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Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg.
Krebs ist eine große Herausforderung für die globale Gesundheit. Die komplexe Mikroumgebung des Tumors schränkt jedoch im Allgemeinen den Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen ein, was zu einem Tumorrezidiv führt. Um die begrenzte Durchdringung biologischer Barrieren zu überwinden, wurden zellpenetrierende Peptide (CPPs) mit ausgezeichneter Membrantranslokationsfähigkeit entdeckt und haben sich als nützliche molekulare Transporter für den Transport verschiedener Frachten in Zellen erwiesen. Konventionelle lineare CPPs weisen jedoch im Allgemeinen eine beeinträchtigte proteolytische Stabilität auf, was ihre Permeabilität über biologische Barrieren hinweg einschränkt. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die biologische Barrieren durchdringen können und eine verbesserte proteolytische Stabilität aufweisen, sehr wünschenswert, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe in biomedizinischen Anwendungen zu fördern. Wir haben zuvor eine Reihe von kurzen zyklischen CPPs mit aromatischen Vernetzungen synthetisiert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine überlegene Permeabilität in Krebszellen und -geweben aufwiesen. In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll für die Synthese des fluoreszenzmarkierten zyklischen Polyarginin-R8-Peptids und seines linearen Gegenstücks sowie wichtige Schritte zur Untersuchung ihrer Zellpermeabilität beschrieben.
In den letzten Jahrzehnten gab es rasante Fortschritte bei der Entwicklung von zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) für die Verabreichung von Medikamenten. CPPs werden häufig als molekulare Transporter zur Behandlung einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten eingesetzt, darunter neurologische Erkrankungen1,2, Herzerkrankungen3, Diabetes4, Dermatose5 und Krebs 6,7. Krebs ist nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung, die mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate einhergeht, trotz breit angelegter Forschungsbemühungen8. Ein ernsthaftes Hindernis für die Behandlung von Krebs ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren wie der kompakten extrazellulären Matrix (EZM), abnormen Tumorgefäßen, multiplen Membranbarrieren und hohem interstitiellen Flüssigkeitsdruck (IFP)9. Daher wird die Entwicklung neuartiger CPPs mit überlegener Fähigkeit, Ladungen über biologische Barrieren hinweg zu transportieren, als eine wesentliche Strategie für die Krebsbehandlung angesehen10,11.
CPPs können hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften in kationische, amphipathische und hydrophobe CPPs eingeteilt werden12. Unter diesen sind das positiv geladene HIV-TAT-Peptid und das synthetische Polyarginin von erheblicher Bedeutung in der biomedizinischen Forschung und wurden ausgiebig untersucht, um die intrazelluläre Wirkstoffverabreichung zu erleichtern13. Tunnemann et al. berichteten, dass eine Mindestlänge von acht Argininen für eine effiziente Zellpenetration der synthetischen Polyarginin-Peptide unerlässlich ist, basierend auf einer Zellpermeabilitätsstudie, die mit R3- bis R12-Peptiden durchgeführt wurde14. Diese CPPs haben jedoch aufgrund ihrer schnellen Hydrolyse in vivo in der Regel kurze Plasmahalbwertszeiten. Darüber hinaus ist wenig über die Optimierung der chemischen Struktur von CPPs bekannt, um ihre Transbarrierefähigkeit zu erhöhen, da es schwierig ist, mehrere Zellmembranen zu durchdringen15. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu durchdringen, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Im Jahr 2020 entdeckten Komin et al.16 ein CPP namens CL-Peptid, das ein Helix-Motiv (RLLRLLR) und einen Polyarginin-Schwanz (R7) zur Durchquerung der Epithel-Monoschicht enthält. Eine Reihe von CL-Peptidvarianten wurde ebenfalls synthetisiert, indem das helikale Muster verändert wurde. Diese Erkundung könnte ein wichtiger Leitfaden für die Entwicklung neuartiger CPPs für die Lieferung von Ladungen über biologische Barrieren hinweg sein. Darüber hinaus optimierten Dietrich et al. die Zellpermeabilität des StAX-Peptids, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg hemmten, indem sie die Gesamthydrophobie der Peptide erhöhten17.
Die Konformationsrestriktion von unstrukturierten linearen Peptiden durch Cyclisierung ist ein effektiver Weg, um ihre proteolytische Stabilität und Permeabilität zu verbessern18,19,20. Die strukturelle Verstärkung erhöht die Proteaseresistenz zyklischer Peptide und macht sie in vivo im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken stabiler. Darüber hinaus kann die Cyclisierung von Peptiden potenziell das polare Peptidrückgrat maskieren, indem sie intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen fördert und so die Membranpermeabilität der Peptide21 erhöht. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich chemoselektive Cyclisierungsmethoden zu effektiven Strategien für die Konstruktion zyklischer Peptide mit unterschiedlichen Architekturen entwickelt, wie z. B. reiner Kohlenwasserstoff, Lactam, Triazol, m-Xylol, Perfluoraryl und anderen Querverbindungen22,23. Die biologische Barriere, die durch die ausgeklügelte Tumormikroumgebung auferlegt wird, könnte das Eindringen von Medikamenten in solide Tumore verringern24. Wir haben bereits festgestellt, dass die zyklischen CPPs eine überlegene Resistenz gegen enzymatische Verdauung aufwiesen als ihre linearen Gegenstücke20. Darüber hinaus ist die Gesamthydrophobie der Peptide entscheidend für ihre verbesserte Zellpermeabilität22. Basierend auf den oben diskutierten Studien kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Kombination aus einem positiv geladenen Muster, einer erhöhten Gesamthydrophobie und einer verbesserten Proteolysestabilität die Permeabilität von CPPs über biologische Barrieren hinweg erhöht. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir zwei zyklische CPPs mit aromatischen Vernetzungen an den Positionen i und i+7 identifiziert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine verbesserte Permeabilität in Tumorzellen und -geweben aufweisen15. In dieser Arbeit werden ein prägnantes Syntheseprotokoll für die Synthese fluoreszenzmarkierter zyklischer CPPs und die wichtigsten Schritte zur Untersuchung ihrer Permeabilität vorgestellt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung
Anmerkungen: Führen Sie alle Vorgänge in einem Betriebsabzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.
2. Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid (FITC-R8) und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid (FITC-sR8-4)
HINWEIS: Die Peptide wurden gemäß einem Standardprotokoll der Fmoc-basierten Festphasenpeptidsynthese (SPPS) synthetisiert25. Das 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz, siehe Materialtabelle) wurde während der gesamten Studie verwendet.
VORSICHT: N, N-Dimethylformamid (DMF), N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA), Morpholin und Dichlormethan (DCM) sind alle farblos und schädlich, wenn sie eingeatmet oder über die Haut aufgenommen werden. Äther ist hochentzündlich. 1,2-Ethanedithiol (EDT) ist eine besonders geruchsintensive Substanz. Trifluoressigsäure (TFA) ist stark korrosiv und ihr Säuregehalt ist 10 bis5 Mal so hoch wie der von Essigsäure. Folglich sollten alle Reagenzien und Chemikalien mit Schutzausrüstung in einem Abzug behandelt werden.
3. Quantifizierung der FITC-markierten Peptide
4. Stabilität von Peptiden im fötalen Kälberserum (FBS)
5. Zelluläre Aufnahme der Peptide
6. Untersuchung der Zell-zu-Zell-Penetration der Peptide mit Hilfe von Transwell-Modellen
In diesem Protokoll wurde ein Syntheseverfahren vorgestellt, um das lineare Polyarginin R8 in seine cyclische Form zu bringen. Die SPPS wurde manuell mit einer einfachen Apparatur durchgeführt (Abbildung 1). Der detaillierte Syntheseprozess von SPPS ist in Abbildung 2 dargestellt. Kurzzeitig war das Harz ausreichend aufgequollen, gefolgt von der Entschützung der N α-Fmoc-Schutzgruppe. Anschließend wurde die N α-Fmoc-geschützte Aminosäure bis zum Abschluss der Peptid-Assemblierung auf dem Harz verankert (Schritte 1-4 in Abbildung 2). Anschließend wurden die rohen Peptide durch den Spaltcocktail vom Harz abgespalten (Schritt 5 in Abbildung 2). FITC wurde verwendet, um die Peptide zu markieren, um fluoreszenzmarkierte zyklische CPPs zu synthetisieren und ihre Permeabilität über biologische Barrieren hinweg zu verfolgen. Anschließend wurden die Trityl-Schutzgruppen der Cysteine selektiv auf dem Harz degeschützt, gefolgt von einer Peptidcyclisierung mit 4,4'-Bis(brommethyl)biphenyl-Quervernetzung (Abbildung 3A). Die HPLC- und MS-Spektren von FITC-R8 und FITC-sR8-4 sind in Abbildung 3B dargestellt. Die Retentionszeit von FITC-sR8-4 war wesentlich länger als die des linearen Analogons, was auf eine erhöhte Gesamthydrophobie des Peptids nach der Cyclisierung mit der hydrophoben Vernetzung hinweist. Wie in Abbildung 3C gezeigt, blieb das zyklische R8 nach Inkubation mit 25 % FBS für 4 h zu 77,3 % intakt, während sein lineares Gegenstück größtenteils abgebaut wurde, was auf eine verbesserte proteolytische Stabilität des zyklischen R8-Peptids hindeutet. In den anschließenden zellbasierten Studien zeigten Zellen, die mit zyklischem R8 mit aromatischer Vernetzung behandelt wurden, eine höhere intrazelluläre Fluoreszenz als Zellen, die mit seinem linearen Gegenstück behandelt wurden, wie die Bildgebung mit Lebendzellfluoreszenzmikroskopie zeigte (Abbildung 4A). Ähnliche Ergebnisse wurden mit der durchflusszytometrischen Analyse erzielt (Abbildung 4B). Um weiter zu untersuchen, ob zyklisches R8 eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration verleiht, wurden Transwell-Modelle verwendet, um die Barrierepermeabilität der Peptide von einer Zellschicht zur anderen zu simulieren. Das zyklische R8 zeigte deutlich eine höhere Transbarriere-Penetration als das lineare R8-Peptid, was durch eine signifikante Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz angezeigt wird (Abbildung 4C). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das zyklische R8-Peptid eine überlegene Permeabilität über biologische Barrieren hinweg aufwies als sein lineares Gegenstück.
Abbildung 1: Geräteaufbau für die manuelle Peptidsyntheseapparatur. Eine 10-ml-Polypropylen-Säule wird mit einem Dreiwege-Absperrventil auf dem Vakuumverteiler aufgebaut. N2 wird zum Rühren verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Allgemeiner Ablauf der Fmoc-Festphasenpeptidsynthese (SPPS). Eine N α-Fmoc-geschützte Aminosäure wird an dem 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz) verankert (Schritt 1), gefolgt von der Entschützung der Nα-Fmoc-Schutzgruppen der Aminosäuren (Schritt 2) und anschließender Aminosäurekopplung (Schritt 3). Schritt 2 und Schritt 3 werden mehrmals wiederholt, um das gewünschte Peptid zu synthetisieren (Schritt 4). Nach Abschluss der Synthese wird ein Spaltcocktail hinzugefügt, um die Seitenkettenschutzgruppen zu entfernen und das gewünschte Peptid aus dem Harz zu spalten (Schritt 5). Abkürzungen: DMF = N,N-Dimethylformamid; DCM = Dichlormethan; HATU = 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-Tetramethyluroniumhexafluorophosphat; DIPEA = N,N-Diisopropylethylamin; TFA = Trifluoressigsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid (FITC-R8) und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid (FITC-sR8-4) mittels Festphasen-Peptidsynthese (SPPS). (A) Schematische Darstellung der Synthese von FITC-R8 und FITC-sR8-4. (B) HPLC- und MS-Spektren (Einschub) von FITC-R8 und FITC-sR8-4. (C) Stabilität von FITC-R8 und FITC-sR8-4 in Gegenwart von 25 % FBS. Intaktes Peptid (%) bezieht sich auf den Anteil des nicht abgebauten Peptids. Diese Zahl wurde von Shi et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Penetration von FITC-markiertem linearem R8-Peptid (FITC-R8) und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid (FITC-sR8-4). (A) Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen von HeLa-Zellen und 4T1-Zellen nach 1-stündiger Inkubation mit 3 μM FITC-R8 und FITC-sR8-4. FITC (grün), Hoechst (blau). Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Relative mittlere Fluoreszenz (in Bezug auf das lineare R8-Peptid), Mittelwert ± s.d. und n = 3; (C) Zell-zu-Zell-Penetration von FITC-R8 und FITC-sR8-4 in einem Transwell-Modell unter Verwendung von HeLa-Zellen. Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Bilder (Maßstabsbalken = 20 μm) und relative mittlere Fluoreszenz (in Bezug auf das lineare R8-Peptid), Mittelwert ± s.d. und n = 3. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Diese Zahl wurde von Shi et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die chemische Stabilisierung von Peptiden unter Einbeziehung von Konformationsbeschränkungen hat sich als effektive Strategie zur Verbesserung der Stabilität und Zellpermeabilität des Peptids26 erwiesen. In diesem Protokoll wird ein schrittweises Vorgehen für die Synthese zyklischer CPPs mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg beschrieben. Im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Quervernetzungen22,27 verbessert der Einbau aromatischer Quervernetzungen (die in dieser Studie verwendet wurden) die Gesamthydrophobie der CPPs, wodurch ihre Zellpermeabilität signifikant erhöht wird. Andererseits kann die Peptidcyclisierung leicht durch Substitutionsreaktionen mit Cysteinen erreicht werden, ohne dass Metallkatalysatoren erforderlich sind. In diesem Protokoll wurde die Cyclisierung der CPPs auf Harz durchgeführt; Die Cyclisierungseffizienz hängt jedoch auch von den spezifischen Sequenzen und Längen der Peptide aufgrund sterischer Effekte ab, die zur Bildung eines dimeren Nebenprodukts führen können28. In einem solchen Fall wäre die Verwendung eines Harzes mit geringerer Belastbarkeit hilfreich. Darüber hinaus wird auch empfohlen, diese spezifischen Peptide unter verdünnten Konzentrationen in der Lösungsphase29 zu cyclisieren.
Es gibt einige kritische Punkte in diesem Protokoll. Zunächst wird der Spaltcocktail TFA/TIS/EDT/H2 O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) zur Spaltung von Cystein-haltigen Peptiden verwendet, um eine Oxidation der Sulfhydrylgruppe zu verhindern. Zweitens wird empfohlen, eine kleine Vorstudie durchzuführen, um die geeignete Spaltbedingung zu erhalten. Die optimale Zeit, die benötigt wird, um die Peptide aus dem Harz zu spalten, beträgt 2-3 Stunden, wobei eine längere Spaltzeit (mehr als 5 Stunden) dazu neigt, mehr nicht identifizierte Nebenprodukte zu produzieren. Die Peptidsynthese konnte mittels LC-MS überwacht werden, um die Spaltzeit zu optimieren. Drittens sollte die FITC-Markierung im Dunkeln erfolgen, um eine Fluoreszenzlöschung zu vermeiden.
Darüber hinaus sollte Trypanblau verwendet werden, um die oberflächengebundene Fluoreszenz zu löschen, da die Durchflusszytometrie intrazelluläre oder oberflächengebundene Fluoreszenz nicht unterscheiden kann. Dies wird dazu beitragen, das von den Krebszellen internalisierte Peptid spezifisch zu quantifizieren27. Da kationische Peptide auch eine unspezifische Membranlyse verursachen können30, könnten außerdem hämolytische Aktivität und Zellviabilität durchgeführt werden, um die Toxizität der zyklischen CPPs zu bewerten.
Zyklische CPPs stellen eines der effektivsten Vehikel zur Überwindung biologischer Barrieren dar. Die Membraninteraktion und die Störung kationischer CPPs führen jedoch im Allgemeinen zu einer potentiellen unspezifischen Zytotoxizität31. Weitere Anstrengungen werden unternommen, um den detaillierten Penetrationsmechanismus zu verstehen, der die Entdeckung der nächsten Generation zyklischer CPPs unterstützen sollte, um biologische Barrieren mit minimaler Zytotoxizität zu durchdringen. Diese hochaktiven und stabilen CPPs sind vielversprechend für die Verbesserung der Behandlung wichtiger lebensbedrohlicher Krankheiten.
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Diese Arbeit wird von der Natural Science Foundation of China (21708031), der China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
Vacuum manifold | Promega | A7231 |
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