Мышечная модель повреждения брюшины, вызванного хлоргексидином глюконатом

Настоящий протокол устанавливает модель перитонеального фиброза, индуцированного хлоргексидином глюконатом (КГ), у мышей с помощью перитонеального диализа (ПД). Текущая модель проста и удобна в использовании по сравнению с другими моделями PD на животных.

Перитонеальный фиброз является важным осложнением перитонеального диализа (БП). Для исследования и решения этой проблемы требуется соответствующая животная модель БП. Настоящий протокол устанавливает модель перитонеального фиброза, индуцированную хлоргексидином глюконатом (ХГ), которая имитирует состояние пациента с БП. Перитонеальный фиброз был индуцирован внутрибрюшинной инъекцией 0,1% КГ в 15% этаноле в течение 3 недель (вводили через день), в общей сложности девять раз у самцов мышей C57BL / 6. Затем на 22-й день были проведены перитонеальные функциональные пробы. После того, как мыши были принесены в жертву, была собрана париетальная брюшина брюшной стенки и висцеральная брюшина печени. Они были толще и более фиброзными при микроскопическом анализе после трихромного окрашивания Массона. Скорость ультрафильтрации снизилась, а массовый транспорт глюкозы указал на индуцированное ХГ увеличение проницаемости брюшины. Созданная таким образом модель БП может быть применена для улучшения технологии БП, эффективности диализа и продления выживаемости пациентов.

Перитонеальный диализ (ПД) является одним из видов заместительной почечной терапии. Однако у ПД есть проблемы, которые невозможно решить. Например, длительное лечение БП может вызвать повреждение брюшины, что в конечном итоге приведет к неудаче ультрафильтрации и прекращению лечения 1,2,3,4,5,6. Перитонеальный фиброз является одним из самых серьезных осложнений ^7,8. Перитонеальный фиброз характеризуется отложением и накоплением внеклеточного матрикса в интерстиции, а также неоангиогенезом и васкулопатией брюшины ^9,10.

Основными причинами этих перитонеальных изменений являются рецидивирующий перитонит и небиосовместимость диализата, которые являются гиперосмотическими, с высоким содержанием глюкозы, низким рН и накоплением продуктов распада глюкозы^11,12. Таким образом, подходящие экспериментальные модели на животных могут помочь исследователям лучше изучить физиологические и патологические изменения брюшины во время терапии БП. Таким образом, создание модели БП животных важно для улучшения технологии БП и эффективности диализа, а также для продления выживаемости пациентов. Это исследование было направлено на создание модели БП у мышей путем внутрибрюшинной (внутривенной) инъекции хлоргексидина глюконата (КГ), как описано ранее^13,14. Эта модель мыши PD проста, удобна в использовании и осуществима по сравнению с другими моделями PD животных.

Все эксперименты на мышах были одобрены Центром лабораторных животных больницы E-DA / Университета I-Shou и проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (NRC, США 2011 г.). Для настоящего исследования использовали самцов мышей C57BL/6 в возрасте 7-8 недель.

1. Химическая подготовка

1. Приготовьте химический раздражитель, разбавив 0,1% хлоргексидина глюконата (CG, см. Таблицу материалов) в 15% этаноле.

2. Лечение животных

1. Назначьте трех мышей в качестве контрольной группы. Выполняйте внутрибрюшинную инъекцию (в/) 1 мл/кг 0,9% физиологического раствора (НС) через день в течение 3 недель, всего девять раз.
2. Назначьте трех мышей в группу перитонеального фиброза. Индуцировать перитонеальный фиброз с помощью хлоргексидина глюконата (ХГ) путем внутримышечного введения 0,1% ХГ в 15% этаноле (этап 1.1) в дозе 12,5 мкл / г массы тела. Выполняйте это через день в течение 3 недель, всего девять раз.

3. Тесты функции брюшины (модифицированный тест перитонеального равновесия)

1. Приготовьте диализирующий раствор, содержащий 4,25% глюкозы. Возьмите 0,5 мл образца диализата с помощью шприца, а затем проверьте концентрацию глюкозы в образце диализата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация глюкозы определяется по методу гексокиназы/G6PD. Образцы диализата были подвергнуты анализу Glu 2 L-типа и исследованы с помощью биохимического анализатора (см. Таблицу материалов). Это начальная концентрация глюкозы диализата.
2. Обезболивают мышей внутримышечным введением Золетила и Ксилазина (приготовленных в соотношении 1:2 по объему, см. Таблицу материалов) в дозе 20 мкл/20 гв. Кроме того, используйте ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
3. Проводят внутривенную инстилляцию диализирующего раствора (2 мл/20 г массы тела).
4. Через 30 минут оцените и проверьте глубину анестезии при отсутствии рефлекса защемления пальцев ног. Затем выполните вертикальный разрез по средней линии брюшной полости (под мечевидным отростком), затем откройте брюшную полость мышей и соберите внутрибрюшинную жидкость с помощью шприца (определяемого как «объем 1»). Затем измерьте вес чистого и сухого хлопка и поместите вату в брюшную полость мышей, чтобы поглотить остаточную внутрибрюшинную жидкость. Наконец, снова измерьте вес хлопка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прибавка в весе хлопка равна весу остаточной внутрибрюшинной жидкости. Затем преобразуйте в полученный объем (удельный вес: 1 г/^см3; определяется как «объем 2»). Окончательный объем диализата составляет том 1 плюс том 2.
5. Используйте 0,5 мл образца диализата (конечный диализат) для измерения концентрации глюкозы. Это конечная концентрация глюкозы диализата.
6. Рассчитайте чистую ультрафильтрацию по формуле¹⁵:
   
7. Рассчитайте проницаемость брюшины по следующей формуле¹⁵:
   

4. Тканевая подготовка мышц брюшной стенки и печени и гистологический анализ

1. Принесите мышей в жертву с помощью пункции сердца (флеботомии)^3,16.
2. Разрез брюшной стенки (1 см х 1 см) и тотальная гепатэктомия. Зафиксируйте брюшную стенку и ткани печени мышей на ночь в 10% нейтральном буферном формалине.
3. Подготовьте парафиновые срезы мышц брюшной стенки и печени толщиной 3 мкм и проведите гистологический анализ в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹⁷.
4. Оцените париетальную брюшину брюшной стенки и висцеральную брюшину поверхности печени мышей с помощью морфометрии¹⁸.
5. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для статистики и построения графиков (см. Таблицу материалов). Выразите все данные как среднее ± SD и проанализируйте статистическую значимость с помощью t-критерия¹⁹. Определите значения с P < 0,05 как значимые результаты.

На рисунке 1A, B париетальная брюшина брюшной стенки была заметно толще и более фиброзной при трихромном окрашивании^{Массона 17}, что указывает на то, что в группе, подвергшейся воздействию ХГ, перитонеальный фиброз более тяжелый, чем в контрольной группе с физиологическим раствором (NS). На рисунке 2A, B висцеральная брюшина поверхности печени также была заметно толще и более фиброзной, что доказывает, что в группе, подвергшейся воздействию ХГ, перитонеальный фиброз более тяжелый, чем в контрольной группе с физиологическим раствором (NS). На рисунке 3А скорость ультрафильтрации снизилась в группе ХГ, а транспорт массы глюкозы показал, что перитонеальная проницаемость увеличилась в группе, индуцированной ХГ (рис. 3В).

Рисунок 1: Фиброз париетальной брюшины брюшной стенки на мышиной модели перитонеального диализа (ПД). (A) В группе, подвергшейся воздействию ХГ, перитонеальный фиброз является более тяжелым, чем в контрольной группе (НС) при трихромном окрашивании Массона. В) количественные данные по подпункту (А), представленные в виде среднего ± стандартного отклонения, n ≥ 3; P < 0,01. Для (A) масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Фиброз висцеральной брюшины поверхностей печени на мышиной модели перитонеального диализа (ПД). (A) Для группы, подвергшейся воздействию ХГ, перитонеальный фиброз является более тяжелым, чем в контрольной группе (NS) при трихромном окрашивании Массона. В) количественные данные по подпункту (А), представленные в виде среднего ± стандартного отклонения, n ≥ 3; P < 0,005. Для (A) масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Ухудшение функции брюшины в мышиной модели БП. (A) В группе, подвергшейся воздействию хлоргексидина глюконата (CG), скорость ультрафильтрации была значительно ниже, чем в контрольной группе физиологического раствора (NS). (B) Массовый транспорт глюкозы также указывал на то, что CG-индуцировал увеличение перитонеальной проницаемости. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения, n ≥ 3; P < 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этом исследовании модель БП мыши представлена внутримышной инъекцией ХГ, и результаты показали перитонеальный фиброз и функциональное ухудшение в этой модели, которая имитировала состояние пациента с БП.

В протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, для выполнения внутривенной инъекции CG или NS кожа брюшной стенки мыши должна быть подобрана с помощью щипцов, чтобы предотвратить индуцированное пункцией внутрибрюшинное повреждение органов. Во-вторых, при сборе брюшины брюшной стенки для гистологического анализа следует избегать области, поврежденной внутривенными инъекциями.

