Um modelo de dano peritoneal induzido por gluconato de clorexidina em camundongos

O presente protocolo estabelece um modelo de diálise peritoneal (DP) em camundongos de fibrose peritoneal induzida por gluconato de clorexidina (GC). O modelo atual é simples e fácil de usar em comparação com outros modelos animais de DP.

A fibrose peritoneal é uma importante complicação da diálise peritoneal (DP). Para investigar e resolver esse problema, um modelo animal apropriado de DP é necessário. O presente protocolo estabelece um modelo de fibrose peritoneal induzida por gluconato de clorexidina (GC) que mimetiza a condição de um paciente com DP. A fibrose peritoneal foi induzida pela injeção intraperitoneal de 0,1% de GC em etanol a 15% por 3 semanas (administrada em dias alternados), totalizando nove vezes em camundongos C57BL/6 machos. Os testes funcionais peritoneais foram então realizados no 22º dia. Após o sacrifício dos camundongos, o peritônio parietal da parede abdominal e o peritônio visceral do fígado foram retirados. Eles eram mais espessos e fibróticos quando analisados microscopicamente após a coloração tricrômico de Masson. A taxa de ultrafiltração diminuiu, e o transporte de massa de glicose indicou um aumento da permeabilidade peritoneal induzido por CG. O modelo de DP assim estabelecido pode ter aplicações no aprimoramento da tecnologia de DP, eficácia dialítica e prolongamento da sobrevida dos pacientes.

A diálise peritoneal (DP) é um tipo de terapia renal substitutiva. No entanto, a DP tem problemas que não podem ser resolvidos. Por exemplo, o tratamento prolongado da DP pode causar dano peritoneal, eventualmente levando à falha da ultrafiltração e à suspensão do tratamento 1,2,3,4,5,6. A fibrose peritoneal é uma das complicações mais^graves7,8. A fibrose peritoneal é caracterizada pela deposição e acúmulo de matriz extracelular no interstício, neoangiogênese e vasculopatia do peritônio9,10.

As principais causas dessas alterações peritoneais são as peritonites recorrentes e a não biocompatibilidade do dialisato, que são hiperosmóticas, glicose elevada, pH baixo e acúmulo de produtos da degradação da glicose^11,12. Portanto, modelos experimentais animais adequados podem ajudar os pesquisadores a estudar melhor as alterações fisiológicas e patológicas do peritônio durante a terapia da DP. Portanto, o estabelecimento de um modelo animal de DP é importante para melhorar a tecnologia de DP e a eficácia dialítica e prolongar a sobrevida dos pacientes. Este estudo teve como objetivo gerar um modelo de DP em camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) de gluconato de clorexidina (CG), conforme descrito anteriormente^13,14. Este modelo de camundongo PD é simples, fácil de usar e viável em comparação com outros modelos animais PD.

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Laboratory Animal Center do E-DA Hospital/ I-Shou University e manuseados de acordo com o "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, EUA 2011). Camundongos C57BL/6 machos, com 7-8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo.

1. Preparação química

1. Preparar o irritante químico diluindo gluconato de clorexidina a 0,1% (CG, ver Tabela de Materiais) em etanol a 15%.

2. Tratamento dos animais

1. Atribua três ratos como grupo de controle. Realizar injeção intraperitoneal (i.p.) de 1 mL/kg de solução fisiológica (SF) a 0,9% em dias alternados por 3 semanas, totalizando nove vezes.
2. Atribua três camundongos ao grupo de fibrose peritoneal. Induzir fibrose peritoneal usando gluconato de clorexidina (GC) administrando injeções i.p. de 0,1% de GC em etanol a 15% (passo 1.1) na dose de 12,5 μL/g de peso corporal. Realize isso a cada dois dias por 3 semanas, por um total de nove vezes.

3. Testes de função peritoneal (teste de equilíbrio peritoneal modificado)

1. Preparar uma solução de diálise contendo 4,25% de glicose. Extrair 0,5 ml de amostra de dialisato com uma seringa e, em seguida, verificar a concentração de glicose na amostra de dialisato.
   NOTA: A concentração de glicose é determinada de acordo com o método hexoquinase/G6PD. As amostras de dialisato foram acessadas para o ensaio de Glu 2 do tipo L e investigadas com um analisador bioquímico (ver Tabela de Materiais). Esta é a concentração inicial de glicose do dialisato.
2. Anestesiar os ratinhos por injeção intramuscular de Zoletil e Xilazina (preparados numa proporção de 1:2 por volume, ver Tabela de Materiais) na dose de 20 μL/20 gw. Além disso, use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
3. Realizar instilação i.p. da solução de diálise (2 mL/20 g de peso corporal).
4. Após 30 min, avaliar e verificar a profundidade da anestesia com ausência do reflexo de pinça dos dedos. Em seguida, realizar uma incisão vertical na linha média do abdome (abaixo do processo xifoide), em seguida, abrir o abdome dos camundongos e coletar o líquido intraperitoneal com uma seringa (definido como "volume 1"). Em seguida, meça o peso de um algodão limpo e seco e coloque o algodão na cavidade abdominal dos camundongos para absorver o líquido intraperitoneal residual. Por fim, meça novamente o peso do algodão.
   OBS: O ganho de peso do algodão é igual ao peso do líquido residual intraperitoneal. Em seguida, converta para o volume obtido (gravidade específica: 1 g/cm³; definido como "volume 2"). O volume final do dialisato é o volume 1 mais o volume 2.
5. Use 0,5 mL de amostra de dialisato (dialisato final) para medir a concentração de glicose. Esta é a concentração final de glicose do dialisato.
6. Calcule a ultrafiltração líquida usando a fórmula¹⁵:
   
7. Calcular a permeabilidade peritoneal utilizando a seguinte fórmula¹⁵:
   

4. Preparo tecidual do músculo da parede abdominal e fígado e análise histológica

1. Sacrificar os camundongos por punção cardíaca (flebotomia)^3,16.
2. Corte da parede abdominal (1 cm x 1 cm) e hepatectomia total. Fixe a parede abdominal e os tecidos hepáticos dos ratos durante a noite em formalina tamponada neutra a 10%.
3. Preparar cortes de parafina de 3 μm de espessura do músculo da parede abdominal e do fígado e realizar análise histológica seguindo relato publicado anteriormente¹⁷.
4. Avaliar o peritônio parietal da parede abdominal e o peritônio visceral das superfícies hepáticas dos camundongos utilizando morfometria¹⁸.
5. Realizar análises estatísticas usando estatística e software gráfico (consulte Tabela de Materiais). Expresse todos os dados como média ± DP e analise a significância estatística usando um teste t¹⁹. Defina valores com P < 0,05 como resultados significativos.

Na Figura 1A,B, o peritônio parietal da parede abdominal era marcadamente mais espesso e fibrótico pela coloração tricrômico de ^Masson17, indicando que no grupo exposto ao GC a fibrose peritoneal é mais grave do que no grupo controle com solução salina (NS). Na Figura 2A,B, o peritônio visceral das superfícies hepáticas também era marcadamente mais espesso e fibrótico, comprovando que no grupo GC-exposto a fibrose peritoneal é mais grave do que no grupo controle salino (NS). Na Figura 3A, a taxa de ultrafiltração diminuiu no GC, e o transporte de massa de glicose indicou que a permeabilidade peritoneal aumentou no GC induzido (Figura 3B).

Figura 1: Fibrose do peritônio parietal da parede abdominal em modelo de diálise peritoneal (DP) em camundongo. (A) Para o grupo exposto ao GC, a fibrose peritoneal é mais grave do que no grupo controle (NS) pela coloração tricrômico de Masson. (B) Dados quantificados de (A) representados como média ± desvio padrão, n ≥ 3; P < 0,01. Para (A), barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fibrose do peritônio visceral das superfícies hepáticas em modelo de diálise peritoneal (DP) em camundongo. (A) Para o grupo exposto ao GC, a fibrose peritoneal é mais grave do que no grupo controle (NS) sob coloração tricrômico de Masson. (B) Dados quantificados de (A) representados como média ± desvio padrão, n ≥ 3; P < 0,005. Para (A), barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Deterioração da função peritoneal no modelo de camundongo PD. (A) No grupo exposto ao gluconato de clorexidina (GC), a taxa de ultrafiltração foi significativamente menor do que no grupo solução salina controle (NS). (B) O transporte de massa de glicose também indicou que o GC induziu aumento da permeabilidade peritoneal. Os dados são representados como média ± desvio padrão, n ≥ 3; P < 0,005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste estudo, um modelo de DP em camundongos é apresentado por injeção i.p. de GC, e os resultados mostraram fibrose peritoneal e deterioração funcional neste modelo, o que mimetizou a condição do paciente em DP.

Há várias etapas críticas no protocolo. Primeiro, para a realização de uma injeção i.p. de GC ou NS, a pele da parede abdominal do camundongo deve ser captada com fórceps para evitar lesão intraperitoneal induzida por punção. Em segundo lugar, durante a coleta do peritônio da parede abdominal para análises histológicas, a área danificada por injeções i.p. deve ser evitada.

