Ex vivo Экспериментальная модель свиньи для изучения и преподавания механики легких

Мы представляем модель легких свиньи ex vivo для демонстрации механики легких и маневров набора альвеол в учебных целях. Легкие могут использоваться более одного дня (до пяти дней) с минимальными изменениями в переменных механики легких.

Искусственная вентиляция легких широко используется и требует специальных знаний для понимания и управления. Медицинские работники в этой области могут чувствовать себя неуверенно и испытывать недостаток знаний из-за неадекватных методов обучения и обучения. Таким образом, целью данной статьи является описание этапов, связанных с созданием модели легких свиньи ex vivo , которая будет использоваться в будущем для изучения и преподавания механики легких. Для создания модели пять легких свиньи были аккуратно удалены из грудной клетки в соответствии с рекомендациями Комитета по этике исследований на животных с надлежащей осторожностью и подключены к аппарату искусственной вентиляции легких через канюлю трахеи. Затем эти легкие были подвергнуты альвеолярному маневру рекрутирования. Регистрировались параметры механики дыхания, а видеокамеры использовались для получения видеозаписей легких во время этого процесса. Этот процесс повторялся в течение пяти дней подряд. Когда легкие не использовались, их хранили в холодильнике. Модель показала различную механику легких после маневра альвеолярного набора каждый день; Не под влиянием дней, а только маневра. Таким образом, мы приходим к выводу, что модель легких ex vivo может обеспечить лучшее понимание механики легких и ее эффектов, и даже маневра альвеолярной рекрутации через визуальную обратную связь на всех этапах процесса.

Искусственная вентиляция легких (ИВЛ) широко используется в отделениях интенсивной терапии (ОИТ) и хирургических центрах. Его мониторинг необходим для того, чтобы помочь распознать асинхронность и предотвратить травмы для всех пациентов, особенно когда у пациента серьезные повреждения легких 1,2,3,4,5,6. Мониторинг механики дыхания также может способствовать клиническому пониманию прогрессирования заболевания и терапевтическим применениям, таким как использование положительного давления в конце выдоха (PEEP) или альвеолярного маневра рекрутирования (ARM). Однако использование этих методов требует профессионального понимания кривых и основ механики легких ^3,4.

Студенты, ординаторы и медицинские работники чувствуют себя неуверенно в отношении управления МВ, начиная с включения аппарата искусственной вентиляции легких и первоначальной регулировки и заканчивая мониторингом плато и давлением при вождении, и эта неуверенность связана с недостатком знаний и адекватной предварительной подготовки 7,8,9,10. Мы заметили, что специалисты, участвовавшие в симуляциях и использующие модель легких, сообщали о большей уверенности, понимании параметров и понимании компонентов механики легких ^8,11,12.

Модели для изучения и тренировки МВ с испытательными легкими, сильфонами и поршнями могут имитировать различные давления и объемы, а также различные условия механики легких 13,14,15. Вычислительные и программные модели также вносят свой вклад в изучение сердечно-легочного взаимодействия путем создания симуляций, которые могут быть использованы для обучения медицинских работников принципам MV^{11 16,17}.

В то время как вычислительные модели могут представлять трудности в представлении легочного гистерезиса¹⁶, модели с тестовым легким и сильфонами 13,14,15 могут создавать кривые зависимости давления от объема, аналогичные физиологической кривой, и демонстрировать динамику легких. Преимуществом является то, что легкое свиньи ex vivo имеет анатомию^, аналогичную человеческой, а также создает кривые MV, легочный гистерезис и обеспечивает визуальную обратную связь легких внутри акриловой коробки во время анализа механики легких. Визуальные модели важны и могут помочь понять сложные для воображения компоненты и концепции. Таким образом, модели легких ex vivo представляют собой практический способ обучения.

Исследования с легкими свиней ex vivo, например, на МВ с положительным и отрицательным давлением 19,20,21, анализ распределения аэрозолей ^22,23, педиатрическое моделирование²⁴ и перфузия легких²⁵ могут улучшить знания о МВ. Недавние исследования, анализирующие модели при положительном и отрицательном давлении, показали, что вентиляция при положительном давлении может приводить к резкому набору с большей локальной деформацией, большим растяжением, различиями кривой гистерезиса и возможными поражениями тканей по сравнению с давлением отрицательного давления 19,20,21. Тем не менее, модели положительного давления необходимы, потому что пациенты находятся под положительным давлением во время давления^MV 19,20,21. Разработка модели легких для доклинических исследований открывает возможности для новых исследований и приложений, включая обучение и подготовку МВ.

Здесь мы представляем модель легких свиней ex vivo для изучения и обучения. Наша основная цель состоит в том, чтобы описать этапы создания этой модели легких свиньи ex vivo при МВ при положительном давлении. В будущем он может быть использован для изучения и преподавания механики легких.

Протокол был одобрен Комитетом по этике исследований на животных нашего Института (протокол No 1610/2021).

1. Анестезия и подготовка животных

1. Первоначально поместите животное на весы и проверьте вес, чтобы скорректировать лекарства и седацию, необходимые для процедуры.
2. Вводят кетамин 5 мг/кг и мидазолам 0,25 мг/кг внутримышечно.
3. Пункцию краевой ушной вены венозным катетером 20 G и внутривенное введение пропофола (5 мг/кг) для индукции анестезии.
4. Введите 3 мл гепарина внутривенно в доступ к маргинальной уховой вене для облегчения сердечно-легочной экстракции и перфузии.
5. После анестезии выполните оротрахеальную интубацию с помощью оротрахеальной канюли (ОТС) диаметром 6,5 мм и зафиксируйте безрецептурную канюлю лейкопластырем, оставив ее прочно зафиксированной, чтобы избежать смещения во время процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина седации проверяется путем мониторинга гемодинамических параметров и с помощью газоанализатора, таких как среднее артериальное давление, частота сердечных сокращений и концентрация изофлурана на вдохе/с истекшим сроком действия.

2. Интраоперационная искусственная вентиляция легких

1. Подключают животное через безрецептурный препарат к МВ, поддерживая седацию 1,5% изофлураном при 50% вдыхаемой фракции кислорода (_FiO2) и фентанилом 10 мкг/кг болюса + 10 мкг/кг/ч непрерывной инфузии.
   1. Коснитесь экрана аппарата искусственной вентиляции легких и выберите режим вентиляции с регулируемым объемом (VCV), нажмите кнопку дыхательного объема (TV) и вращайте колесико прокрутки до тех пор, пока значение дыхательного объема не станет соответствовать 8 мл/кг.
   2. Нажмите на экран аппарата искусственной вентиляции легких. Выберите FiO₂ и вращайте колесо прокрутки до тех пор, пока не будет достигнуто значение 50%.
   3. Нажмите на экран аппарата искусственной вентиляции легких и выберите частоту дыхания (RR). Поворачивайте колесо до тех пор, пока оно не достигнет идеального значения, чтобы поддерживать истекший срок_CO2 на уровне 35-45 мм рт.ст., измеренный с помощью капнографии в сочетании с механическим аппаратом искусственной вентиляции легких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина седации проверяется путем мониторинга гемодинамических параметров и использования газоанализатора, таких как среднее артериальное давление, частота сердечных сокращений и концентрация изофлурана на вдохе/выдыхании.

3. Диссекция тканей и безрецептурный обмен

1. Сделайте медиальный разрез грудины от 2 см выше манубриума до 2 см ниже мечевидного отростка грудины, чтобы получить доступ к грудной полости. Расположите ребра втягивающего, расширяя поле зрения во время процедуры.
2. С помощью скальпеля сделайте горизонтальный разрез трахеи на высоте перстневидного хряща (только у первых колец трахеи), достаточно широкий, чтобы ввести новую канюлю трахеи.
3. Спустите безрецептурную манжету, которая находится внутри дыхательных путей, и медленно потяните, чтобы снять ее. Между тем, введите новый безрецептурный препарат в разрез, сделанный в трахее после удаления старого безрецептурного препарата. Из-за спущенной манжеты может произойти подтекание, прекращающееся при переположении нового ОТК.
4. Надуйте только что введенную манжету трахеальной трубки, подключив шприц объемом 20 мл к пилотному баллону. Шприц подает воздух под давлением и надувает пилотный баллон и манжету. Как только манжета надуется, извлеките шприц.
5. Привяжите новую канюлю трахеи непосредственно к трахее с помощью полиэстера 2-0, чтобы предотвратить утечку и движение, помещая легкое в вентиляционную коробку из оргстекла.
6. Скальпелем рассеките ткани, чтобы удалить сердечно-легочные органы из грудной клетки.

4. Эвтаназия животных

1. Увеличьте концентрацию изофлурана до 5% и введите 10 мл 19,1% хлорида калия. Впоследствии проверьте отсутствие жизненно важных показателей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была проведена в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

5. Сердечно-легочная экстракция

1. После эвтаназии рассекают дыхательную связку, чтобы удалить легкие.
2. После рассечения тканей зажмите безрецептурный препарат соответствующими щипцами Келли в конце вдоха, поддерживая легкие в надувании.
3. Отсоедините OTC от аппарата искусственной вентиляции легких, но держите его зажатым.
4. Разрежьте аортальную артерию, поместите аспиратор внутрь грудной полости, чтобы удалить экстравазированную кровь, сохраняйте визуализацию полости во время завершения рассечения и освободите органы, подлежащие удалению из грудной полости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нижнюю легочную связку следует осторожно отпустить, чтобы избежать разрыва легких.
5. Извлеките сердце и легкое из грудной клетки с зажатым безрецептурным препаратом, не разделяя их, и поместите на лоток.

6. Сердечно-легочная подготовка

1. Положив легкое на кап, канюлируйте легочную артерию с помощью однопросветного катетера большого диаметра и подключите его к инфузионному набору, чтобы непрерывно вводить 2000 мл холодного 0,9% физиологического раствора (SS) или до тех пор, пока из аорты не вытечет прозрачная жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: СС следует вводить с нормальной скоростью, избегая сдавливания внутривенного (внутривенного) мешка.
2. После очищения потока зашить аортальную артерию полиэстером 2-0 и ввести еще 100 мл 0,9% SS. Закройте выходное отверстие однопросветного катетера, так как жидкость останется внутри до конца эксперимента.
3. Разжмите безрецептурный препарат, обратите внимание, что легкие сдуются и останутся закрытыми, готовыми к приему МВ и ARM.

7. МВ в акриловой коробке

1. После подготовки откройте акриловую коробку и расположите легкие вертикально внутри коробки. Пропустите безрецептурный препарат через отверстие в крышке и подсоедините канюлю трахеи к аппарату искусственной вентиляции легких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что канюля трахеи надежно закреплена в трахее.
2. Нажмите кнопку Запустить вентиляцию .
   1. Нажмите на экран аппарата искусственной вентиляции легких и выберите аппарат искусственной вентиляции легких для VCV.
   2. Нажмите на экран настроек режима VCV и выберите кнопку TV , вращайте колесико, пока оно не достигнет значения 6 мл/кг. Сделайте то же самое, чтобы отрегулировать PEEP до 5 см H₂O, FiO₂ до 21%, RR до 15 вдохов в минуту и время паузы на вдохе до 10%.

8. РУКА

1. Чтобы начать набор, увеличьте PEEP с 5 см H₂O до 6 см H₂O, а затем увеличивайте его шаг за шагом 2 см H₂O до достижения 14 см H₂O. PEEP увеличивается с помощью экранной кнопки под значением PEEP, отображаемым на экране. Поверните колесико, чтобы увеличить значение.
   1. Для каждого PEEP запишите значения пикового давления, давления плато, динамической податливости и сопротивления дыхательных путей, отображаемые на экране аппарата искусственной вентиляции легких. Запишите движущее давление, которое представляет собой значение давления плато минус значение PEEP, скорректированное в то время.
2. После достижения 14 см H₂O уменьшите PEEP поэтапно на 2 см H₂O до достижения 6 см H₂O, затем уменьшите его до 5 см H₂O. PEEP уменьшают с помощью экранной кнопки под значением PEEP, отображаемым на экране. Поверните колесико, чтобы уменьшить значение.
   1. Для каждого PEEP запишите значения пикового давления, давления плато, динамической податливости и сопротивления дыхательных путей, отображаемые на экране аппарата искусственной вентиляции легких. Запишите движущее давление, которое представляет собой значение давления плато минус значение PEEP, скорректированное в то время.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте каждое значение PEEP в течение 10 минут во время приращения и в течение 5 минут на каждом шаге во время декремента.

9. Сердечно-легочная поддержка

1. В конце этапа набора аккуратно зажмите канюлю трахеи зажимом во время вдоха, поддерживая легкие в надувании. Откройте акриловую коробку.
2. Достаньте легкие из акриловой коробки и аккуратно поместите их в стеклянную емкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что канюля трахеи надежно закреплена в трахее.
3. Залить 500 мл 0,9% SS.
4. Храните его в холодильнике в стеклянной таре, обернутой полиэтиленом, при температуре от 2 до 8 °C в течение 24 часов.
5. Повторяйте шаги 7, 8 и 9 в течение пяти дней подряд.

Рисунок 1: Блок-схема исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Мы использовали пять свиней-самок весом от 23,4 до 26,9 кг и следовали описанному протоколу для сердечно-легочной экстракции и анализа механики легких. Наша цель состоит в том, чтобы модель была полезна для изучения механики легких путем анализа пикового давления, давления плато, сопротивления, давления на двигателе и динамических переменных податливости, собранных непосредственно с экрана аппарата искусственной вентиляции легких. Блок-схема модели показана на рисунке 1.

Анализ легких проводился в течение пяти дней подряд, повторяя весь процесс, описанный в пунктах 7.2, 8.1, 8.2, 9.1, 9.2 и 9.3 протокола. Мы попытались показать, как вели себя переменные легких до и после рекрутинга, и проверить устойчивость легочной модели ex vivo в установленный период.

Значимые различия (p < 0,05) наблюдались по всем переменным между пре- и пост-ARM. Пиковое давление, давление на плато (рис. 2) и давление в движении (рис. 3) снизились после маневра (р = 0,0005), в то время как динамическая податливость (р = 0,0007) увеличилась (рис. 4), демонстрируя открытый коллапс альвеол и увеличение площади легких. Резистентность (рис. 5) также увеличивалась после рекрутинга (p = 0,0348). Ни на одну из переменных не оказал существенного влияния день.

Основываясь на этих результатах, мы показали, что модель эффективна для демонстрации визуальных изменений механики легких через ARM (рис. 6), а также для изучения и преподавания механики легких (рис. 7). Кроме того, мы показали, что модель можно использовать не менее пяти дней подряд. Поскольку мы не оценивали модель после этого периода, мы не можем подтвердить окончательную долговечность модели легких.

Рисунок 2: Давления. (А) Пиковое давление. Уровень Ppeak до ARM варьировал от 21 ± 3,2 до 23 ± 2,3 смH₂O, в то время как Ppeak после ARM колебался от 9 ± 0,6 до 12,6 ± 1,4 см H2O в пяти легких. Двухфакторный статистический анализ ANOVA был использован для вычисления p-значения 0,0005, которое считалось значимым. (Б) Давление плато. До ARM Pplateau варьировал от 21 ± 3,2 до 22 ± 2,3 смH₂O, в то время как после ARM Pplateau варьировал от 8,8 ± 0,4 до 11,6 ± 1,6 см H2O в пяти легких. Двухфакторный статистический анализ ANOVA был использован для вычисления p-значения 0,0005, которое считалось значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Давление привода. Давление до ARM Driving варьировалось от 16 ± 3,2 до 17 ± 2,3 смH₂O, в то время как давление после ARM Driving колебалось от 3,8 ± 0,4 до 6,6 ± 1,6 см H₂O в пяти легких. Двухфакторный статистический анализ ANOVA был использован для вычисления p-значения 0,0005, которое считалось значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Динамическое соответствие. Комплаентность до ARM Dynamic варьировалась от 9,1 ± 1,2 до 10,2 ± 2,6 мл/смН₂O, в то время как комплаентность после ARM Dynamic варьировалась от 23,6 ± 3,5 до 43,8 ± 11,3 мл/смН₂О в пяти легких. С помощью двуфакторного статистического анализа ANOVA было рассчитано p-значение 0,0007, которое считалось значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сопротивление. Резистентность до ARM варьировалась от 1,4 ± 1,0 до 7 ± 3,2 смН₂О/л/сег, в то время как резистентность после ARM колебалась от 2,4 ± 0,4 до 6,6 ± 5,1 смН₂О/л/сег в пяти легких. С помощью двуфакторного статистического анализа ANOVA было рассчитано p-значение 0,0348, которое было признано значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Модель легких. (A) Легкое с PEEP 5 см. (B) Легкое с PEEP 6 см. (C) Легкое с PEEP 8 см. (D) Легкое с PEEP 10 см. (E) Легкое с PEEP 12 см. (F) Легкое с PEEP 14 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7. Схемы искусственной вентиляции легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Описанный протокол полезен для получения модели легких свиней ex vivo при МВ при положительном давлении. Его можно использовать для изучения и обучения механике легких с помощью визуальной обратной связи с легкими во время рекрутинга и анализа кривых и значений, проецируемых на экран устройства. Для достижения такого результата необходимы пилотные исследования, чтобы понять поведение легких вне грудной клетки и выявить необходимость адаптации.

Мы определили, что критической точкой было образование пузырьков, свищей и поражений в плевре, которые визуализировались при подключении аппарата искусственной вентиляции легких, с разницей между вдохнутым и истекшим ТВ и изменениями кривой объема. Таким образом, одной из первых модификаций протокола стало использование широкого хирургического отверстия грудной клетки, с разрезом диафрагмы в начале процедуры во время рассечения сердечно-легочных органов, что может улучшить визуализацию структур и помочь осторожному освобождению нижней легочной связки, сохраняя целостность легких. Кроме того, ручное надувание пилотных легких после вскрытия структур показало, что это надувание превышает пределы давления и способствует образованию волдырей и свищей. В некоторых исследованиях с использованием легких ex vivo была представлена возможность использования фибринового клея для устранения утечек, с положительными результатами; Хотя мы не использовали этот подход в исследовании, он может быть альтернативой для улучшения модели^26,27. Еще один важный момент заключается в том, что в пилотном исследовании легкие были удалены и полностью сдуты, что привело к их полному коллапсу с момента подготовки органа до начала МВ, что затрудняло открытие легких для МВ и увеличивало вероятность образования фистулы. Поэтому мы начали зажимать безрецептурный препарат и держать легкие надутыми во время вскрытия до тех пор, пока не будет введен СС. После этого безрецептурный препарат был выпущен, спущен и подключен к аппарату искусственной вентиляции легких для запуска ARM, и был проведен анализ механики легких, чтобы продемонстрировать кривую легочного гистерезиса. Это не повлияло на рекрутирование легких или анализ механики легких, потому что у пациентов, находящихся под наркозом, наблюдается ателектаз и сниженная комплаентность легких даже во время MV 28,29,30,31.

В пилотном исследовании использовали исходный PEEP 5 см_Н2Ои увеличивали с шагом 5 см_Н2Одо 25 см_Н2О^32,33. Однако пиковое и плато давления достигали значений более 40 и 30 см_Н2Осоответственно с образованием свищей. Таким образом, было выполнено постепенное увеличение на 2 см H₂O, чтобы лучше проанализировать поведение давлений с течением времени и понять пределы PEEP в нашей модели легких ex vivo. Не было никакой разницы в смертности между устойчивой и инкрементальной инфляцией, но инкрементальная инфляция является наиболее используемой и может облегчить поэтапный анализ механики легких³⁴. Что касается использования отрицательного давления^20,21, то модель тестировалась только при положительном давлении, поскольку пациенты на МВ подвергаются положительному давлению. Мы не исключаем использования отрицательного давления в будущем, но это потребует замены акрилового корпуса.

В литературе представлены некоторые модели, изготовленные с тестовым легким, поршнями и моделью ex vivo ^13,14, которые были помещены в герметично закрытые коробки, имитирующие грудную клетку. Наша модель была помещена в обычную акриловую коробку, которая, несмотря на уменьшение возможности приложения отрицательного давления, может облегчить изготовление модели. Другая модель, созданная для доклинических^{исследований,} похожа на нашу, но легкие располагались горизонтально, в то время как наши находились в вертикальном положении, получая действие гравитации без поддержки органов и грудной клетки. Эти легкие использовались в экспериментах в течение 48 часов после эвтаназии 18,19,20,21,35. Наша модель использовалась в общей сложности в течение 120 часов при температуре 2-8 °C в течение 24 часов эксперимента, показав положительные результаты, описанные в разделе репрезентативных результатов.

Пробел в преподавании и подготовке кадров не был устранен на начальном этапе, но модель эффективна для анализа механики легких и может быть использована в качестве инструмента для исследований и преподавания. Кроме того, мы не ставили перед собой цель изучить перфузионные растворы, но таким же образом, как мы вводили СС на этапе 6.1, можно использовать растворы для перфузии и консервации, открывая новые возможности для исследований с той же представленной моделью.

Этот метод имеет некоторые ограничения: 1) знание анатомии животных, чтобы гарантировать, что легкие будут удалены должным образом; 2) модель оценивалась не более пяти дней; 3) модель представляется подходящей для учебной вентиляции, но не была протестирована в учебном контексте; 4) Это животная модель, поэтому важно учитывать ограничения ее применимости на людях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Мы благодарим всех коллег и специалистов, которые внесли свой вклад и поддержали создание этого протокола модели легких свиней ex vivo .

У этого исследования не было источников финансирования.