Method Article
Этот протокол описывает синтез циклических пептидов, проникающих в клетки, с ароматическими поперечными связями и оценку их проницаемости через биологические барьеры.
Рак был серьезной проблемой в глобальном здравоохранении. Однако сложное микроокружение опухоли обычно ограничивает доступ терапевтических средств к более глубоким опухолевым клеткам, что приводит к рецидиву опухоли. Чтобы преодолеть ограниченное проникновение биологических барьеров, были обнаружены проникающие в клетки пептиды (CPP) с отличной способностью транслокации мембраны и стали полезными молекулярными транспортерами для доставки различных грузов в клетки. Однако обычные линейные СРР обычно демонстрируют нарушенную протеолитическую стабильность, что ограничивает их проницаемость через биологические барьеры. Таким образом, разработка новых молекулярных транспортеров, которые могут проникать через биологические барьеры и проявлять повышенную протеолитическую стабильность, крайне желательна для повышения эффективности доставки лекарств в биомедицинских приложениях. Ранее мы синтезировали панель коротких циклических CPP с ароматическими сшивками, которые показали превосходную проницаемость в раковых клетках и тканях по сравнению с их линейными аналогами. Здесь описан краткий протокол синтеза флуоресцентно меченного циклического пептида полиаргинина R8 и его линейного аналога, а также ключевые этапы исследования их клеточной проницаемости.
За последние несколько десятилетий мы стали свидетелями быстрого прогресса в разработке пептидов, проникающих в клетки (СХТ) для доставки лекарств. СРТ широко используются в качестве молекулярных транспортеров для лечения ряда опасных для жизни заболеваний, включая неврологические расстройства1,2, болезни сердца3, диабет4, дерматоз5 и рак 6,7. Рак остается глобальным бременем здравоохранения, сопровождающимся высоким уровнем заболеваемости и смертности, несмотря на широкомасштабные исследовательские усилия8. Серьезным препятствием для лечения рака является ограниченный доступ терапевтических средств к более глубоким опухолевым клеткам из-за физиологических барьеров, таких как компактный внеклеточный матрикс (ECM), аномальная сосудистая сеть опухоли, множественные мембранные барьеры и высокое давление интерстициальной жидкости (IFP)9. Таким образом, разработка новых СРР с превосходной способностью доставлять грузы через биологические барьеры считается важной стратегией лечения рака10,11.
СРР можно разделить на катионные, амфипатические и гидрофобные СРР с точки зрения их физико-химических свойств12. Среди них положительно заряженный пептид ВИЧ-ТАТ и синтетический полиаргинин имеют большое значение в биомедицинских исследованиях и были тщательно изучены для облегчения внутриклеточной доставки лекарств13. Tunnemann et al. сообщили, что минимальная длина в восемь аргининов имеет важное значение для эффективного проникновения в клетки синтетических пептидов полиаргинина, основываясь на исследовании проницаемости клеток, проведенном с использованием пептидов от R3 до R1214. Однако эти CPP обычно имеют короткие периоды полураспада в плазме из-за их быстрого гидролиза in vivo. Кроме того, мало что известно об оптимизации химической структуры СРР для повышения их трансбарьерной способности, поскольку проникновение через несколько клеточных мембранзатруднено 15. Таким образом, разработка новых молекулярных транспортеров, способных проникать через биологические барьеры, крайне желательна для повышения эффективности доставки лекарств. В 2020 году Komin et al.16 обнаружили CPP, называемый пептидом CL, который содержит мотив спирали (RLLRLLR) и полиаргининовый хвост (R7) для пересечения эпителиального монослоя. Набор вариантов пептидов CL также был синтезирован путем изменения спирального рисунка. Это исследование может стать важным руководством для разработки новых CPP для доставки грузов через биологические барьеры. Кроме того, Dietrich et al. оптимизировали клеточную проницаемость пептида StAX, ингибируя сигнальный путь Wnt/β-катенина за счет увеличения общей гидрофобности пептидов17.
Конформационная рестрикция неструктурированных линейных пептидов циклизацией является эффективным способом повышения их протеолитической стабильности и проницаемости18,19,20. Структурное армирование повышает резистентность циклических пептидов к протеазе, делая их более стабильными in vivo по сравнению с их линейными аналогами. Кроме того, циклизация пептидов потенциально может маскировать полярную пептидную основу, способствуя внутримолекулярному образованию водородных связей, тем самым увеличивая мембранную проницаемость пептидов21. В последние два десятилетия хемослективные методы циклизации стали эффективными стратегиями построения циклических пептидов с различной архитектурой, таких как полностью углеводородные, лактамные, триазольные, м-ксилол, перфторарил и другие поперечные связи22,23. Биологический барьер, налагаемый сложным микроокружением опухоли, может снижать проникновение лекарств в солидные опухоли24. Ранее мы обнаружили, что циклические CPP проявляют превосходную устойчивость к ферментативному расщеплению по сравнению с их линейными аналогами20. Кроме того, общая гидрофобность пептидов имеет решающее значение для их повышенной проницаемостидля клеток 22. Основываясь на исследованиях, рассмотренных выше, можно предположить, что сочетание положительно заряженного паттерна, повышенной общей гидрофобности и повышенной стабильности протеолиза увеличивает проницаемость CPP через биологические барьеры. В недавнем исследовании мы идентифицировали два циклических CPP с ароматическими сшивками в положениях i и i + 7, которые демонстрируют улучшенную проницаемость в опухолевых клетках и тканях по сравнению с их линейными аналогами15. Здесь представлен краткий синтетический протокол синтеза флуоресцентно меченных циклических СРР и ключевые шаги по исследованию их проницаемости.
