Method Article
В этой статье мы представляем протокол обнаружения олигодендроцитов, нагруженных микротрубочками, в модели тубулинопатии с помощью простого, инновационного подхода к микроскопии второй гармонической генерации.
Удовлетворительная визуализация цитоскелетных компонентов в головном мозге является сложной задачей. Повсеместное распределение сетей микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных нитей во всех нервных тканях вместе с изменчивостью результатов стратегий слияния флуоресцентных белков и их ограниченной применимостью к динамическим исследованиям антител и лекарств в качестве хромофорных носителей делают классические оптические подходы не такими эффективными, как для других белков. Когда тубулин необходимо изучить, генерация вторых гармоник без меток является очень подходящим вариантом из-за нецентросимметричной организации молекулы. Этот метод при сопряжении с микроскопией может качественно описать объемное распределение параллельных пучков микротрубочек в биологических образцах, с дополнительным преимуществом работы со свежими тканями, которые являются нефиксированными и неразрывноженными. В этой работе описывается, как изобразить тубулин с помощью коммерческой микроскопии второй гармонической генерации для выделения микротрубочек в обогащенных тубулином структурах олигодендроцитов, как при гипомиелинизации с атрофией базальных ганглиев и тубулинопатии мозжечка (H-ABC), недавно описанного расстройства миелина.
Оптическая визуализация цитоскелетных структур в тканях и препаратах органов – непростая задача. Цитоскелетные нити распространены повсеместно, поэтому, если общее окрашивание выполняется, например, против альфа-тубулина или бета-актина или потенциально кератина в образце эпителия, сигнал, вероятно, будет распределен довольно однородно по всему образцу. Чтобы ограничить окрашивание более значимым подмножеством клеточных компонентов, можно либо использовать трансгенных мышей с целевой экспрессией1, либо планировать использование изоформ-специфических антител. В то время как очень немногие из последних представлены на рынке (и очень немногие из них существуют вообще 2,3,4), трансгенная модель животных может быть доступна. Тем не менее, он должен быть приобретен лабораторией и должным образом размещен, со всеми расходами, связанными с процессом. Некоторые антитела или химические вещества, например, флуорофор-конъюгированные препараты, такие как фаллоидин или паклитаксел, могут быть частично или полностью несовместимы с использованием в живых клетках или тканях, что ограничивает их применимость только к исследованиям фиксированных образцов.
В случае тубулина необходимо учитывать дополнительный аспект, которым является чувствительность полимера к фиксации. Традиционная химическая фиксация формальдегидом известна тем, что не является адекватной для оптимального сохранения целостности микротрубочек5. Кроме того, недавний отчет подтверждает, что сшивание формальдегида вызывает тонкие изменения в ультраструктуре микротрубочек, аналогичные тому, что происходит при связывании некоторых лекарств или физиологических молекул, таких как GTP6.
Поэтому прямая визуализация микротрубочек в незапятнанных, неповрежденных образцах часто желательна. Для достижения этого одним из технических решений является микроскопия второй гармонической генерации (SHG)7, которая основана на способности пучков параллельных микротрубочек действовать как гармониофоры и излучать удвоенный по частоте свет при правильном освещении интенсивным импульсным инфракрасным лазером. Хотя более сильный и стабильный второй гармонический сигнал может быть получен из коллагена и миозина, которые являются единственными двумя другими биологическими материалами, которые, как известно, способны к удвоению частоты, сигнал от тубулина до сих пор использовался в основном для изучения митотических перестроек веретена 8,9,10 и морфологии аксональных микротрубочек 11,12,13.