Среди нескольких экспериментальных моделей перитонеального фиброза на животных наиболее распространенной является модель CG из-за ее простоты использования и адаптируемости. Suga et ^al.20 были первыми, кто сообщил о модели перитонеального фиброза крыс, индуцированной CG, в 1995 году. Внутривенные инъекции 0,1% КГ и 15% этанола, растворенного в 2 мл физиологического раствора, применяли ежедневно в течение 26 дней. IshiI et ^al.21 использовали мышей C57BL / 6 и вводили 0,3 мл 0,1% CG с 15% этанолом, растворенным в физиологическом растворе, внутримышечно в течение 56 дней, где у мышей был индуцирован экспериментальный склерозирующий инкапсулирующий перитонит. Nishino et al.22 использовали крыс Wistar, которые получали внутримышечно инъекции 0,1% CG в день в 15% этаноле, растворенном в 2 мл физиологического раствора в течение ²⁸ дней. Mishima et ^al.23 использовали аналогичный метод для индукции перитонеального фиброза у крыс Sprague-Dawley (SD) в том же году. Kushiyama et al.24 использовали крыс SD и вводили 0,1% CG в 15% этаноле, растворенном в физиологическом растворе (1,5 мл / 100 г массы тела) внутримышечно три раза в неделю в течение ²¹ дня. Nishino et ^al.25 использовали мышей ежедневно, вводя инъекцию 0,1% CG в 15% этанол внутрибрюшинно, растворенный в 0,2 мл физиологического раствора в течение 7 дней и 15 дней. Lua et ^al.26 использовали тамоксифен, эмульгированный в кунжутном масле в концентрации 12,5 мг/мл, растворенный в этаноле, и внутривенно вводили мышам в дозе 100 мг/г массы тела в течение 3-дневного интервала. Через 2 недели мышам вводили 0,1% КГ в 15% физиологическом растворе с этанолом / фосфатом (1,5 мл / 100 г) через день, в общей сложности 10 доз. Yoh et al.14 использовали крыс SD и вводили 1,5 мл / 100 г массы тела 0,1% CG в ¹⁵ % этаноле, растворенном в физиологическом растворе, инъекции три раза в неделю в течение 21 дня. Yoh et al. использовали 10-недельных мышей и вводили 0,1% CG (0,01 мл / г массы тела) в инъекциях 15% этанола три раза в неделю в течение 21 дня. В том же году lo et ^al.13 также использовали аналогичный метод.

Данная модель имеет некоторые ограничения. Во-первых, в этой модели на животных CG использовалась в качестве химического стимулятора для индукции функционального ухудшения из-за перитонеального фиброза вместо диализата. CG является химическим раздражителем, и его повторное введение может привести к дегенерации мезотелиальных клеток и воспалительным реакциям, вызывая тем самым чрезмерный фиброз. Наблюдалось воспаление и неоваскуляризация, и эти результаты были аналогичны тем, которые наблюдались у пациентов с БП. Хотя инъекции CG приводят к значительному утолщению брюшины, предыдущее исследование показало, что отложение фибрина было относительно слабее²⁷. Во-вторых, у мышей, использованных в настоящем исследовании, не было заболеваний почек; Следовательно, влияние уремических токсинов на брюшину оценить не удалось. В-третьих, мы не оценивали воспаление, ангиогенез и отложение внеклеточного матрикса в брюшине. Однако, согласно предыдущему исследованию¹³, та же животная модель уже показала, что количество как F4/80-положительных клеток, так и CD31-положительных сосудов увеличивается после воздействия ХГ. Поэтому необходимо отметить, что результаты, полученные на этой животной модели, не могут в полной мере отражать состояние БП у пациентов с перитонеальным диализом. У пациентов с БП механизм повреждения брюшины сложен и может следовать различным схемам.

Несмотря на все эти ограничения, настоящая модель проста, удобна в использовании и осуществима по сравнению с другими моделями БП на животных, согласно предыдущим исследованиям 3,13,14,16,18,25. Этот метод представляет собой модель перитонеального фиброза, связанную с БП, которая может быть применена к полевым исследованиям БП.

Авторам раскрывать нечего.

Мы искренне благодарим Шин-Хан Ценга за критическое обсуждение и частичное выполнение исследования. Это исследование было поддержано EDAHP110003 и NCKUEDA110002 из Исследовательского фонда больницы E-DA и Национального университета Ченг Кунг, Тайвань.