Высокоскоростной видеомикроскопический анализ для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии

Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является относительно простым в выполнении, быстрым, экономичным и, в опытных руках, достаточно надежным инструментом для первой линии диагностики первичной цилиарной дискинезии, который должен быть доступен в каждом центре, занимающемся диагностикой и лечением тяжелых заболеваний легких.

Первичная цилиарная дискинезия (ПХД) является врожденным расстройством, преимущественно наследуемым по аутосомно-рецессивному признаку. Расстройство вызывает нарушение движения ресничек, что приводит к серьезному нарушению мукоцилиарного клиренса (MCC). Если диагноз не диагностирован или поставлен слишком поздно, состояние приводит к развитию бронхоэктазов и серьезному повреждению легких в более позднем возрасте. Большинство методов диагностики ПХД отнимают много времени и требуют значительных экономических ресурсов для их установления. Высокоскоростной видеомикроскопический анализ (HSVMA) является единственным диагностическим инструментом для визуализации и анализа живых респираторных клеток с бьющимися ресничками in vitro. Он быстрый, экономичный и, в опытных руках, очень надежный в качестве диагностического инструмента для ПХД. Кроме того, классические диагностические меры, такие как просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ), не применимы к некоторым мутациям, поскольку морфологические изменения отсутствуют.

В данной работе описывается процесс сбора респираторных эпителиальных клеток, дальнейшая подготовка образца и процесс HSVMA. Мы также описываем, как очищенные клетки можно успешно удерживать невредимыми и бить, сохраняя их в питательной среде для хранения и транспортировки к месту исследования в тех случаях, когда клиника не обладает оборудованием для выполнения HSVMA. Также показаны видео с патологическими паттернами биения от пациентов с мутацией в гене тяжелой цепи 11 (DNAH11), которая не может быть диагностирована с помощью ТЭМ; результат неубедительной HSVMA из-за инфекции верхних дыхательных путей, а также неудачного расчесывания с наложением эритроцитов. В этой статье мы хотели бы призвать каждое подразделение, занимающееся пульмонологическими пациентами и редкими заболеваниями легких, выполнять HSVMA в рамках своей повседневной диагностики PCD или отправлять образцы в центр, специализирующийся на выполнении HSVMA.

Первичная цилиарная дискинезия (ПХД) является редким наследственным генетическим заболеванием, которое вызывает нарушения в движении бьющихся ресничек. Если его не диагностировать, это приводит к серьезному повреждению легких в более позднем возрасте из-за серьезного нарушения MCC. В прошлом его распространенность, по оценкам, находилась в диапазоне от 1:4000 до 50 000. Из-за неуклонного улучшения диагностики и растущей осведомленности о состоянии, обновления о распространенности ПХД предполагают, что он может быть гораздо более распространенным и, вероятно, в диапазоне от 1:4000 до 20000 вместо ^1,2. Тем не менее, пациенты с ПХД все еще недодиагностированы или диагностированы слишком поздно ^1,3. Таким образом, младенцы с врожденным situs inversus и / или гетеротаксией или перинатальной ринореей, респираторным дистрессом новорожденных, заложенным носом и трудностями кормления должны быть подозреваемыми для PCD. В более позднем возрасте хронический отит, рецидивирующая пневмония, риносинусит и хронический, типичный влажный кашель из-за нарушения MCC являются отличительными симптомами PCD, которые в сочетании с бронхоэктазами и нарушением функции легких продолжаются во взрослом возрасте².

Пациенты с подозрением на наличие ПХД могут быть диагностированы с помощью различных диагностических инструментов. В прошлом TEM считалась золотым стандартом для диагностики первой линии. Однако до 30% случаев ПХД не показывают аномальной ультраструктуры 1,3,4,5,6, требующей иного диагностического подхода. Поэтому все большее число центров и руководящих принципов Европейского респираторного общества (ERS) предлагают комбинацию назального оксида азота (nNO) и HSVMA в качестве диагностики первой линии 1,7,9,10. HSVMA и nNO также являются наиболее экономически эффективными вариантами идентификации пациента с PCD¹¹. Однако, даже если генетическое тестирование было включено в диагностику, следует иметь в виду, что в настоящее время не существует отдельного теста или комбинации тестов, которые могут исключить ПХД со 100% уверенностью ^8,9,10.

Из доступных диагностических вариантов HSVMA является единственным тестом, который фокусируется на живых, покрытых ресничками респираторных клетках и оценивает цилиарный паттерн биения (CBP) и частоту цилиарного биения (CBF). В отличие от ТЕА, результаты HSVMA доступны быстро, обычно в день тестирования, тогда как результаты TEM могут поступать через несколько месяцев после взятия образца. HSVMA может применяться для всех возрастных групп, тогда как nNO требует высокой степени соответствия; попытки использовать его в возрасте до 5 лет обычно оказываются безуспешными¹⁰. В опытных руках HSVMA обладает отличной чувствительностью и специфичностью для диагностики PCD на 100% и 96% соответственно¹².

В этой статье описывается пошаговая процедура выполнения HSVMA, включая сбор дыхательных клеток, покрытых ресничками, из нижней носовой раковины, сохранение собранных клеток в питающей клетки среде для транспортировки к месту исследования и процесс микроскопического видеоанализа для определения CBF и CBP. Кроме того, показаны некоторые видеоклипы от пациентов, сравнивающие нормальные CBP и CBF с аномальной функцией ресничек (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 и Video 8).

Заявление об этике:

Это исследование было одобрено местным комитетом по этике (69/2017) и было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Сбор и транспортировка респираторных эпителиальных клеток

1. Чистки
   1. Перед чисткой зубов введите пациенту двухнедельный курс пероральной амоксициллин-клавулановой кислоты для уничтожения биопленок, мешающих функции ресничек. Убедитесь, что антибиотик прекращен за 2 дня до процедуры.
   2. Чтобы уменьшить наложение слизистого материала на полоски эпителиальных клеток, попросите пациента тщательно выморкаться. Попросите родителей помочь своим маленьким детям сморкаться.
   3. Для чистки щеткой используйте межзубную щетку размером 0,6 мм (см. Таблицу материалов). Держите голову пациента неподвижной одной рукой, а другой рукой расчесывайте нижнюю носовую раковину обеих ноздрей, чтобы собрать достаточное количество полосок эпителиальных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое сопротивление обычно наблюдается при вставке межзубной щетки глубоко под нижнюю носовую раковину. Чистка носа осуществляется быстрым поворотом и отбором в течение примерно 2 с. Более длительное и интенсивное расчесывание может в противном случае привести к серьезному повреждению эпителия и последовательному эпистаксису.
   4. Если бронхоскопия планируется по причинам, отличным от подозрения на ПХД, соберите образцы во время бронхоскопии путем чистки киля или эпителия бронхов или биопсии¹³.
   5. Поместите собранные клеточные полоски в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую питающую клетки модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоски эпителиальных клеток обычно легче опускаются с кисти, бросая и поворачивая щетку к стенке трубки.
   6. Закройте крышку трубки микроцентрифуги и прижмите трубку к источнику света. Встряхните трубку, чтобы обнаружить собранные клеточные полоски и конгломераты.
2. Транспортировка образца
   1. Поместите микроцентрифужные трубки в плотно закрытую полистирольную коробку и убедитесь, что крышка трубок правильно закрыта, а трубки закреплены внутри коробки.
   2. Добавьте холодный компресс; однако избегайте замораживания образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура для сохранения образца перед исследованием составляет приблизительно 4-8 °C (39,2-46,4 °F).
   3. Убедитесь, что сохраненные образцы анализируются в течение следующих 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих экспериментах среднее время между чисткой щеткой и HSVMA составляло 3 ч.

2. Высокоскоростной видеомикроскопический анализ (HSVMA)

1. Видеомикроскопия образцов
   1. После получения микроцентрифужных трубок, содержащих образцы, нагревайте их до 37 °C (98,6 °F), чтобы имитировать оптимальную, in vivo-подобную среду.
   2. Если микроскоп оснащен нагревательным блоком, поместите трубки под капот и прогрейте их там. В качестве альтернативы, используйте инкубатор для разогрева образцов.
   3. Запустите камеру и программное обеспечение видеоблока на ПК.
   4. Используя пипетку, возьмите небольшое количество образца и поместите две капли в кювету или стеклянную посуду (см. Таблицу материалов). Накройте кювету или блюдо крышкой и поместите под микроскоп.
   5. Для оценки образцов используют дифференциально-интерференционный микроскоп, оснащенный источником холодного света и видеокамерой, способной вести запись на высокой скорости (не менее 200 кадров/с). Используйте масляную иммерсионную линзу с 100-кратным увеличением и нанесите каплю погружного масла на поверхность оптики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуются микроскопы с линзой, приближающейся снизу.
   6. Подойдите к нижней части тарелки с помощью линзы микроскопа и найдите кластеры клеток без эритроцитов и с низким содержанием слизи. Найдя репрезентативную область интереса (ROI), сосредоточьтесь на одной конкретной группе биющихся ресничек с наибольшими движениями ресничек и запишите видеопоследовательность. Записывайте клетки с биением ресничек сбоку и сверху. После этого найдите другой репрезентативный кластер клеток и повторите запись.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, покрытые ресничками, должны быть исследованы при увеличении 1000x, а избиение ресничек должно быть записано с помощью цифровой высокоскоростной видеокамеры (DHSV), установленной на частоте кадров 200 / с или более (256 / с в этом протоколе). Поскольку данные, полученные из записанных видеоклипов, требуют много места на жестком диске, рекомендуется использовать внешний жесткий диск SSD.
2. Анализ видеопоследовательностей
   1. Чтобы определить CBF и CBP, воспроизводите видеоклипы кадр за кадром.
   2. Чтобы определить CBF, установите частоту кадров в замедленное движение с 15 кадрами / с и подсчитайте 10 последовательных ударов.
   3. Запишите количество кадров, проходящих мимо в течение одного цикла из 10 ударов, и вставьте результат в Eq (1). Определить частоту путем расчета среднего значения всех зарегистрированных циклов биения ресничек и сравнить результат с эталонными значениями по возрасту (см. Таблицу 1)¹⁴.
      (1)
      Где X — количество кадров, проходящих мимо в течение цикла из 10 ударов.
   4. Для оценки CBP следите за тем, находится ли движение бьющихся ресничек в полном диапазоне (см. Рисунок 1) и синхронизировано ли оно. Попросите двух независимых операторов оценить CBP, чтобы предотвратить смещение выбора.
   5. Сообщите, что результаты анализа HSVMA совместимы, маловероятны или неубедительны с PCD.

Видео 1 и Видео 2 показывают нормальный контроль, где CBF и CBP находятся в нормальном диапазоне (см. Рисунок 1). Видео 3, Видео 4, Видео 5 и Видео 6 представляют два случая пациентов с ПХД с гомозиготной мутацией в гене DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)³. Эти репрезентативные видео были выбраны потому, что фенотипы мутаций в гене DNAH11 примечательны тем, что они не могут быть диагностированы TEM из-за отсутствия морфологических изменений ^3,4,5.

Видео 3 показывает классический жесткий, минимально движущийся паттерн цилиарного ритма, совместимый с PCD. Нормальный, полнодиапазонный паттерн, показанный в Видео 1 и Видео 2 , отсутствует (см. Рисунок 1). Видео 4 показывает последовательность одного и того же пациента (Видео 3), но записанную сверху. Видео 5 и Видео 6 показывают гиперкинетический, неэффективный фенотип биения ресничек, также совместимый с PCD у пациентов, несущих мутацию в гене DNAH11 . CBF был настолько высок, что его невозможно было определить. Видео 6 от того же пациента (Видео 5), но записано сверху. CBP является ненормальным и не показывает полного диапазона движения здоровых ресничек (см. Рисунок 1, Видео 1 и Видео 2).

Видео 7 и Видео 8 показывают патологический CBF и CBP сбоку (Видео 7) и сверху (Видео 8) от пациента, который страдал от рецидивирующих инфекций верхних дыхательных путей; однако установить ПХД не удалось. При 10 Гц CBF остается немного ниже нормального диапазона для возраста (см. Таблицу 1), а CBP является ненормальным по сравнению с нормальным CBP контрольного видеоряда (Video 1, Video 2 и Рисунок 1), показывая вращательное цилиарное движение. Случай является неубедительным, и дальнейшие диагностические меры, включая nNO, TEM и генетическое тестирование, должны быть рассмотрены, хотя клиническая картина пациента наводит на мысль о PCD.

Если процедура чистки зубов проводится строго, эпителий носа может быть поврежден, и может возникнуть эпистаксис. Если в образце слишком много клеток крови, анализ HSVMA не может быть выполнен, потому что реснитчатые эпителиальные клетки покрыты покрытием красных кровяных телец, как видно на видео 9.

Рисунок 1: Нормальный цилиарный инсульт. Цилиарный инсульт здорового человека, показывающий весь диапазон нормального передне- и восстановительного инсульта. Эффективный удар (темно-синий) движется слева направо в хлыстовой манере. Восстановительный ход (светло-синий) перемещает реснички назад справа налево в исходное положение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Нормальное движение ресничек пациента без ПХД, видно сбоку. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Нормальное движение ресничек пациента без ПХД, сверху. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 3: Последовательность видео пациента с PCD с мутацией в гене DNAH11 (c.2341G > A p. Glu781Lys)³, показывающая жесткие, почти бессмертные реснички. Сокращения: PCD = первичная цилиарная дискинезия; DNAH11 = динеин руки тяжелой цепи 11 гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 4: Видеоряд от того же пациента PCD (Видео 3), записанный сверху. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 5: Видеопоследовательность сбоку пациента с PCD, показывающая совершенно другую, гиперкинетическую, но неэффективную модель избиения ресничек. Пациент был членом той же семьи и с той же мутацией, что и пациент в Видео 3 и Видео 4. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 6: Видеопоследовательность от того же пациента PCD (Видео 5), записанная сверху. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 7: Видеопоследовательность аномальных, нескоординированных и медленных движений ресничек у пациента с ПХД, страдающего рецидивирующей инфекцией верхних дыхательных путей. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 8: Видеопоследовательность от того же пациента PCD (Видео 7) сверху. Аббревиатура: PCD = Первичная цилиарная дискинезия.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 9: Видеопоследовательность образца, который не удалось проанализировать из-за небрежного расчесывания, приводящего к эпистаксису и наложению эритроцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Таблица 1: Нормальные частоты биения. Нормальная, возрастная, цилиарная частота биения. Эта таблица была изменена по сравнению с Chilvers et ^al.14. * Средняя частота цилиарного биения, SD и^5-й и^95-й процентилей. †Меанный (^5-й,^95-й процентиль) процент краев, демонстрирующих области цилиарной дискинезии. Аббревиатура: SD = стандартное отклонение.

Здесь описан и обсужден процесс диагностики ПХД с использованием HSVMA в свете диагностики первой линии. Несмотря на то, что HSVMA относительно проста в установлении, экономически эффективна¹¹ и является надежным методом в опытных руках¹², HSVMA не является диагностической мерой без подводных камней. Аномальные CBF и CBP могут быть вызваны вторичной инфекцией, приводящей к воспалению бронхо-респираторного эпителия¹⁵, и по той же причине курящие люди могут иметь аномальные частоты биения ^16,17. Кроме того, следует исключить муковисцидоз до установления диагноза ПХД. Прежде чем анализ образца пациента будет признан совместимым с ПХД, аномальные результаты должны быть подтверждены двумя независимо собранными образцами, требующими новых чистк и повторного анализа CBF и CBP. Это может быть сложной задачей, особенно с детьми. Поэтому некоторые исследователи рекомендуют культивировать эпителиальные клетки, полученные из первого сеанса чистки зубов, чтобы избежать повторных расчесываний ^9,15.

Хотя бронхоскопия не является предпочтительным выбором для диагностики ПХД, если она проводится по причинам, отличным от ПХД, образцы могут быть альтернативно получены под анестезией путем чистки эпителия бронхов или взятия биопсии¹³. Вторичная инфекция может изменить цилиарное движение и частоту биения. Чтобы уменьшить эти нежелательные эффекты, рекомендуется вводить двухнедельный курс с пероральным антибиотиком широкого спектра действия, таким как амоксициллин плюс клавулановая кислота или цефалоспорин для нацеливания на общие респираторные патогены. Несмотря на существенные преимущества при лечении ПХД¹⁸, макролиды, вероятно, следует избегать для этой цели, поскольку они могут изменять CBF из-за прокинетического эффекта на избиение ресничек¹⁹. Кроме того, независимо от отсутствия доказательств в литературе, антибиотики должны быть прекращены по крайней мере за 48 ч до чистки зубов и анализа, чтобы избежать какого-либо воздействия на CBF. Существенного влияния антибиотиков на CBF или CBP не наблюдалось в экспериментах, где образцы, полученные путем чистки щеткой или биопсией, культивировались в жидкостях, содержащих антибиотики 20,21,22.

Хотя HSVMA считается наиболее точным и воспроизводимым методом в Европе, он несет риск ошибки оператора из-за смещения выбора и проблем, упомянутых выше¹⁵. Поэтому в последнее время несколько групп разработали программные решения для автоматизации анализа цифровых изображений для преодоления этой проблемы 23,24,25. Поскольку эта автоматизация все еще находится в стадии разработки, авторы используют двух независимых, экспертных операторов для анализа CBF и CBP вручную, достигая отличных и надежных результатов.

Репрезентативные результаты этой статьи показывают видеоклипы пациентов с мутацией в гене DNAH11. Мутации в этом гене показывают нормальную ультраструктуру, и поэтому пациенты с этой мутацией не могут быть диагностированы с помощью TEM. Нормальная ультраструктура ресничек, продемонстрированная ТЕА, может наблюдаться в 30% всех случаев ПХД⁶. Кроме того, nNO может быть нормальным с гиперкинетическим фенотипом этой мутации (Видео 5 и Видео 6), что делает HSVMA, вместе с генетическим тестированием, единственным надежным диагностическим инструментом ^3,8. Кроме того, педиатрические пациенты являются основной мишенью для диагностики ПХД. Во многих случаях симптомы, указывающие на ПХД, могут наблюдаться в неонатальном периоде²⁶, что делает HSVMA быстрой диагностической мерой первой линии, предпочтительной по сравнению с другими альтернативами.

В североамериканском исследовании nNO был изучен и предложен в качестве диагностического скринингового теста первой линии для PCD²⁷. Хотя сообщалось, что специфичность и чувствительность близки к таковым у HSVMA (0,98/0,79), следует отметить, что самому молодому пациенту было 5,1 года, а средний возраст был еще выше. Следует также отметить, что несколько исследователей сообщили о нормальных значениях nNO, связанных с PCD¹⁵. Таким образом, в то время как улучшение технического оснащения для выполнения нНО у субъектов дошкольного возраста все еще продолжается, HSVMA остается единственной надежной диагностикой первой линии для PCD, а нормальные результаты исключают PCD с почти 100% уверенностью во всех возрастных группах.

Однако, чтобы стать экспертом по диагностике ПХД с использованием HSVMA, необходима высокая пропускная способность нормальных и патологических образцов, что требует надлежащей подготовки и специализированного оборудования. Это должно быть обязательным и будет полезным для клиники, занимающейся диагностикой и лечением редких заболеваний легких. По любой причине, если обработка образцов представляет собой препятствие, вместо этого может быть использован центр со специализированным персоналом по диагностике ПХД с использованием HSVMA. В таких случаях лечащий врач может выполнить чистку зубов, а образец может быть отправлен в диагностический центр. В целом, образцы должны быть проанализированы как можно скорее после чистки щеткой. Однако, по нашему опыту, если образцы обработаны должным образом (см. шаг протокола 1.2), эпителиальные клетки остаются жизненно важными и готовыми к анализу в течение не менее 24 ч после чистки^20,22. Большинство центров, которые сами выполняют HSVMA, обычно проводят анализ в течение 4 часов после^{отбора проб 15}. В любом случае и перед окончательным анализом образцы должны быть разогреты до температуры тела, чтобы имитировать оптимальные условия in vivo.

Как описано ранее в этой статье, существуют подводные камни в диагностическом процессе ПХД с использованием HSVMA, особенно в неубедительных случаях, таких как те, которые были описаны в разделе репрезентативных результатов (Видео 7 и Видео 8). Для окончательного диагноза ПХД имеются руководящие принципы, которые показывают, что иногда необходима батарея различных диагностических мер ^9,10,15, и самое ^{главное}, что не существует единого теста или комбинации тестов, которые диагностируют ПХД со 100% уверенностью. Тем не менее, каждое подразделение, участвующее в диагностике и лечении ПХД, следует поощрять к использованию HSVMA в качестве инструмента в диагностике первой линии.

Авторам нечего раскрывать.

Мы хотим выразить особую благодарность детской медсестре г-же Йоханне Юванкоски за ее отличную помощь с чистками зубов. Мы также хотели бы выразить особую благодарность профессору Хеймуту Омрану (Университетская клиника Мюнстера, Великобритания) за предоставление разрешения на использование схематической фигуры нормального цилиарного движения с их веб-сайта. Наконец, мы хотели бы поблагодарить г-на Алана Брауна БА (с отличием), PGCE, за корректуру рукописи.