В этой работе мы представляем новое использование микроскопии SHG в качестве диагностического инструмента для различения тканей центральной нервной системы (ЦНС), пораженных тубулинопатией бета-4 А (TUBB4A), от их здоровых аналогов14. Некоторые из мутаций, происходящих в этой преимущественно нейронной изоформе тубулина, например, вызывающие гипомиелинизацию и атрофию базальных ганглиев и мозжечка (H-ABC), вызывают переполнение микротрубочек в олигодендроцитах15,16; цитоскелетные изменения, в свою очередь, связаны с последующими эффектами, такими как дисмиелинизация, с глубоким нарушением двигательных и сенсорных путей 16,17,18,19. Модель тайеповых мышей, используемая в этой работе, отображает аномальное содержание микротрубочек в олигодендроцитах и повторяет большинство сенсорно-моторных симптомов пациентов h-ABC17. Протокол объясняет, как визуализировать такие структуры, как мозолистое тело и мозжечок, которые обычно сильно миелинизированы и которые серьезно страдают у пациентов на людях, а также у крысы тайепа 19, чтобы подчеркнуть различия в сигналах SH между здоровыми и мутантными тканями.
Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с законами и кодексами, утвержденными в седьмом названии Положения Общего закона о здравоохранении, касающегося исследований в области здравоохранения правительства Мексики (NOM-062-ZOO-1999), и в соответствии с рекомендациями Руководства национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию, и были одобрены институциональным комитетом по биоэтике в исследованиях Университета Гуанахуато и Автономного университета Бенемериты. Пуэбла.
1. Настройки микроскопа
2. Предварительный контроль микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните предварительное управление микроскопом один раз, если настройка не изменена.
3. Извлечение тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте чистые инструменты для выполнения хирургических процедур.
4. Вибратомное секционирование
5. Перенос в микроскоп
6. Визуализация
7. Обработка мозжечка
Изображения, полученные с помощью данной методики, имеют внутренний низкий фоновый уровень из-за очень ограниченного количества гармоникофоров, присутствующих в биологических тканях, что является одним из существенных преимуществ метода.
Когда волокна мозолистого тела визуализируются, волокнистые короткие структуры и округлые элементы могут быть последовательно найдены в мозге тайепа (рисунок 3B), в то время как мозолистое тело контрольного мозга показывает гораздо более гетерогенный и изотропный сигнал по всей области мозга (рисунок 3A). Происхождение дифференциального сигнала лежит именно во втором явлении генерации гармоник, поскольку добавление узкополосного фильтра только уменьшает неспецифическую интенсивность сигнала от контрольных изображений (рисунок 3C-D), при этом выборочно удаляя этот низкий, диффузный сигнал вокруг сомоподобных и коротких, вытянутых структур на изображениях тайепа, которые всегда генерируют интенсивный свет SH (рисунок 3E-F).
Другая проанализированная структура, мозжечковое белое вещество, дает сопоставимые результаты. В частности, в то время как в контрольной ткани наблюдается почти полное отсутствие сигнала SH (рисунок 4B), а клетки Пуркинье едва заметны при использовании фильтра коротких частот, удлиненные и округлые структуры сохраняются на изображении SH из тайепной ткани (рисунок 4D).
Рисунок 1: Микроскоп и секционирование. (A) Схема используемого микроскопа с выделенными соответствующими компонентами. Стрелки: 1 = порт NDD, где SP485 расположен близко к детектору; 2 = съемные рамы, в которых размещен BP405; 3 = положение под целью, где полуволновая пластина (HWP) размещается для контрольных экспериментов. Вставка показывает кадр, в который может быть вставлен HWP. (B) Вид сверху буферного лотка вибратома со склеенным мозгом, готовым к тонкому сечению. (C) Оригинальная (верхняя) и модифицированная (нижняя) пипетка Пастера, используемая для переноса секций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Предварительный контроль. (A) Сигнал SHG, излучаемый зернами кукурузного крахмала, показывает преобладающую ориентацию, которая совпадает с направлением колебаний лазера (в данном случае горизонтально). (B) После вставки полуволновой пластины с быстрой осью, ориентированной на 45° по отношению к горизонтали, сигнал поворачивается на 90°. (C) Слияние сигнала до и после вставки полуволновой пластины. (D) Сигнал ниже 485 нм, излучаемый зернами кукурузного крахмала. (E) Сигнал SHG от крахмальных зерен, обнаруженный при 405/10 нм. F) График, показывающий сопоставление двух сигналов, соответствующих линейному сканированию, показанному в увеличенных вставках D и E. Используемый фильтр SHG приводит к незначительным потерям сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изображения SHG из тайепа и мозолистого тела WT. Репрезентативные примеры сигналов (A) WT и (B) taiep , полученных от мозолистого тела. (C) SP485 отфильтрованное изображение мозолистого тела WT. (D) BP405 отфильтрованное изображение из того же образца, что и в C. (E) SP485 отфильтрованное изображение из мозолистого тела тайепа . (F) BP405 отфильтрованное изображение того же образца, что и в E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Снимки SHG с мозжечков тайепа и WT. Репрезентативные примеры сигналов (A-B) WT и (C-D) taiep, полученных от мозжечковой фолии. (A) Отфильтрованное sp485 изображение из фолиевого листа WT; видны только некоторые клетки Пуркинье. (B) Отфильтрованное BP405 изображение из того же образца, что и в A. (C) Отфильтрованное sp485 изображение из фолиевого фолия. (D) Отфильтрованное BP405 изображение того же образца, что и в C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Примеры артефактов. (A) Артефакт, вызванный высыханием образца. (B) Артефакт из-за чрезмерного воздействия. Шкала: 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Выравнивание Кёлера. В файле представлены шаги для выполнения выравнивания Köhler. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Шаги программного обеспечения ZEN для получения изображений SHG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Микроскопия SHG является частью группы нелинейных оптических методов, которые включают в себя двухфотонную микроскопию возбуждения, микроскопию генерации третьей гармоники и когерентную рамановскую рассеянную микроскопию против Стокса, которые способствовали расширению спектра применения обычной оптической микроскопии в науках о жизни20.
В частности, основные сильные и слабые стороны микроскопии SHG связаны с одним и тем же состоянием: генератор сигналов нецентросимметричен21. Такое специфическое архитектурное состояние часто встречается в царстве неорганических и органических кристаллов, но редко встречается среди биологических объектов. Вместе с коллагеном и мышечным миозином микротрубочки способны генерировать второй гармонический сигнал22, который может быть обнаружен с помощью микроскопа, если в пучках параллельных полимеров происходит достаточное суммирование. Внутри клеток тубулин связывается с образованием параллельных пучков в ядрах аксонов (специфическое расположение клеток), в митотических веретенах (височно-специфическое распределение) и, как представлено в этой работе, в фирменной ассоциации микротрубочек недавно описанной тубулинопатии-гипомиелинизации с атрофией базальных ганглиев и мозжечка, или H-ABC (которая представляет собой первое зарегистрированное патологическое распределение такого рода)14, 16,23.
Этот сенсомоторный синдром по-прежнему является орфанным заболеванием, так как многие неврологи еще не знакомы со всеми симптомами и / или не могут позволить себе генетический скрининг подозреваемых пациентов для подтверждения диагноза, что, скорее всего, вызывает недодиагностику, по крайней мере, в некоторых популяциях. Кроме того, мало что известно о патологии на молекулярном и клеточном уровне, поэтому методы, которые могли бы помочь пролить свет на конкретные механизмы этого дегенеративного процесса, очень ценны, в том числе и на базовом уровне.
Поэтому предлагаются два применения микроскопии SHG в отношении этого миелинного расстройства. В долгосрочной перспективе микроскопия SHG может быть интегрирована в диагностические подходы к скринингу биопсии или прямому внутричерепному анализу, но наибольшее влияние может быть связано с попыткой расшифровать молекулярную основу заболевания.
Существует много преимуществ микроскопии SHG по сравнению с другими методами микроскопии. Действительно, микроскопия SHG не требует фиксации ткани, что является особенно деликатным этапом подготовки образца в случае микротрубочек, и не требует окрашивания любого рода. Наибольшее преимущество связано с физическим явлением. С одной стороны, из-за практически отсутствующего фона он обеспечивает высокую контрастность, несмотря на слабые генерируемые сигналы, а с другой стороны, поскольку интенсивность света, необходимая для удвоения частоты, очень высока, и эти интенсивности встречаются только в очень ограниченном объеме образца, метод обеспечивает внутреннее оптическое сечение, что позволяет проводить 3D-реконструкции.
Основные ограничения этого метода микроскопии связаны со стоимостью оборудования. Хороший конфокальный микроскоп вместе с импульсным инфракрасным (ИК) лазером необходим для этого применения, и хотя во многих лабораториях нейробиологии доступна двухфотонная система возбуждения, которую можно легко модифицировать в установку SHG, разница в стоимости по сравнению с обычной установкой эпифлуоресценции по-прежнему значительна. Кроме того, как метод, ограниченный дифракцией, на его разрешение влияет использование ИК-света для освещения.
Как и во многих новаторских приложениях, установки, используемые для ранних экспериментов по микроскопии SHG, примененных к наукам о жизни, были полностью настроенными оптическими установками, построенными как открытые системы 11,24,25, что давало экспериментаторам возможность оптимизировать каждый отдельный компонент. Поскольку в лабораториях наук о жизни чаще всего доступ к коммерческой установке, мы хотели проверить, достаточно ли чувствительна одна из этих систем, чтобы обнаружить слабый сигнал, излучаемый пучками тиссулярных микротрубочек, которые, как известно, не являются такими сильными гармоникофорами, как коллаген. Система LSM710 NLO от Zeiss состоит из перевернутого конфокального микроскопа с модулями для неотсканированного обнаружения в режиме передачи и «эпи» и с когерентным перестраиваемым ИК-лазером Chameleon. В связи с когерентным характером явления SHG крайне важно выбрать путь пропускания, чтобы максимизировать сбор удвоенного по частоте света от образца, и, следовательно, обнаружение осуществлялось через конденсатор 0,55 NA путем интеграции. Для освещения образца со дна и приближения конденсатора NA использовался погружной объектив LCI Plan-Neofluar 25X/0.8 NA. С условиями, описанными в этой статье, мы могли надежно обнаружить сигнал от ткани, несущей мутацию TUBB4A, и этот сигнал всегда отсутствовал в контроле.
В отчетном протоколе два шага требовали корректировки для достижения наилучших условий визуализации: толщина участка ткани и открытие диафрагмы конденсатора. Срезы должны быть как можно более тонкими, чтобы предотвратить чрезмерное поглощение, рассеяние и потерю фотонов SH, тем более что цель состоит в том, чтобы получить изображение в передаче из-за когерентной природы физического явления. В нашем случае ограничивающим фактором была консистенция тайепной ткани, которая препятствовала сечению в однородно толстых срезах ниже 160-180 мкм. При обычном выравнивании Кёлера диафрагма конденсатора обычно закрыта примерно на 60% своей площади для создания контраста в продаваемом световом изображении; и наоборот, для этого применения цель состоит в том, чтобы собрать как можно больше фотонов, отсюда и полное открытие диафрагмы.
Это применение микроскопии SHG важно, поскольку оно обеспечивает возможность различать ткань, богатую тубулином, и ткань, богатую тубулином, причем богатая тубулином ткань излучает обнаруживаемый сигнал. Также возможно, что другие еще не описанные мутации тубулинопатии вызывают цитоскелетные расстройства в других тканях26, которые также могут включать обогащение тубулином.
С точки зрения других возможных применений, микроскопия SHG может быть расширена для изучения более слабых сигналов, таких как те, которые присутствуют в тубулин-нормальной ткани, в тонких, диссоциированных аксонах или во внутриклеточных пучках со смешанной полярностью. Для этого изменения настройки, такие как замена воздушного конденсатора конденсатором с более высокой числовой апертурой и/или с погружением или использование более чувствительного детектора, могут иметь важное значение.
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Эта работа была поддержана Национальным советом по вопросам науки и технологий (CONACYT) посредством следующих грантов: infraestructura 226450 для VP-CIO, infraestructura 255277 для V.P. и FORDECYT-PRONACES/194171/2020 для V.H. Мы признаем поддержку Хувенала Эрнандеса Гевары в CIO в создании видео.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены