Analyse par microscopie vidéo à grande vitesse pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire

L’analyse par microscopie vidéo à haute vitesse est un outil relativement facile à réaliser, rapide, rentable et, entre des mains expérimentées, un outil considérablement fiable pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire, qui devrait être disponible dans tous les centres impliqués dans le diagnostic et le traitement des maladies pulmonaires graves.

La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est un trouble congénital principalement hérité d’un trait autosomique récessif. Le trouble provoque une perturbation du mouvement des cils, entraînant une altération grave de la clairance mucociliaire (MCC). Si elle n’est pas diagnostiquée ou diagnostiquée trop tard, la maladie entraîne le développement d’une bronchectasie et de graves dommages aux poumons plus tard dans la vie. La plupart des méthodes de diagnostic de la PCD prennent beaucoup de temps et nécessitent des ressources économiques considérables pour les établir. L’analyse par microscopie vidéo à grande vitesse (HSVMA) est le seul outil de diagnostic permettant de visualiser et d’analyser les cellules respiratoires vivantes avec des cils battants in vitro. Il est rapide, rentable et, entre des mains expérimentées, très fiable en tant qu’outil de diagnostic pour PCD. En outre, les mesures diagnostiques classiques telles que la microscopie électronique à transmission (TEM) ne sont pas applicables à certaines mutations car les changements morphologiques sont absents.

Cet article décrit le processus de collecte des cellules épithéliales respiratoires, la préparation ultérieure de l’échantillon et le processus de HSVMA. Nous décrivons également comment les cellules brossées peuvent être maintenues indemnes et battues avec succès en les gardant dans un milieu nourrissant pour le stockage et le transport vers le site d’investigation dans les cas où une clinique ne possède pas l’équipement nécessaire pour effectuer l’HSVMA. Sont également montrées des vidéos avec des schémas de battement pathologiques de patients présentant une mutation du gène de la chaîne lourde 11 du bras dynéine (DNAH11), qui ne peut pas être diagnostiqué avec TEM; le résultat d’un HSVMA non concluant dû à une infection des voies respiratoires supérieures, ainsi que d’un brossage infructueux avec superposition de globules rouges. Avec cet article, nous aimerions encourager toutes les unités traitant des patients en pneumologie et des maladies pulmonaires rares à effectuer L’HSVMA dans le cadre de leurs diagnostics quotidiens de routine pour la PCD ou à envoyer les échantillons à un centre spécialisé dans la réalisation de HSVMA.

La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une maladie génétique héréditaire rare qui provoque des perturbations dans le mouvement des cils battants. S’il n’est pas diagnostiqué, il entraîne de graves lésions pulmonaires plus tard dans la vie en raison d’une altération grave du MCC. Dans le passé, sa prévalence a été estimée entre 1:4 000 et 50 000. En raison de l’amélioration constante des diagnostics et d’une prise de conscience croissante de la maladie, les mises à jour sur la prévalence de la PCD suggèrent qu’elle pourrait être beaucoup plus courante et probablement comprise entre 1: 4 000 et 20 000 au lieu de ^1,2. Cependant, les patients atteints de PCD sont encore sous-diagnostiqués ou diagnostiqués trop tard ^1,3. Par conséquent, les nourrissons atteints de situs inversus congénital et/ou d’hétérotaxie ou de rhinorrhée périnatale, de détresse respiratoire néonatale, de nez bouché et de difficultés d’alimentation devraient être suspects de PCD. Plus tard dans la vie, l’otite chronique, la pneumonie récurrente, la rhinosinusite et une toux grasse chronique typique due à une altération du MCC sont les symptômes caractéristiques de la PCD, qui, en combinaison avec la bronchectasie et une altération de la fonction pulmonaire, se poursuivent à l’âge adulte².

Les patients soupçonnés d’avoir une PCD peuvent être diagnostiqués à l’aide de différents outils de diagnostic. La GDT a été considérée comme la référence en matière de diagnostic de première ligne dans le passé. Cependant, jusqu’à 30% des cas de PCD ne présentent pas d’ultrastructure anormale ^1,3,4,5,6, ce qui nécessite une approche diagnostique différente. Par conséquent, un nombre croissant de centres et les directives de l’European Respiratory Society (ERS) suggèrent une combinaison d’oxyde nitrique nasal (nNO) et de HSVMA comme diagnostic de première ligne 1,7,9,10. HSVMA et nNO sont également les options les plus rentables pour identifier un patient atteint de PCD¹¹. Cependant, même si les tests génétiques ont été inclus dans les diagnostics, il faut garder à l’esprit qu’il n’existe actuellement aucun test autonome ou combinaison de tests pouvant exclure la PCD avec une certitude de 100% ^8,9,10.

Parmi les options de diagnostic disponibles, HSVMA est le seul test qui se concentre sur les cellules respiratoires vivantes enrobées de cils et évalue le modèle de battement ciliaire (CBP) et la fréquence de battement ciliaire (CBF). Contrairement à la TEM, les résultats de la HSVMA sont disponibles rapidement, généralement le jour du test, alors que les résultats de la TEM peuvent arriver des mois après le prélèvement de l’échantillon. La HSVMA peut être appliquée pour tous les groupes d’âge, tandis que nNO exige un degré élevé de conformité; les tentatives de l’utiliser avant l’âge de 5 ans sont généralement infructueuses¹⁰. Dans les mains expérimentées, HSVMA a une excellente sensibilité et spécificité pour diagnostiquer pcD à 100% et 96%, respectivement¹².

Cet article décrit la procédure étape par étape pour effectuer la HSVMA, y compris la récolte de cellules respiratoires enrobées de cils à partir du cornet inférieur du nez, la préservation des cellules récoltées dans un milieu nourrissant les cellules pour le transport vers le site d’investigation, et le processus d’analyse vidéo microscopique pour déterminer le CBF et le CBP. De plus, certains clips vidéo de patients sont montrés, comparant les CBP et les CBF normaux avec une fonction cileuse anormale (Vidéo 3, Vidéo 4, Vidéo 5, Vidéo 6, Vidéo 7 et Vidéo 8).

Énoncé d’éthique :

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique local (69/2017) et a été menée conformément à la déclaration d’Helsinki.

1. Collecte et transport des cellules épithéliales respiratoires

1. Brossage
   1. Avant le brossage, administrer un traitement de deux semaines d’acide amoxicilline-clavulanique par voie orale au patient pour éradiquer les biofilms interférant avec la fonction des cils. Assurez-vous que l’antibiotique est arrêté 2 jours avant la procédure.
   2. Pour diminuer une superposition de matière muqueuse sur les bandelettes de cellules épithéliales brossées, demandez au patient de bien se moucher. Demandez aux parents d’aider leurs jeunes enfants à se moucher.
   3. Pour le brossage, utilisez une brosse interdentaire de 0,6 mm (voir le tableau des matériaux). Gardez la tête du patient fixée d’une main et, d’autre part, brossez le cornet inférieur des deux narines pour recueillir suffisamment de bandelettes de cellules épithéliales.
      REMARQUE: Une légère résistance est généralement ressentie lors de l’insertion de la brosse interdentaire profondément sous le cornet inférieur. Le brossage nasal est effectué en tournant et en cueillant rapidement pendant environ 2 s. Un brossage plus long et intense pourrait autrement causer des lésions épithéliales graves et une épistaxis consécutive.
   4. Si une bronchoscopie est prévue pour des raisons autres que la suspicion de PCD, prélever des échantillons pendant la bronchoscopie en brossant la carène ou l’épithélium bronchique ou par biopsie¹³.
   5. Déposer les bandes cellulaires récoltées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, qui nourrit les cellules.
      REMARQUE: Les bandes de cellules épithéliales déposent généralement la brosse plus facilement en lançant et en tournant la brosse contre la paroi du tube.
   6. Fermez le couvercle du tube de microcentrifugation et maintenez le tube contre une source de lumière. Secouez le tube pour découvrir les bandes cellulaires et les conglomérats récoltés.
2. Transport de l’échantillon
   1. Placez les tubes de microcentrifugation dans une boîte en polystyrène bien fermée et assurez-vous que le couvercle des tubes est correctement fermé et que les tubes sont fixés à l’intérieur de la boîte.
   2. Ajouter un pack froid; cependant, évitez de congeler le spécimen.
      REMARQUE : La température optimale pour conserver l’échantillon avant l’enquête est d’environ 4 à 8 °C (39,2 à 46,4 °F).
   3. S’assurer que les échantillons conservés sont analysés au cours des prochaines 24 heures.
      NOTE: Dans ces expériences, le temps moyen entre les brossages et HSVMA était de 3 h.

2. Analyse par microscopie vidéo à grande vitesse (HSVMA)

1. Microscopie vidéo des échantillons
   1. Après avoir reçu les tubes de microcentrifugation contenant les échantillons, réchauffez-les jusqu’à 37 °C (98,6 °F) pour imiter un environnement optimal de type in vivo.
   2. Si le microscope est équipé d’une unité de chauffage, placez les tubes sous le capot et réchauffez-les là. Vous pouvez également utiliser un incubateur pour réchauffer les échantillons.
   3. Démarrez la caméra et le logiciel de l’unité vidéo sur le PC.
   4. À l’aide d’une pipette, prélever une petite quantité de l’échantillon et placer deux gouttes dans une cuvette ou un plat à fond de verre (voir le Tableau des matériaux). Couvrez la cuvette ou le plat avec un couvercle et placez-le sous le microscope.
   5. Pour l’évaluation des échantillons, utilisez un microscope à interférence différentielle équipé d’une source de lumière froide et d’une caméra vidéo capable d’enregistrer à grande vitesse (au moins 200 images/s). Utilisez une lentille d’immersion dans l’huile avec un grossissement de 100x et placez une goutte d’huile d’immersion sur la surface de l’optique.
      REMARQUE: Les microscopes avec une lentille s’approchant par le bas sont recommandés.
   6. Approchez-vous du fond de la boîte avec la lentille du microscope et recherchez des amas de cellules sans globules rouges et à faible teneur en mucus. Après avoir trouvé une région d’intérêt représentative (ROI), concentrez-vous sur un groupe spécifique de cils battants avec les plus grands mouvements de cils et enregistrez une séquence vidéo. Enregistrez les cellules avec des cils battants latéralement et d’en haut. Après cela, recherchez un autre groupe représentatif de cellules et répétez l’enregistrement.
      REMARQUE: Les cellules revêtues de cils doivent être étudiées sous un grossissement de 1 000x, et les cils battants doivent être enregistrés avec une caméra vidéo numérique haute vitesse (DHSV) réglée sur une fréquence d’images de 200 / s ou plus (256 / s dans ce protocole). Étant donné que les données obtenues à partir des clips vidéo enregistrés nécessitent beaucoup d’espace sur le disque dur, un disque dur SSD externe est recommandé.
2. Analyse de séquences vidéo
   1. Pour déterminer CBF et CBP, lisez les clips vidéo image par image.
   2. Pour déterminer le CBF, réglez la fréquence d’images au ralenti avec 15 images/s et comptez 10 battements consécutifs.
   3. Enregistrez le nombre d’images qui passent au cours d’un seul cycle de 10 battements et insérez le résultat dans Eq (1). Déterminer la fréquence en calculant la moyenne de tous les cycles de battement des cils enregistrés et comparer le résultat avec les valeurs de référence pour l’âge (voir le tableau 1)¹⁴.
      (1)
      Où X est le nombre d’images passant au cours d’un cycle de 10 battements.
   4. Pour évaluer le CBP, surveillez si le mouvement des cils battants est dans toute la plage (voir Figure 1) et synchronisé. Demandez à deux opérateurs indépendants d’évaluer le CBP pour éviter tout biais de sélection.
   5. Déclarez que les résultats de l’analyse HSVMA sont compatibles, peu probables ou non concluants avec la PCD.