1. Подготовка оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в рабочем вытяжном шкафу с подходящими средствами индивидуальной защиты.
2. Синтез меченного FITC линейного пептида R8 (FITC-R8) и меченного FITC сшитого пептида R8 (FITC-sR8-4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Пептиды были синтезированы в соответствии со стандартным протоколом твердофазного пептидного синтеза (SPPS) на основе Fmoc (SPPS)25. На протяжении всего исследования использовалась смола 4-(2',4'-диметоксифеил-Fmoc-аминометил)-феноксиацетамидо-норлейцил-MBHA (смола MBHA с катком, см. Таблицу материалов).
ВНИМАНИЕ: N, N-диметилформамид (ДМФ), N, N-диизопропилэтиламин (DIPEA), морфолин и дихлорметан (DCM) бесцветны и повреждают при вдыхании или всасывании через кожу. Эфир чрезвычайно легко воспламеняется. 1,2-Этанедитиол (ЭДТ) является особенно пахучим веществом. Трифторуксусная кислота (TFA) обладает высокой коррозионной активностью, а ее кислотность в10-5 раз выше, чем у уксусной кислоты. Следовательно, со всеми реагентами и химическими веществами предполагается бороться с использованием защитных средств в вытяжном шкафу.
3. Количественное определение пептидов, меченных FITC
4. Стабильность пептидов в сыворотке крови крупного рогатого скота плода (FBS)
5. Клеточное поглощение пептидов
6. Исследование межклеточного проникновения пептидов с использованием трансвелл-моделей
В этом протоколе была представлена синтетическая процедура для удержания линейного полиаргинина R8 в его циклической форме. СППС проводилась вручную с помощью простого аппарата (рис. 1). Подробный процесс синтеза СППС показан на рисунке 2. Короче говоря, смола достаточно набухла, после чего защитная группа N α-Fmoc была снята. Затем аминокислоту, защищеннуюN-α-Fmoc, закрепляли на смоле до завершения сборки пептида (этапы 1-4 на рисунке 2). Затем сырые пептиды отщепляли от смолы коктейлем расщепления (шаг 5 на рисунке 2). FITC использовался для маркировки пептидов для синтеза флуоресцентно меченных циклических CPP и отслеживания их проницаемости через биологические барьеры. Впоследствии тритил-защитные группы цистеинов селективно снимали защиту на смоле с последующей пептидной циклизацией с 4,4'-бис(бромметил)бифенильной сшивкой (рис. 3А). Спектры ВЭЖХ и МС FITC-R8 и FITC-sR8-4 показаны на рисунке 3B. Время удержания FITC-sR8-4 было значительно больше, чем у линейного аналога, что указывает на повышенную общую гидрофобность пептида после циклизации с гидрофобной сшивкой. Кроме того, как показано на рисунке 3C, циклический R8 оставался неповрежденным на 77,3% после инкубации с 25% FBS в течение 4 часов, в то время как его линейный аналог был в основном деградирован, что свидетельствует о повышенной протеолитической стабильности циклического пептида R8. В последующих клеточных исследованиях клетки, обработанные циклическим R8 с ароматической сшивкой, демонстрировали более высокую внутриклеточную флуоресценцию, чем клетки, обработанные его линейным аналогом, что было продемонстрировано флуоресцентной микроскопией живых клеток (рис. 4A). Аналогичные результаты были получены при анализе проточной цитометрии (рис. 4B). Для дальнейшего изучения того, обеспечивает ли циклический R8 усиленное проникновение от клетки к клетке, были использованы трансвелл-модели для моделирования барьерной проницаемости пептидов от одного клеточного слоя к другому. Циклический R8 явно демонстрировал более высокое трансбарьерное проникновение, чем линейный пептид R8, о чем свидетельствует значительное увеличение внутриклеточной флуоресценции (рис. 4C). Подводя итог, можно сказать, что циклический пептид R8 продемонстрировал превосходную проницаемость через биологические барьеры по сравнению со своим линейным аналогом.
