Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade para diagnóstico de primeira linha da dyskinesia ciliar primária

A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade é uma análise relativamente fácil de executar, rápida, econômica e, em mãos experientes, uma ferramenta consideravelmente confiável para diagnósticos de primeira linha de dyskinesia ciliar primária, que deve estar disponível em todos os centros envolvidos em diagnósticos e no tratamento de doenças pulmonares graves.

A discnesia ciliar primária (PCD) é uma doença congênita predominantemente herdada em um traço recessivo autossômico. O transtorno causa perturbação no movimento do cílio, levando a grave comprometimento do desmatamento mucociliar (CCM). Se não diagnosticada ou diagnosticada tarde demais, a condição leva ao desenvolvimento de bronquiectase e danos graves aos pulmões na vida posterior. A maioria dos métodos de diagnóstico de PCD são demorados e exigem amplos recursos econômicos para estabelecê-los. A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVMA) é a única ferramenta de diagnóstico para visualizar e analisar células respiratórias vivas com cílios in vitro. É rápido, econômico e, em mãos experientes, muito confiável como ferramenta de diagnóstico para PCD. Além disso, medidas diagnósticas clássicas como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) não são aplicáveis para algumas mutações, pois as alterações morfológicas estão ausentes.

Este artigo descreve o processo de coleta de células epiteliais respiratórias, a preparação posterior da amostra e o processo de HSVMA. Também descrevemos como as células escovadas podem ser mantidas ilesas e batendo, mantendo-as em um meio nutritivo para armazenamento e transporte para o local de investigação nos casos em que uma clínica não possui o equipamento para realizar o HSVMA. Também são mostrados vídeos com padrões patológicos de espancamento de pacientes com uma mutação no braço dynein cadeia pesada 11 gene (DNAH11), que não pode ser diagnosticado com TEM; o resultado de um HSVMA inconclusivo devido à infecção das vias aéreas superiores, bem como uma escovação mal sucedida com superposição de glóbulos vermelhos. Com este artigo, gostaríamos de incentivar todas as unidades que lidam com pacientes de pneumologia e doenças pulmonares raras a realizar o HSVMA como parte de seus diagnósticos diários de rotina para PCD ou enviar os espécimes para um centro especializado na realização do HSVMA.

A discnesia ciliar primária (PCD) é uma doença genética rara e hereditária, que causa distúrbios no movimento de bater cílios. Se não diagnosticado, leva a danos pulmonares graves na vida posterior devido ao grave comprometimento do CCM. No passado, sua prevalência foi estimada na faixa de 1:4.000 a 50.000. Devido à melhoria constante dos diagnósticos e à crescente conscientização sobre a condição, atualizações sobre a prevalência de PCD sugerem que pode ser muito mais comum e provavelmente na faixa de 1:4.000 a 20.000 em vez^{de 1,2}. No entanto, os pacientes com PCD ainda são subdiagnosticados ou diagnosticados tarde demais ^1,3. Portanto, bebês com situs inversus congênito e/ou heterotaxia ou rinorreia perinatal, problemas respiratórios neonatais, nariz entupido e dificuldades de alimentação devem ser suspeitos para PCD. Na vida posterior, otite crônica, pneumonia recorrente, rinosinusite e uma tosse úmida crônica e típica devido ao MCC prejudicado são os sintomas marcantes do PCD, que em combinação com bronquiectase e função pulmonar prejudicada, continuam até a idade adulta².

Pacientes com suspeita de PCD podem ser diagnosticados usando diferentes ferramentas de diagnóstico. O TEM foi considerado o padrão-ouro para diagnósticos de primeira linha no passado. No entanto, até 30% dos casos de PCD não apresentam ultraestrutura anormal 1,3,4,5,6, exigindo uma abordagem diagnóstica diferente. Portanto, um número crescente de centros e as diretrizes da Sociedade Respiratória Europeia (ERS) sugerem uma combinação de óxido nítrico nasal (nNO) e HSVMA como diagnósticos de primeira linha 1,7,9,10. HSVMA e nNO também são as opções mais econômicas na identificação de um paciente com PCD¹¹. No entanto, mesmo que os testes genéticos tenham sido incluídos nos diagnósticos, deve-se ter em mente que atualmente não há nenhum teste autônomo ou combinação de testes que possam excluir pcd com 100% de certeza ^8,9,10.

Das opções de diagnóstico disponíveis, o HSVMA é o único teste que se concentra em células respiratórias vivas, revestidas de cílios e avalia o padrão de batida ciliar (CBP) e a frequência de batida ciliar (CBF). Em contraste com o TEM, os resultados do HSVMA estão disponíveis rapidamente, geralmente no dia do teste, enquanto os resultados do TEM podem chegar meses após a coleta da amostra. O HSVMA pode ser aplicado para todas as faixas etárias, enquanto o NNO exige um alto grau de conformidade; tentativas de usá-lo com menos de 5 anos geralmente são mal sucedidas¹⁰. Em mãos experientes, o HSVMA tem excelente sensibilidade e especificidade para diagnosticar PCD em 100% e 96%, respectivamente¹².

Este artigo descreve o procedimento passo-a-passo para a realização do HSVMA, incluindo a colheita de células respiratórias revestidas de cílios a partir do turbinado inferior do nariz, a preservação de células colhidas em um meio nutritivo celular para transporte para o local de investigação, e o processo de análise de vídeo microscópico para determinar CBF e CBP. Além disso, alguns videoclipes de pacientes são mostrados, comparando CBPs normais e CBFs com função cília anormal (Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5, Vídeo 6, Vídeo 7 e Vídeo 8).

Declaração ética:

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética local (69/2017) e realizado em cumprimento à declaração de Helsinque.

1. Coleta e transporte de células epiteliais respiratórias

1. Escovar
   1. Antes de escovar, administre um curso de duas semanas de ácido amoxicilina-clavulanic oral ao paciente para erradicar biofilmes interferindo na função cílio. Certifique-se de que o antibiótico é terminado 2 dias antes do procedimento.
   2. Para diminuir uma sobreposição de material mucoso nas tiras de célula epitelial escovadas, peça ao paciente para assoar completamente o nariz. Peça aos pais para ajudar seus filhos pequenos a estourarem o nariz.
   3. Para escovar, utilize uma escova interdental de 0,6 mm de tamanho (veja a Tabela de Materiais). Mantenha a cabeça do paciente fixada com uma mão, e com a outra mão, escove o turbinado inferior de ambas as narinas para coletar tiras celulares epiteliais suficientes.
      NOTA: Uma leve resistência é geralmente experimentada ao inserir a escova interdental profundamente sob o turbinado inferior. A escovação nasal é realizada girando e colhendo rapidamente por aproximadamente 2 s. Escovação mais longa e intensa pode causar lesões epiteliais graves e epistaxis consecutivas.
   4. Se a broncoscopia for planejada por outras razões que não a suspeita de PCD, colete amostras durante a broncoscopia escovando a carina ou o epitélio brônquico ou por biópsia¹³.
   5. Solte as tiras de células colhidas em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL contendo o Meio águia modificada (DMEM) de Dulbecco, nutritivo por células.
      NOTA: As tiras de células epiteliais geralmente deixam o pincel mais facilmente lançando e girando a escova contra a parede do tubo.
   6. Feche a tampa do tubo de microcentrifuuagem e segure o tubo contra uma fonte de luz. Agite o tubo para descobrir tiras de células colhidas e conglomerados.
2. Transporte do espécime
   1. Coloque os tubos de microcentrifuuge em uma caixa de poliestireno bem fechada e certifique-se de que a tampa dos tubos está devidamente fechada e os tubos estão fixados dentro da caixa.
   2. Adicione um pacote frio; no entanto, evite congelar o espécime.
      NOTA: A temperatura ideal para a preservação da amostra antes da investigação é de aproximadamente 4-8 °C (39.2-46.4 °F).
   3. Certifique-se de que as amostras preservadas sejam analisadas durante as próximas 24 horas.
      NOTA: Nesses experimentos, o tempo médio entre escovações e HSVMA foi de 3h.

2. Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVMA)

1. Microscopia de vídeo das amostras
   1. Depois de receber os tubos de microcentrifuuge contendo as amostras, aqueça-os até 37 °C (98,6 °F) para imitar um ambiente ótimo, in vivo.
   2. Se o microscópio estiver equipado com uma unidade de aquecimento, coloque os tubos sob o capô e aqueça-os lá em cima. Alternativamente, use uma incubadora para aquecer as amostras.
   3. Inicie a câmera e o software da unidade de vídeo no PC.
   4. Usando uma pipeta, pegue uma pequena quantidade da amostra e coloque duas gotas em um prato cuvette ou fundo de vidro (veja a Tabela de Materiais). Cubra o cuvette ou prato com uma tampa e coloque-o sob o microscópio.
   5. Para avaliação das amostras, use um microscópio de interferência diferencial equipado com uma fonte de luz fria e uma câmera de vídeo capaz de gravar em alta velocidade (pelo menos 200 quadros/s). Use uma lente de imersão em óleo com uma ampliação de 100x e coloque uma gota de óleo de imersão na superfície da óptica.
      NOTA: Microscópios com uma lente se aproximando de baixo são recomendados.
   6. Aproxime-se da parte inferior do prato com a lente do microscópio e procure por aglomerados celulares sem glóbulos vermelhos e com baixo teor de muco. Depois de encontrar uma região representativa de interesse (ROI), concentre-se em um grupo específico de bater clia com os maiores movimentos de cílios e gravar uma sequência de vídeo. Registo celular com batida cilia lateral e de cima. Depois disso, procure outro grupo representativo de células e repita a gravação.
      NOTA: As células revestidas de cílio devem ser investigadas sob uma ampliação de 1.000x, e a batida de Cílios deve ser gravada com uma câmera de vídeo digital de alta velocidade (DHSV) fixada em uma taxa de quadros de 200/s ou mais (256/s neste protocolo). Como os dados obtidos nos clipes de vídeo gravados exigem muito espaço no disco rígido, recomenda-se um disco rígido SSD externo.
2. Análise de sequências de vídeo
   1. Para determinar CBF e CBP, reprodumente os clipes de vídeo quadro a quadro.
   2. Para determinar a CBF, defina a taxa de quadros em câmera lenta com 15 quadros/s e conte 10 batidas consecutivas.
   3. Registo o número de quadros que passam durante um único ciclo de 10 batidas e insira o resultado em Eq (1). Determine a frequência calculando a média de todos os ciclos de batida cilia registrados e compare o resultado com os valores de referência para a idade (ver Tabela 1)¹⁴.
      (1)
      Onde X é o número de quadros que passam durante um ciclo de 10 batidas.
   4. Para avaliar o CBP, observe se o movimento da cília de batida está em pleno alcance (ver Figura 1) e sincronizado. Ter dois operadores independentes avaliando o CBP para evitar viés de seleção.
   5. Informe os resultados da análise HSVMA para serem compatíveis, improváveis ou inconclusivos com PCD.

O vídeo 1 e o vídeo 2 mostram um controle normal onde a CBF e o CBP estão na faixa normal (ver Figura 1). Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5 e Vídeo 6 representam dois casos de pacientes com PCD com uma mutação homozigous no gene DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)³. Esses vídeos representativos foram escolhidos porque os fenótipos de mutações no gene DNAH11 são notáveis porque não podem ser diagnosticados pelo TEM devido à ausência de alterações morfológicas ^3,4,5.

O vídeo 3 mostra o padrão clássico rígido e minimamente móvel de batida ciliar compatível com PCD. O padrão normal de alcance completo mostrado no Vídeo 1 e no Vídeo 2 está ausente (ver Figura 1). O vídeo 4 mostra uma sequência do mesmo paciente (Vídeo 3), mas gravado de cima. O vídeo 5 e o vídeo 6 mostram um fenótipo hipercinético e ineficaz de bater cílios também compatíveis com PCD em pacientes portadores de uma mutação no gene DNAH11 . A CBF era tão alta que não podia ser determinada. O vídeo 6 é do mesmo paciente (Vídeo 5), mas gravado de cima. O CBP é anormal e não mostra o movimento de gama completa de cílios saudáveis (ver Figura 1, Vídeo 1 e Vídeo 2).

O vídeo 7 e o vídeo 8 mostram um sentido patológico da CBF e do CBP (Vídeo 7) e de cima (Vídeo 8) de um paciente que vem sofrendo de infecções recorrentes nas vias aéreas superiores; no entanto, o PCD não pôde ser estabelecido. A 10 Hz, a CBF permanece ligeiramente abaixo da faixa normal para a idade (ver Tabela 1), e o CBP é anormal em comparação com o CBP normal da sequência de vídeo de controle (Vídeo 1, Vídeo 2 e Figura 1), mostrando um movimento ciliário rotativo. O caso é inconclusivo, e novas medidas diagnósticas, incluindo nNO, TEM e testes genéticos, devem ser consideradas, embora o quadro clínico do paciente seja sugestivo de PCD.

Se o procedimento de escovação for realizado rigorosamente, o epitélio do nariz pode ser ferido, podendo ocorrer epistáxi. Se muitos glóbulos do sangue estiverem na amostra, a análise de HSVMA não pode ser realizada porque as células epiteliais ciliadas estão cobertas com um revestimento de glóbulos vermelhos, como pode ser visto no Vídeo 9.

Figura 1: Derrame ciliar normal. Golpe ciliar de um indivíduo saudável mostrando toda a gama de um curso normal de avanço e recuperação. O golpe eficaz (azul escuro) se move da esquerda para a direita de uma maneira de chicotear. O curso de recuperação (azul claro) move o cílio de volta da direita para a esquerda para a posição inicial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Movimento cilia normal de um paciente sem PCD, visto lateralmente. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Movimento cilia normal de um paciente sem PCD, de cima. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Sequência de vídeo lateralmente de um paciente PCD com uma mutação no gene DNAH11 (c.2341G > A p. Glu781Lys)³, mostrando cália rígida, quase immotile. Abreviaturas: PCD = Discóskinesia Ciliar Primária; DNAH11 = braço dynein cadeia pesada 11 gene. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Sequência de vídeo do mesmo paciente PCD (Vídeo 3) gravado de cima. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 5: Sequência de vídeo lateralmente de um paciente PCD mostrando um padrão totalmente diferente, hipercinético, mas ineficiente de bater cílios. O paciente era membro da mesma família e com a mesma mutação do paciente no Vídeo 3 e Vídeo 4. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 6: Sequência de vídeo do mesmo paciente PCD (Vídeo 5), gravada de cima. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 7: Sequência de vídeo de câmera cilia anormal, descoordenada e lenta em um paciente PCD que sofre de infecção recorrente nas vias aéreas superiores. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 8: Sequência de vídeo do mesmo paciente PCD (Vídeo 7) de cima. Abreviação: PCD = Discínesia Ciliar Primária.  Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 9: Sequência de vídeo de um espécime, que não pôde ser analisado devido à escovação descuidada, levando à epistaxis e à superposição de glóbulos vermelhos. Clique aqui para baixar este vídeo.

Tabela 1: Frequências normais de batida. Normal, relacionado à idade, frequência de batida ciliar. Esta tabela foi modificada de Chilvers et ^al.14. *Frequência média de batida ciliar, SD, e percentis^{5 e} 95^. †Mean (^5º, 95^º percentis) percentual de bordas que apresentam áreas de dyskinesia ciliar. Abreviação: SD = desvio padrão.

Aqui, o processo de diagnóstico para PCD usando HSVMA é descrito e discutido à luz dos diagnósticos de primeira linha. Apesar de ser relativamente fácil de estabelecer,¹¹ econômico e um método confiável em mãos experientes¹², o HSVMA não é uma medida de diagnóstico sem armadilhas. A CBF e o CBP anormal podem ser devido a infecções secundárias, levando à inflamação da epithelia bronco-respiratória¹⁵, e pelo mesmo motivo, os indivíduos fumantes podem ter frequências de batidas anormais ^16,17. Além disso, a fibrose cística deve ser excluída antes de estabelecer o diagnóstico de PCD. Antes da análise de uma amostra de paciente ser considerada compatível com PCD, os resultados anormais devem ser confirmados com duas amostras coletadas independentemente, exigindo novas escovas e uma reanálise da CBF e do CBP. Isso pode ser desafiador, especialmente com crianças. Portanto, alguns pesquisadores recomendam a cultivo de células epiteliais obtidas na primeira sessão de escovação para evitar a repetição das escovações ^9,15.

Embora a broncoscopia não seja a escolha preferida para diagnosticar PCD, se for realizada por outras razões que não a PCD, as amostras podem ser obtidas alternativamente sob anestesia escovando o epitélio brônquico ou fazendo uma biópsia¹³. A infecção secundária pode alterar o movimento ciliar e a frequência de batidas. Para diminuir esses efeitos indesejados, recomenda-se administrar um curso de duas semanas com um antibiótico oral de amplo espectro, como amoxicilina mais ácido clavulanico ou cefalosporina para atingir patógenos respiratórios comuns. Apesar de ter benefícios substanciais no tratamento do PCD¹⁸, as macrolides provavelmente devem ser evitadas para este fim, pois podem alterar a CBF devido a um efeito procinético na batida do Cilia¹⁹. Além disso, independentemente da falta de evidências na literatura, os antibióticos devem ser interrompidos pelo menos 48h antes da escovação e análise para evitar qualquer impacto na CBF. Nenhum impacto substancial de antibióticos pôde ser observado na CBF ou CBP em experimentos onde amostras obtidas por escovação ou biópsia foram cultivadas em líquidos contendo antibióticos 20,21,22.

Embora o HSVMA seja considerado a técnica mais precisa e reprodutível da Europa, ela traz o risco de erro do operador devido ao viés de seleção e aos problemas mencionados acima^{de 15}. Por isso, vários grupos desenvolveram recentemente soluções de software para automatizar a análise a partir de imagens digitais para superar esse problema 23,24,25. Como essa automação ainda está em desenvolvimento, os autores utilizam dois operadores independentes e especializados para analisar a CBF e o CBP manualmente, alcançando excelentes e confiáveis resultados.

Os resultados representativos deste artigo mostram vídeos de pacientes com uma mutação no gene DNAH11. Mutações neste gene mostram uma ultraestrutura normal, e pacientes com essa mutação não podem, portanto, ser diagnosticados pelo TEM. A ultraestrutura normal de cílios demonstrada pelo TEM pode ser vista em até 30% de todos os casos de PCD⁶. Além disso, o nNO pode ser normal com o fenótipo hipercinético desta mutação (Vídeo 5 e Vídeo 6), tornando o HSVMA, juntamente com testes genéticos, a única ferramenta de diagnóstico confiável ^3,8. Além disso, os pacientes pediátricos constituem o alvo principal para diagnósticos de PCD. Em muitos casos, os sintomas sugestivos de PCD podem ser observados no período neonatal²⁶, tornando o HSVMA uma medida diagnóstica rápida e de primeira linha preferível a outras alternativas.

Em um estudo norte-americano, a NNO foi examinada e proposta como um teste de triagem de diagnóstico de primeira linha para PCD²⁷. Embora tenha sido relatado que a especificidade e a sensibilidade eram próximas às do HSVMA (0,98/0,79), deve-se notar que o paciente mais jovem tinha 5,1 anos e a média de idade era ainda muito maior. Deve-se mencionar também que vários investigadores relataram valores normais nNO associados ao PCD¹⁵. Portanto, enquanto uma melhoria nos equipamentos técnicos para a realização do NNO em assuntos da idade pré-escolar ainda está em andamento, o HSVMA continua sendo o único diagnóstico confiável de primeira linha para PCD, e os resultados normais excluem o PCD com quase 100% de certeza em todas as faixas etárias.

No entanto, para se tornar um especialista em diagnóstico de PCD usando HSVMA, é necessário um alto rendimento de amostras normais e patológicas, o que exige treinamento adequado e equipamentos especializados. Isso deve ser obrigatório e será recompensador para uma clínica que lida com diagnósticos e tratamento de doenças pulmonares raras. Por qualquer motivo, se o processamento das amostras constitui um obstáculo, um centro com pessoal especializado em diagnósticos PCD usando HSVMA pode ser usado em vez disso. Nesses casos, o médico responsável pelo tratamento pode realizar a escovação, e a amostra pode ser enviada para o centro de diagnóstico. Em geral, as amostras devem ser analisadas o mais rápido possível após a escovação. No entanto, em nossa experiência, se as amostras forem processadas adequadamente (ver protocolo passo 1.2), as células epiteliais permanecem vitais e prontas para análise por pelo menos 24 horas após escovar^20,22. A maioria dos centros que realizam o próprio HSVMA geralmente realiza a análise dentro de 4h da amostragem¹⁵. Em qualquer caso, e antes da análise final, as amostras devem ser aquecidas até a temperatura corporal para imitar condições ideais e in vivo.

Como descrito anteriormente neste artigo, há armadilhas no processo de diagnóstico do PCD usando HSVMA, especialmente com casos inconclusivos como os descritos na seção de resultados representativos (Vídeo 7 e Vídeo 8). Para o diagnóstico final do PCD, estão disponíveis orientações que mostram que às vezes uma bateria de diferentes medidas diagnósticas é necessária ^9,10,15, e o mais importante, que não há um único teste ou combinação de exames que diagnosticem PCD com 100% de certeza. No entanto, todas as unidades envolvidas no diagnóstico e tratamento da PCD devem ser incentivadas a utilizar o HSVMA como ferramenta no diagnóstico de primeira linha.

Os autores não têm nada a revelar.

Queremos expressar agradecimentos especiais à enfermeira pediátrica Sra. Johanna Juvankoski por sua excelente ajuda com as escovas. Gostaríamos também de expressar uma gratidão especial ao professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) por conceder permissão para usar a figura esquemática do movimento ciliar normal de seu site. Finalmente, gostaríamos de agradecer ao Sr. Alan Brown BA (Hons), PGCE, pela revisão do manuscrito.