La vidéo 1 et la vidéo 2 montrent un contrôle normal où le CBF et le CBP se situent dans la plage normale (voir la figure 1). La vidéo 3, la vidéo 4, la vidéo 5 et la vidéo 6 représentent deux cas de patients atteints de PCD présentant une mutation homozygote du gène DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)³. Ces vidéos représentatives ont été choisies parce que les phénotypes de mutations du gène DNAH11 sont remarquables car ils ne peuvent pas être diagnostiqués par TEM en raison de l’absence de changements morphologiques ^3,4,5.

La vidéo 3 montre le motif classique rigide et peu mobile du rythme ciliaire compatible avec pcD. Le modèle normal de gamme complète illustré dans les vidéos 1 et 2 est absent (voir la figure 1). La vidéo 4 montre une séquence du même patient (vidéo 3) mais enregistrée d’en haut. La vidéo 5 et la vidéo 6 montrent un phénotype hyperkinétique et inefficace de cils battants également compatible avec la PCD chez les patients porteurs d’une mutation du gène DNAH11 . Le CBF était si élevé qu’il n’a pas pu être déterminé. La vidéo 6 provient du même patient (vidéo 5) mais enregistrée d’en haut. Le CBP est anormal et ne montre pas le mouvement complet des cils sains (voir La figure 1, vidéo 1 et vidéo 2).

La vidéo 7 et la vidéo 8 montrent un CBF pathologique et un CBP latéralement (vidéo 7) et d’en haut (vidéo 8) d’un patient souffrant d’infections récurrentes des voies respiratoires supérieures; toutefois, la CPD n’a pas pu être établie. À 10 Hz, le CBF reste légèrement en dessous de la plage normale pour l’âge (voir tableau 1), et le CBP est anormal par rapport au CBP normal de la séquence vidéo témoin (vidéo 1, vidéo 2 et figure 1), montrant un mouvement ciliaire rotatif. Le cas n’est pas concluant et d’autres mesures diagnostiques, y compris nNO, TEM et tests génétiques, doivent être envisagées, bien que le tableau clinique du patient suggère une PCD.

Si la procédure de brossage est effectuée rigoureusement, l’épithélium du nez pourrait être blessé et une épistaxis pourrait survenir. Si trop de cellules sanguines se trouvent dans l’échantillon, l’analyse HSVMA ne peut pas être effectuée car les cellules épithéliales ciliées sont recouvertes d’un revêtement de globules rouges, comme on peut le voir dans la vidéo 9.

Figure 1 : AVC ciliaire normal. AVC ciliaire d’un individu en bonne santé montrant toute la gamme d’un AVC normal en avant et en convalescence. Le trait efficace (bleu foncé) se déplace de gauche à droite de manière coup de fouet cervical. Le coup de récupération (bleu clair) déplace les cils de droite à gauche dans la position de départ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Mouvement normal des cils d’un patient sans PCD, vu latéralement. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2: Mouvement normal des cils d’un patient sans PCD, vu d’en haut. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Séquence vidéo latérale d’un patient atteint de PCD présentant une mutation du gène DNAH11 (c.2341G > A p. Glu781Lys)³, montrant des cils raides, presque immobiles. Abréviations : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire; DNAH11 = gène de la chaîne lourde 11 du bras de dynéine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Séquence vidéo du même patient atteint de PCD (vidéo 3) enregistrée d’en haut. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 5: Séquence vidéo latérale d’un patient PCD montrant un modèle totalement différent, hyperkinétique mais inefficace de battre les cils. Le patient était membre de la même famille et présentait la même mutation que le patient de la vidéo 3 et de la vidéo 4. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 6 : Séquence vidéo du même patient atteint de PCD (vidéo 5), enregistrée d’en haut. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 7 : Séquence vidéo de mouvements anormaux, non coordonnés et lents des cils chez un patient atteint de PCD souffrant d’une infection récurrente des voies respiratoires supérieures. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 8 : Séquence vidéo du même patient PCD (Vidéo 7) vue d’en haut. Abréviation : PCD = Dyskinésie ciliaire primaire.  Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 9: Séquence vidéo d’un échantillon, qui n’a pas pu être analysé en raison d’un brossage négligent, entraînant une épistaxis et une superposition de globules rouges. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Tableau 1 : Fréquences de battement normales. Fréquence normale, liée à l’âge, de battement ciliaire. Ce tableau a été modifié à partir de Chilvers et ^al.14. *Fréquence moyenne des battements ciliaires, SD, et^5e et^95e centiles. †Mean (^5e,^95e centiles) pourcentage d’arêtes présentant des zones de dyskinésie ciliaire. Abréviation : SD = écart-type.

Ici, le processus de diagnostic de la PCD à l’aide de HSVMA est décrit et discuté à la lumière des diagnostics de première ligne. Bien qu’il soit relativement facile à établir, rentable¹¹ et qu’il s’agisse d’une méthode fiable entre des mains expérimentées¹², le HSVMA n’est pas une mesure diagnostique sans pièges. Un CBF et un CBP anormaux peuvent être dus à une infection secondaire, entraînant une inflammation de l’épithélium broncho-respiratoire¹⁵, et pour la même raison, les fumeurs peuvent avoir des fréquences de battement anormales ^16,17. En outre, la fibrose kystique doit être exclue avant d’établir le diagnostic de PCD. Avant que l’analyse d’un échantillon de patient ne soit jugée compatible avec la PCD, des résultats anormaux doivent être confirmés par deux échantillons prélevés indépendamment, nécessitant de nouveaux brossages et une réanalyse du CBF et du CBP. Cela peut être difficile, surtout avec les enfants. Par conséquent, certains chercheurs recommandent de cultiver des cellules épithéliales obtenues dès la première séance de brossage pour éviter les brossages répétés ^9,15.

Bien que la bronchoscopie ne soit pas le choix préféré pour diagnostiquer la PCD, si elle est réalisée pour des raisons autres que la PCD, des échantillons peuvent également être obtenus sous anesthésie en brossant l’épithélium bronchique ou en effectuant une biopsie¹³. L’infection secondaire peut altérer les mouvements ciliaires et la fréquence des battements. Pour diminuer ces effets indésirables, il est recommandé d’administrer un traitement de deux semaines avec un antibiotique oral à large spectre tel que l’amoxicilline plus l’acide clavulanique ou une céphalosporine pour cibler les agents pathogènes respiratoires courants. Bien qu’ils aient des avantages substantiels dans le traitement de la PCD¹⁸, les macrolides devraient probablement être évités à cette fin, car ils pourraient modifier le CBF en raison d’un effet procinétique sur le battement des cils¹⁹. De plus, indépendamment du manque de preuves dans la littérature, les antibiotiques doivent être arrêtés au moins 48 heures avant le brossage et l’analyse pour éviter tout impact sur le CBF. Aucun impact substantiel des antibiotiques n’a pu être observé sur le CBF ou le CBP dans des expériences où des échantillons obtenus par brossage ou biopsie ont été cultivés dans des liquides contenant des antibiotiques 20,21,22.

Bien que la HSVMA soit considérée comme la technique la plus précise et la plus reproductible en Europe, elle comporte le risque d’erreur de l’opérateur en raison du biais de sélection et des problèmes mentionnés ci-dessus¹⁵. Par conséquent, plusieurs groupes ont récemment développé des solutions logicielles pour automatiser l’analyse à partir d’images numériques afin de surmonter ce problème 23,24,25. Étant donné que cette automatisation est encore en cours de développement, les auteurs font appel à deux opérateurs indépendants et experts pour analyser manuellement le CBF et le CBP, obtenant ainsi des résultats excellents et fiables.

Les résultats représentatifs de cet article montrent des clips vidéo de patients présentant une mutation du gène DNAH11. Les mutations de ce gène montrent une ultrastructure normale, et les patients porteurs de cette mutation ne peuvent donc pas être diagnostiqués par TEM. L’ultrastructure normale des cils démontrée par la TEM peut être observée dans jusqu’à 30% de tous les cas de PCD⁶. De plus, le nNO pourrait être normal avec le phénotype hyperkinétique de cette mutation (vidéo 5 et vidéo 6), faisant de l’HSVMA, avec les tests génétiques, le seul outil de diagnostic fiable ^3,8. En outre, les patients pédiatriques constituent la cible principale pour le diagnostic de la PCD. Dans de nombreux cas, des symptômes évocateurs de PCD peuvent être observés au cours de la période néonatale²⁶, ce qui fait de l’HSVMA une mesure diagnostique rapide et de première intention préférable à d’autres alternatives.

Dans une étude nord-américaine, le nNO a été examiné et proposé comme test de dépistage diagnostique de première ligne pour la PCD²⁷. Bien que la spécificité et la sensibilité aient été rapportées comme étant proches de celles de l’AMSH (0,98/0,79), il convient de noter que le patient le plus jeune avait 5,1 ans et que l’âge moyen était encore beaucoup plus élevé. Il convient également de mentionner que plusieurs chercheurs ont signalé des valeurs normales de nNO associées à la PCD¹⁵. Par conséquent, bien qu’une amélioration de l’équipement technique pour effectuer la nNO chez les sujets d’âge préscolaire soit toujours en cours, la HSVMA reste le seul diagnostic de première intention fiable pour la PCD, et les résultats normaux excluent la PCD avec une certitude de près de 100% dans tous les groupes d’âge.

Cependant, pour devenir un expert dans le diagnostic de la PCD à l’aide de HSVMA, un débit élevé d’échantillons normaux et pathologiques est nécessaire, ce qui nécessite une formation appropriée et un équipement spécialisé. Cela devrait être obligatoire et sera gratifiant pour une clinique traitant du diagnostic et du traitement des maladies pulmonaires rares. Pour une raison quelconque, si le traitement des échantillons constitue un obstacle, un centre avec du personnel spécialisé dans le diagnostic PCD utilisant HSVMA peut être utilisé à la place. Dans de tels cas, le médecin traitant peut effectuer le brossage et l’échantillon peut être envoyé au centre de diagnostic. En général, les échantillons doivent être analysés dès que possible après le brossage. Cependant, d’après notre expérience, si les échantillons sont traités correctement (voir l’étape 1.2 du protocole), les cellules épithéliales restent vitales et prêtes à être analysées pendant au moins 24 heures après le brossage^20,22. La plupart des centres qui effectuent eux-mêmes la HSVMA effectuent généralement l’analyse dans les 4 heures suivant l’échantillonnage¹⁵. Dans tous les cas, et avant l’analyse finale, les échantillons doivent être réchauffés à la température corporelle pour imiter des conditions optimales et in vivo.

Comme décrit précédemment dans cet article, il existe des pièges dans le processus de diagnostic de la PCD à l’aide de HSVMA, en particulier avec des cas non concluants tels que ceux qui ont été décrits dans la section des résultats représentatifs (vidéo 7 et vidéo 8). Pour le diagnostic final de la PCD, des lignes directrices sont disponibles qui montrent que parfois une batterie de différentes mesures de diagnostic est nécessaire ^9,10,15, et surtout, qu’il n’y a pas un seul test ou combinaison de tests qui diagnostiquent la PCD avec 100% de certitude. Néanmoins, chaque unité impliquée dans le diagnostic et le traitement de la PCD devrait être encouragée à utiliser HSVMA comme outil de diagnostic de première ligne.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous tenons à remercier tout particulièrement l’infirmière pédiatrique Mme Johanna Juvankoski pour son excellente aide avec les brossages. Nous tenons également à exprimer une gratitude particulière au professeur Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) pour avoir accordé la permission d’utiliser la figure schématique du mouvement ciliaire normal de leur site Web. Enfin, nous tenons à remercier M. Alan Brown BA (Hons), PGCE, pour la relecture du manuscrit.