Рисунок 1: Настройка оборудования для аппарата ручного синтеза пептидов. Полипропиленовая колонна объемом 10 мл устанавливается на вакуумном коллекторе с помощью трехходового запорного клапана. N2 используется для агитации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Общая процедура твердофазного пептидного синтеза Fmoc (SPPS). Аминокислота, защищенная N-α-Fmoc, прикреплена к смоле 4-(2',4'-диметоксифеил-Fmoc-аминометил)-феноксиацетамидо-норлейцил-MBHA (смола MBHA (смола MBHA (стадия 1) с последующим снятием защиты защитных групп N α-Fmoc аминокислот (стадия 2) и последующим связыванием аминокислот (стадия 3). Шаг 2 и шаг 3 повторяют несколько раз для синтеза желаемого пептида (шаг 4). После завершения синтеза добавляют коктейль расщепления, чтобы удалить защитные группы боковой цепи и отщепить нужный пептид от смолы (этап 5). Сокращения: ДМФА = N, N-диметилформамид; DCM = дихлорметан; HATU = 2-(7-азобензотриазол)-N, N, N', N'-гексафторфосфат тетраметилурония; ДИПЭА = N, N-диизопропилэтиламин; TFA = трифторуксусная кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Синтез меченного FITC линейного пептида R8 (FITC-R8) и меченного FITC сшитого пептида R8 (FITC-sR8-4) с использованием твердофазного пептидного синтеза (SPPS). (A) Принципиальная схема синтеза FITC-R8 и FITC-sR8-4. (B) спектры ВЭЖХ и МС (вставка) FITC-R8 и FITC-sR8-4. (C) Стабильность FITC-R8 и FITC-sR8-4 в присутствии 25% FBS. Интактный пептид (%) относится к фракции неразложившегося пептида. Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Проникновение меченного FITC линейного пептида R8 (FITC-R8) и меченного FITC сшитого пептида R8 (FITC-sR8-4). (A) Изображения флуоресцентной микроскопии живых клеток HeLa и клеток 4T1 после 1-часовой инкубации с 3 мкМ FITC-R8 и FITC-sR8-4. FITC (зеленый), Hoechst (синий). Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Относительная средняя флуоресценция (по отношению к линейному пептиду R8), среднее значение ± с.д. и n = 3; (C) Межклеточное проникновение FITC-R8 и FITC-sR8-4 в трансвелл-модели с использованием клеток HeLa. Изображения флуоресцентной микроскопии живых клеток (масштабная линейка = 20 мкм) и относительная средняя флуоресценция (по отношению к линейному пептиду R8) означают ± s.d. и n = 3. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Химическая стабилизация пептидов путем включения конформационных ограничений оказалась эффективной стратегией повышения стабильности и клеточной проницаемости пептида26. В этом протоколе описана поэтапная процедура синтеза циклических СРР с ароматическими поперечными связями и оценки их проницаемости через биологические барьеры. По сравнению с гидрофильными лактамными или триазольными поперечными связями22,27 включение ароматических поперечных связей (используемых в этом исследовании) улучшает общую гидрофобность СРФ, тем самым значительно увеличивая их клеточную проницаемость. С другой стороны, пептидная циклизация может быть легко достигнута путем реакций замещения цистеинами, не требуя каких-либо металлических катализаторов. В этом протоколе циклизация СРР проводилась на смоле; Однако эффективность циклизации также зависит от конкретных последовательностей и длин пептидов из-за стерических эффектов, которые могут привести к образованию димерного побочного продукта28. В таком случае было бы полезно использовать смолу с меньшей грузоподъемностью. Кроме того, рекомендуется также циклизировать эти специфические пептиды в разбавленных концентрациях в фазе29 раствора.
В этом протоколе есть несколько критических моментов. Во-первых, коктейль расщепления TFA/TIS/EDT/H 2 O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) используется для расщепления цистеинсодержащих пептидов для предотвращения окисления сульфгидрильной группы. Во-вторых, предлагается провести небольшое предварительное исследование для получения соответствующего условия расщепления. Оптимальное время, необходимое для отщепления пептидов от смолы, составляет 2-3 часа, при этом более длительное время расщепления (более 5 часов) приводит к образованию большего количества неопознанных побочных продуктов. Синтез пептидов можно контролировать с помощью LC-MS для оптимизации времени расщепления. В-третьих, маркировка FITC должна производиться в темноте, чтобы избежать гашения флуоресценции.
Кроме того, трипановый синий следует использовать для гашения флуоресценции на поверхности, поскольку анализ проточной цитометрии не может различить внутриклеточную или поверхностную флуоресценцию. Это поможет конкретно количественно определить пептид, интернализованный раковыми клетками27. Кроме того, поскольку катионные пептиды могут также вызывать неспецифический лизисмембраны 30, гемолитическая активность и жизнеспособность клеток также могут быть проведены для оценки токсичности циклических СХТ.
Циклические СРТ представляют собой одно из эффективных средств доставки лекарств для преодоления биологических барьеров. Однако мембранное взаимодействие и возмущение катионных СРР обычно приводят к потенциальной неспецифической цитотоксичности31. Дальнейшие усилия будут направлены на понимание детального механизма проникновения, который должен помочь в открытии следующего поколения циклических СРР для проникновения через биологические барьеры с минимальной цитотоксичностью. Эти высокоактивные и стабильные СХТ имеют большие перспективы для улучшения лечения важных опасных для жизни заболеваний.
Авторам раскрывать нечего.
Эта работа поддерживается Фондом естественных наук Китая (21708031), Китайским фондом постдокторантуры (BX20180264, 2018M643519) и Фондами фундаментальных исследований центральных университетов (2682021ZTPY075).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
Vacuum manifold | Promega | A7231 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены