Method Article
Этот протокол представляет собой одночастично-интерферометрическую визуализацию отражательной способности, которая предназначена для многоуровневых и всесторонних измерений размера внеклеточных везикул (ВВ), количества ВВ, фенотипа ВВ и колокализации биомаркеров ВВ.
Внеклеточные везикулы (ВВ) — это везикулы нанометрового размера с липидным бислоем, которые секретируются большинством клеток. ВВ несут множество различных биологических молекул, включая белки, липиды, ДНК и РНК, и постулируются для облегчения межклеточной коммуникации в различных тканях и органах. В последнее время ВВ привлекают значительное внимание в качестве биомаркеров для диагностики и терапевтических средств при различных заболеваниях. Для определения характеристик электромобилей было разработано множество методов. Тем не менее, все современные методы анализа электромобилей имеют различные ограничения. Таким образом, разработка эффективных и действенных методов выделения и определения характеристик электромобилей остается одним из важнейших шагов для этой передовой области исследований по мере ее развития. В этой статье мы предоставляем подробный протокол, описывающий одночастичный интерферометрический датчик отражения (SP-IRIS) в качестве метода, способного обнаруживать и характеризовать ВВ из неочищенных биологических источников и очищенных ВВ с помощью других методологий. Этот передовой метод может быть использован для многоуровневых и всесторонних измерений для анализа размера ВВ, количества ВВ, фенотипа ВВ и колокализации биомаркеров.
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные везикулы клеточного происхождения нанометрового размера, которые могут быть выделены из многочисленных биологических жидкостей, включая кровь, грудное молоко, слюну, мочу, желчь, сок поджелудочной железы, а также спинномозговую и перитонеальную жидкости. Образование ВВ происходит с помощью трех основных механизмов: апоптоза, высвобождения путем слияния многовезикулярных телец с плазматической мембраной и блеббинга плазматической мембраны. Данные о переносе компонентов донорских клеток в соседние или отдаленные клетки и ткани позволяют предположить, что эти мембранные пакеты могут играть важную роль в паракринных, а также дальних или эндокринных сигнальных каскадах 1,2,3. Поскольку ВВ могут обеспечить моментальный снимок фенотипа клетки, потенциал их использования в качестве диагностических и терапевтических инструментов для лечения различных заболеваний стал активной областью исследований 4,5,6,7,8.
Было разработано множество методов, направленных на определение характеристик EV 9,10,11,12,13. Большинство из этих методов предоставляют уникальную и ценную информацию о популяциях электромобилей, в первую очередь в массовом количестве. В то время как подмножество этих методов может предоставить подробную информацию о веществах внутри или на отдельных электромобилях, могут быть ограничения для характеристики электромобилей на уровне одного электромобиля. Например, иммуноэлектронная микроскопия может быть использована для понимания одиночных ВВ и их состава, но этот метод обладает низкой пропускной способностью, сильно ограничен в своих возможностях для описания популяционной динамики и требуетзначительного развития методов.
В последнее время в результате разработки и коммерциализации метода одночастичного интерферометрического датчика отражения (SP-IRIS) на платформе ExoView появилась возможность определения индивидуальных характеристик электромобилей с помощью рутинного и простого автоматизированного метода сбора данных. Ядром этой технологии является чип, представляющий собой двойной слой Si/SiO2 размером 1 см x 1 см, который позволяет проводить интерферометрические измерения отдельных биологических наночастиц. Чип оснащен микрочипом отдельных функционализированных пятен антител, что позволяет мультиплексировать до шести различных типов захвата. Стандартные чипы включают в себя общие маркеры тетраспанина (CD81, CD63 и CD9) для захвата на этапе инкубации, и пользователь может добавить дополнительные пользовательские точки захвата для выделения отдельных популяций EV отдельно от тетраспанинов. После этапа инкубации каждая точка захвата привязывает к себе множество EV, которые экспрессируют соответствующий маркер. Эти захваченные электромобили затем можно просто промыть, высушить и отсканировать в считывателе для количественной оценки размера везикул, связанных с точкой захвата в диапазоне от 50 до 200 нм, чтобы получить взвешенное распределение по размерам с помощью SP-IRIS15. Система также предлагает три канала флуоресцентного детектирования для иммуномаркировки захваченных ВВ и обеспечивает как среднюю интенсивность флуоресценции, которая не ограничена размером, таким как измерения SP-IRIS, так и аспекты колокализации для каждого флуоресцентного окрашивания. Это позволяет пользователю определять популяции отдельных ВВ на основе отображения четырех различных биомаркеров для каждого ВВ (захват плюс три иммунофлуоресцентные метки). Система может выйти за рамки измерения поверхностных белков с помощью иммунофлуоресценции, поскольку дополнительный грузовой протокол позволяет пользователю зондировать внутренние белки захваченных EV и люминальные эпитопы маркеров поверхности, охватывающей мембрану, а также позволяет пользователю проверить целостность мембраны EV. В этой статье мы предоставляем подробный протокол, в котором изложены шаги, необходимые для получения согласованных данных о размере и количестве ВВ, с учетом до четырех различных биомаркеров на одном уровне ВВ в больших популяциях ВВ. Этот метод может быть использован как на необработанных биологических жидкостях, так и на ВВ, выделенных с помощью любого количества методов, таких как ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, преципитирующие агенты, захват иммуноаффинности, микрофлюидика и эксклюзионная хроматография.
В описанном ниже протоколе используют внеклеточные везикулы (EV), полученные из среды для культивирования клеток HEK 293 и из сыворотки мыши с использованием установленного метода выделения16. Протокол был применен ко многим другим биологическим жидкостям, средам для культивирования клеток и очищенным внеклеточным везикулам, выделенным из биологических жидкостей. Этот протокол разделен на двухдневную процедуру, рабочий процесс для типичного эксперимента показан на рисунке 1.
Рисунок 1: Рабочий процесс анализа. Рабочий процесс анализа для выбора типа анализа, который должен быть выполнен для образца между размером и количеством, подсчетом размера и окрашиванием поверхности, а также подсчетом размеров и окрашиванием груза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Образцы сыворотки были собраны у мышей в соответствии с утвержденным протоколом Институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском центре Университета Канзаса (KUMC). Использование этих биологических образцов в этих экспериментах также было одобрено KUMC.
1. Подготовка образцов (День 1)
Рисунок 2: Схема расположения 24-луночных планшетов. Показано местоположение, где нужно аликвотировать ddH,2O (синий краситель был добавлен только в целях визуализации) и скважины, в которых будут удерживаться чипы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
2. Подготовка и предварительное сканирование чипов
Рисунок 3: Изображение патрона, используемого для загрузки чипа в станок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Чип и правильное обращение с чипом. (A) Желтая пунктирная линия указывает на расположение пятнистых антител или функциональную сторону чипа. ID чипа расположен ниже линии ("58"). На рисунке также показано правильное обращение. (B) Демонстрирует ненадлежащее обращение с чипом. (C) Нефункциональная сторона чипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Демонстрация правильного размещения стружки в скважине. (A) Стружка должна быть установлена в середине скважины так, чтобы углы не касались стенок скважины. (B) Изображение неправильного размещения чипа, где углы соприкасаются со стенками колодца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
3. Загрузка и инкубация чипа и образца
4. Определение размера и количества EV (День 2)
Рисунок 6: Правильный способ извлечения стружки из воды ddH2O под углом 45°. (A) Вид сверху и (B) вид сбоку, показывающий угол, под которым следует удалить стружку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
5. Приготовление раствора антитела (день 2)
6. Определение размера, количества и фенотипирования ВВ с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
7. Опциональное окрашивание груза
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол позволяет одновременно маркировать внутренние и поверхностные маркеры.
8. Сбор данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура сбора данных с чипов с помощью ExoView R100 автоматизирована и не требует ввода данных пользователем. Подробную инструкцию можно найти в Руководстве пользователя и соответствующем видео по загрузке держателя микросхемы, или «патрона», и сбору данных17.
