참고 자료를 제공합니다.

중국 전통 의학은 신장의 기능이 인체의 성장, 발달 및 번식과 밀접한 관련이 있다고 제안한다³³. 중국 전통 의학의 고대 책에는 신장이 신체의 골수라고 기록되어 있습니다. 신장은 에센스를 저장하고 골수는 뼈에 영양을 공급하기 위해 골강에 있습니다. 신장 에센스가 부족하면 골수가 감소한다³⁴. 신장양을 강장시키는 중국 전통 의학은 요추 쇠약, 골다공증, 발기 부전, 조루 및 자궁 냉기 불임을 치료할 수 있습니다³⁵. EF는 신장양강장제를 위한 대표적인 약재의 하나이다. 현대의 약리학 연구에 따르면 EF는 골격계, 면역계, 생식계, 심혈관계, 신경계에 명백한 영향을 미칠 뿐만 아니라 항종양 효과도 있는 것으로 나타났다³⁶. 골격계에 대한 활성 측면에서, icariin³⁷ 은 난소 절제된 쥐의 혈청 E₂ 의 수준을 향상시키고 난소 절제된 쥐의 뼈 조직에서 ERβ mRNA의 발현을 상향 조절할 수 있습니다. ERβ의 합성이 증가하여 ER의 생물학적 효과를 개선하고 파골세포의 골 흡수 활성을 약화시키며 조골세포의 골 형성을 향상시킵니다. 뼈 흡수의 변화는 뼈 대사의 부정적인 균형보다 큽니다. 에피메딘 A는 파골세포 형성, 분화 및 골 흡수를 억제하고 뼈 보호에 역할을 함으로써 골다공증 모델 마우스에서 골 미세구조 및 혈청 골 턴오버 마커를 개선할 수 있다³⁸. 에피메딘 C는 주로 골량을 증가시키고 섬유주 미세구조를 개선하여 궁극적으로 골의 강도를 증가시킨다는 점에서 명백한 항골다공증 활성을 가지고 있다³⁹. 다른 연구에서는 에피메딘 B⁴⁰ 과 바오후오사이드 I⁴¹ 이 항골다공증 활성을 갖는 것으로 나타났습니다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 작업은 충칭 한의학 아카데미의 기초 과학 연구 사업 프로젝트 (프로젝트 번호 : jbky20200013), 충칭 과학 연구 기관의 성과 인센티브 지침 프로젝트 (프로젝트 번호 : cstc2021jxjl 130025) 및 충칭시 보건위원회 중국 재료 메디카 가공의 핵심 분야 건설 프로젝트.