Dentre os diversos modelos experimentais animais de fibrose peritoneal, o mais comum é o modelo CG devido à sua facilidade de uso e adaptabilidade. Suga et ^al.20 foram os primeiros a relatar um modelo de fibrose peritoneal induzida por CG em ratos, em 1995. Injeções i.p. de 0,1% CG e 15% de etanol dissolvido em 2 mL de solução salina foram usadas diariamente por 26 dias. IshiI et ^al.21 utilizaram camundongos C57BL/6 e administraram 0,3 mL de CG 0,1% com etanol a 15% dissolvido em injeção i.p. de solução salina por um total de 56 dias, onde uma peritonite esclerosante encapsulante experimental foi induzida em camundongos. Nishino et al.22 utilizaram ratos Wistar que receberam injeções i.p. de GC 0,1% diariamente em etanol a 15% dissolvido em 2 mL de solução salina por ²⁸ dias. Mishima et ^al.23 utilizaram método semelhante para induzir fibrose peritoneal em ratos Sprague-Dawley (SD) no mesmo ano. Kushiyama et al.24 utilizaram SD em ratos SD e administraram GC 0,1% em etanol 15% dissolvido em solução salina (1,5 mL/100 g de peso corporal) injeções i.p. três vezes por semana durante ²¹ dias. Nishino et ^al.25 utilizaram camundongos diariamente, administrando uma injeção de GC 0,1% em etanol a 15% por via intraperitoneal, dissolvido em 0,2 mL de solução salina por 7 dias e 15 dias. Lua et ^al.26 utilizaram tamoxifeno emulsionado em óleo de gergelim na dose de 12,5 mg/mL, dissolvido em etanol e injetado i.p. em camundongos na dose de 100 mg/g de peso corporal durante um intervalo de 3 dias. Após 2 semanas, CG 0,1% em solução salina tamponada com etanol/fosfato a 15% (1,5 mL/100 g) foi injetada nos camundongos em dias alternados para um total de 10 doses. Yoh et al.14 utilizaram ratos SD e administraram 1,5 mL/100 g de peso corporal de GC 0,1% em etanol a ¹⁵ % dissolvido em injeções intravenosas de solução salina três vezes por semana durante 21 dias. utilizaram camundongos de 10 semanas de idade e administraram CG 0,1% (0,01 ml/g de peso corporal) em injeções de etanol i.p. a 15% três vezes por semana por um total de 21 dias. No mesmo ano, lo et ^al.13 também utilizaram método semelhante.

O presente modelo apresenta algumas limitações. Primeiro, neste modelo animal, o GC foi usado como estimulante químico para induzir deterioração funcional devido à fibrose peritoneal em vez de dialisato. O GC é um irritante químico e sua administração repetida pode levar à degeneração das células mesoteliais e respostas inflamatórias, causando fibrose excessiva. Inflamação e neovascularização foram observadas, e esses achados foram semelhantes aos observados em pacientes com DP. Embora as injeções de CG resultem em espessamento peritoneal significativo, um estudo anterior mostrou que a deposição de fibrina foi relativamente mais fraca²⁷. Em segundo lugar, os camundongos utilizados no presente estudo não apresentavam doença renal; consequentemente, o efeito das toxinas urêmicas sobre o peritônio não pôde ser avaliado. Terceiro, não avaliamos inflamação, angiogênese e deposição de matriz extracelular no peritônio. Entretanto, de acordo com estudo^anterior13, o mesmo modelo animal já demonstrou que o número de células F4/80 positivas e de vasos CD31 positivos aumentou após a exposição ao GC. Portanto, deve-se ressaltar que os resultados obtidos neste modelo animal não podem representar totalmente a condição de DP em pacientes em diálise peritoneal. Em pacientes com DP, o mecanismo de dano peritoneal é complexo e pode seguir diferentes padrões.

Apesar de todas essas limitações, o presente modelo é simples, fácil de usar e viável quando comparado a outros modelos animais de DP, conforme estudos prévios 3,13,14,16,18,25. Este método representa um modelo de fibrose peritoneal relacionada à DP que pode ser aplicado à pesquisa de campo em DP.

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecemos sinceramente a Shin-Han Tseng pela discussão crítica e execução parcial do estudo. Este estudo foi apoiado por EDAHP110003 e NCKUEDA110002 da Fundação de Pesquisa do Hospital E-DA e da Universidade Nacional Cheng Kung, Taiwan.