9. Анализ данных
На рисунке 7 (левая панель) показано трехцветное составное изображение электромобилей, полученное из кондиционированного носителя HEK293, привязанного к пятну CD63 на чипе и окрашенного для CD81, CD63 и CD9 в следующих каналах: зеленый, красный и синий соответственно. На рисунке 7 (верхняя правая панель) показано увеличенное изображение, показывающее, что каждый из захваченных электромобилей может отображать колокализацию одного или нескольких цветов с различной интенсивностью в каждом канале. Разница в окрашивании захваченных EV представляет собой гетерогенность экспрессии трех тетраспанинов на отдельных везикулах и может быть количественно определена с помощью программного обеспечения для анализа данных. На рисунке 7 (нижняя правая панель) показаны гистограммы размеров электромобилей, которые имеют длину волны выше 50 нм. Гистограмма определения размеров показывает, что захваченные электромобили на точке CD63 имеют размер моды 50 нм. Цветовая колокализация, интенсивность и размер для каждого электромобиля, привязанного к изображению пятна, представляют собой фенотипические данные, которые составляют фундаментальные данные измерения.
Рисунок 7: Трехцветное изображение полного пятна показывает полное пятно захвата CD63 с EV, полученными от HEK293, связанными и окрашенными для antiCD9-CF488, antiCD81-CF555, antiCD63-CF647. Увеличенное изображение отображает цифровое обнаружение отдельных фенотипов ВВ с использованием флуоресцентной кололокализации. Распределение размеров, полученное от SP-IRIS, для этой микросхемы показано в правом нижнем углу. ВВ собирали из кондиционированной среды HEK293T клеток. Клетки культивировали до 80% конфлюенции, а затем промывали PBS и культивировали в течение 48 ч в средах, содержащих обедненный EV FBS (10% об./об.). Кондиционированная среда, собранная в конце 48 ч, затем была раскручена при 2500 x g для удаления клеточного мусора, и оставшаяся надосадочная жидкость, содержащая EV, была проанализирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
На рисунке 8 показано трехцветное составное изображение и гистограмма интенсивности для двух примеров типов реакций контроля изотипа, с которыми может столкнуться пользователь. Верхняя панель (пример 1, EX1) показывает номинальную работу, пятно управления изотипом не имеет привязки с интенсивностью флуоресценции большей, чем автофлуоресцентная сигнатура синим цветом (>500) и (>300 а.е.) красным и зеленым, что позволяет пользователю устанавливать низкие пороговые значения. Нижняя панель (образец неспецифический 1, NS1) показывает, когда EV связываются с контролем изотипа, что приводит к высокоинтенсивному окрашиванию, как показано на гистограмме. В этом сценарии данные о точках, специфичных для маркеров, ненадежны, поскольку они охватывают тот же диапазон интенсивности, что и EV в контрольной точке, вывод о том, что EV в активных точках специально задействованы там, больше не работает. Когда это явление происходит, оно обычно связано с состоянием образца.
Рисунок 8: Анализ пороговых границ. На верхнем левом изображении показано номинальное контрольное пятно и связанные с ним флуоресцентные гистограммы (вверху справа), где частицы выше порогового значения показаны в затененной области, нижнее левое изображение представляет собой пример неспецифического связывания EV с контрольным пятном, а затененные области флуоресцентной гистограммы находятся выше порогового значения, в том же диапазоне, что и положительные EV в точке захвата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
На рисунке 9 представлена колокализация одиночного белка EV, полученных из сыворотки крови человека. ВВ захватывали с использованием антител захвата анти-CD63, CD9, CD81 и mlgG и окрашивали на CD81 (зеленый), HSP72 (красный) и CD9 (синий). На рисунке 9 показано, что CD81 является наиболее аккумулируемым маркером в ВВ, полученных из сыворотки крови человека. При этом уровень CD63 является самым низким по сравнению с CD81 и CD9. Среди захваченных антител к CD63, CD9 и CD81 антитела отношение HSP72 в захваченных антителах CD63 выше, в то время как этот уровень аналогичен между захваченными антителами к CD9 и CD81. Обнаружение специфической локализации HSP72 и CD63 среди всех не-HSP72-положительных EV, которые также несут маркеры тетраспанина, демонстрирует уникальную способность сбора данных с помощью интерферометрии одиночных частиц и флуоресценции.
Рисунок 9: Колокализация белка одиночного ВВ. ВВ, полученные от человека, захватывали с помощью антител против CD63, CD9, CD81 и mlgG (изотип) и окрашивали на CD81 (зеленый), HSP72 (красный) и CD9 (синий). Популяция EV была визуализирована с использованием флуоресцентного режима. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Современные методы определения характеристик ЭВ в значительной степени опираются на очищенные ВВ, что ограничено текущими экспериментальными ограничениями методов очистки ЭВ 9,10,11,12,13. Одночастично-интерферометрическая визуализация отражательной способности (SP-IRIS) — это эффективная технология, которая позволяет исключить этапы очистки, необходимые для анализа образцов, и, таким образом, сэкономить время и снизить затраты, связанные с типичными рабочими процессами EV. Требуемый объем ввода образца, как правило, очень мал, что позволяет использовать оставшуюся часть образца для дополнительных аналитических методов.
Кроме того, возможность измерения ВВ антиген-специфичным способом очень важна для фундаментальных исследований ВВ, а также для обнаружения редких событий в диагностических и терапевтических приложениях. Тем не менее, специфические для заболевания ВВ могут присутствовать в крови в низких концентрациях по сравнению с другими циркулирующими ВВ и загрязнителями 2,11,12. Протокол может быть модифицирован для включения других антител для обнаружения этих субпопуляций с использованием флуоресцентно меченных антител с возбуждением на длине волны 488 нм, 555 нм или 647 нм соответственно. В этом случае следует разработать положительный и отрицательный биологический контроль, против которого можно использовать серию титрований для оптимизации обнаружения интересующего маркера. В данном случае следует отметить, что метод положительного отбора, используемый SP-IRIS, может оказаться неблагоприятным для данного эксперимента, поскольку интересующий его маркер не может сильно колокализоваться с уменьшением тетраспанина, что затрудняет обнаружение. Если такая ситуация возникает, выгодно захватывать ВВ на чипе с помощью интересующего маркера, тем самым преодолевая положительное смещение отбора на пятнах тетраспанина. Обобщенная способность визуализации SP-IRIS к мечению позволяет обнаруживать до четырех маркеров в определенном точке захвата, что требует обсуждения того, как разрабатывать и интерпретировать обнаружение новых маркеров с помощью SP-IRIS и соответствующих средств контроля. При использовании контрольного пятна изотипа в качестве единственного контрольного для чипа мы действительно рассматриваем вопрос о том, существует ли неспецифическое связывание образца антитела непосредственно с пятном захвата изотипа во время установки порогового значения. Если мы наблюдаем сходную колокализационную сигнатуру в контроле изотипа и маркер-специфичном пятне, это указывает на то, что ВВ неспецифически привязаны к контролю, и протокол следует изучить. Выбор хороших положительных и отрицательных контрольных образцов может помочь пользователям дифференцировать, является ли неспецифическое связывание антителами на чипе или флуоресцентно меченными первичными антителами. Если есть подозрение на связывание EV с контрольным пятном изотипа, то отрицательный контрольный образец EV может быть инкубирован при фиксированной концентрации на чипе и окрашен нормальной окрашивающей концентрацией представляющего интерес антитела. Настройки предельных значений должны быть выполнены, как описано в разделе 9 Сбор данных, шаг 9.6. Убедитесь, что на пятнах для интересующего маркера нет привязки. Пороговые значения, установленные на отрицательном образце EV, могут быть применены к остальным образцам в эксперименте. При наличии положительного контроля полезно провести тест на титрование для определения оптимальной концентрации окрашивания с дополнительными антителами.
Преимущество специфического обнаружения, используемого в SP-IRIS для электромобилей, также может иметь ограничения для этого метода. Стадия инкубации в разделе 3 по своей сути является методом положительного отбора, который не дает никакой информации о частицах, которые могут присутствовать в образце, но не отображает маркеры, соответствующие типам захвата на конкретном чипе, поскольку они будут смыты после захвата и не будут реализованы во время анализа. В связи с тем, что на всех электромобилях нет общепринятого универсального маркера, пользователи должны рассматривать свои данные как измеренную популяцию и учитывать количество захваченных частиц по отношению к ортогональным мерам общей концентрации частиц, чтобы решить, представляют ли данные захвата SP-IRIS все EV в конкретном образце.
Метод SP-IRIS был применен к другим биологическим наночастицам (например, патогенным вирусам и вирусным векторам)18. Чтобы применить SP-IRIS для обнаружения других биологических частиц, необходимо выбрать антитело захвата или зонд против поверхностного маркера, чтобы обеспечить его иммунозахват на чипе. В настоящее время биологические частицы диаметром до 200 нм могут быть охарактеризованы с помощью SP-IRIS. При использовании флуоресцентного считывания нижнего предела диаметра не существует, поскольку SP-IRIS имеет чувствительность одного датчика обнаружения. Для обеспечения точности и воспроизводимости исследований SP-IRIS и облегчения интеграции с другими данными EV мы предлагаем использовать платформу EV Track19. Загрузка общих данных непрактична (гигабайты) и доступна только тем, кто использует программное обеспечение ExoView. Поэтому мы предлагаем, чтобы для каждого исследованного образца и части публикации файл Filtered Particle List, который можно легко экспортировать вместе с тепловой картой, был загружен в EV Track. Этот файл содержит полные данные о частицах и настройки отсечения, с помощью которых можно проверить любую цифру или вопрос или получить ответ.
В заключение следует отметить, что SP-IRIS предлагает эффективный и действенный метод определения характеристик электромобилей, который обеспечивает простой способ проведения рутинных измерений размера одного электромобиля и отображения биомаркеров. Эти новые данные могут раскрыть скрытые детали стехиометрии загрузки электромобилей, непосредственно обнаруживать редкие субпопуляции и помочь проложить путь к дальнейшему прогрессу в нашем понимании важной роли электромобилей в здоровье и болезнях.
Клейтон Дейган и Джордж Даабул являются сотрудниками и акционерами NanoView Biosciences Inc.
Эта работа была частично спонсирована Программой наград за научное оборудование и закупки ресурсов Медицинской школы Канзасского университета. PCG, LKC, FD и AR были поддержаны за счет средств NIA R21 AG066488-01.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-cm sterile Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
15mL sterile tube | n/a | various | |
24-well cell culture plate, flat bottom | Fisher | 08-772-1 | |
Blocking Solution | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Chipfiles | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Chips | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Chuck | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Corning Easy Grip Disposable Polystyrene Sterile Bottles 250 ml | Fisher | 09-761-4 | |
Corning Easy Grip Disposable Polystyrene Sterile Bottles 500 ml | Fisher | 09-761-10 | |
Deionized (DI) water | Fisher | LC267404 | |
EMS style tweezers with Carbon Fiber tips | Fisher | 50-193-0842 | |
ExoView Human Tetraspanin Kit | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Capture for hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control + stains for hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 Chips per kit |
ExoView R100 Imager | NanoView Biosciences | EV-R100 | Interferometric microscope including high specification camera including 3 color fluorescence and label free sizing and counting extracellular vesicles |
Fluorescently labled huma CD9 IgG antibody | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Fluorescently labled human CD63 IgG antibody | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Fluorescently labled human CD81 IgG antibody | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Incubation Solution | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Orbital shaker or microplate shaker with digital settings capable of shaking at 500 rpm | n/a | various | |
Plate Seal | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Solution A | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Solution B | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Solution C | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Solution D | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Can be found in ExoView Human Tetraspanin Kit. |
Square/flat tip tweezer | Fisher | 50-239-62 | |
Straight strong point Boley style tweezers | Fisher | 16-100-124 | |
Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals | Fisher | AB-0558 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены