Caracterização de imagens de refletância interferométrica de partícula única de vesículas extracelulares individuais e dinâmica populacional

Este protocolo apresenta imagens de refletância interferométrica de partícula única projetadas para medições abrangentes e multinível de tamanho de vesículas extracelulares (EV), contagem de EV, fenótipo EV e colocalização de biomarcadores EV.

As vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de tamanho nanométrico com uma bicamada lipídica que são secretadas pela maioria das células. Os EVs carregam uma infinidade de moléculas biológicas diferentes, incluindo proteínas, lipídios, DNA e RNA, e são postulados para facilitar a comunicação célula a célula em diversos tecidos e órgãos. Recentemente, os EVs têm atraído atenção significativa como biomarcadores para diagnósticos e agentes terapêuticos para várias doenças. Muitos métodos foram desenvolvidos para caracterização de EV. No entanto, os métodos atuais para análise de VE têm limitações diferentes. Assim, o desenvolvimento de métodos eficientes e eficazes para isolamento e caracterização de EV continua sendo uma das etapas cruciais para este campo de pesquisa de ponta à medida que amadurece. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado descrevendo um sensor de imagem de refletância interferométrica de partícula única (SP-IRIS), como um método capaz de detectar e caracterizar EVs de fontes biológicas não purificadas e EVs purificadas por outras metodologias. Essa técnica avançada pode ser usada para medições abrangentes e de vários níveis para a análise do tamanho do EV, contagem de EV, fenótipo de EV e colocalização de biomarcadores.

As vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de membrana de tamanho nanométrico de origem celular que podem ser isoladas de vários fluidos biológicos, incluindo sangue, leite materno, saliva, urina, bile, suco pancreático e fluidos cefalorraquidianos e peritoneais. A derivação de EVs ocorre por meio de três mecanismos principais: apoptose, liberação via fusão de corpos multivesiculares com a membrana plasmática e bolhas da membrana plasmática¹. Evidências de transferência EV de componentes de células doadoras para células e tecidos vizinhos ou distantes sugerem que esses pacotes fechados por membrana podem desempenhar papéis importantes em cascatas de sinalização parácrina, bem como de longa distância ou endócrina ^1,2,3. Como os EVs podem fornecer um instantâneo do fenótipo de uma célula, o potencial para seu uso como ferramentas diagnósticas e terapêuticas para o tratamento de várias doenças tornou-se uma área ativa de pesquisa 4,5,6,7,8.

Muitos métodos voltados para a caracterização de EV foram desenvolvidos 9,10,11,12,13. A maioria desses métodos fornece informações exclusivas e valiosas sobre populações de EVs principalmente em massa. Embora um subconjunto dessas técnicas possa fornecer detalhes sobre substâncias dentro ou em EVs únicos, pode haver limitações para caracterizar EVs no nível de EV único. Por exemplo, a microscopia imunoeletrônica pode ser usada para entender EVs únicos e sua composição, mas essa técnica é de baixo rendimento, severamente limitada em sua capacidade de ser usada para descrever a dinâmica populacional e requer o desenvolvimento significativo^{de métodos 14}.

Recentemente, o desenvolvimento e a comercialização da técnica de sensor de imagem de refletância interferométrica de partícula única (SP-IRIS), por meio da plataforma ExoView, abriram a caracterização individual de EV usando um método automatizado de coleta de dados simples e de rotina. O núcleo dessa tecnologia é o chip, uma camada dupla de 1 cm x 1 cm Si/SiO₂ , que permite a medição interferométrica de nanopartículas biológicas únicas. O chip é cultivado com um microarray de pontos de anticorpos funcionalizados individuais, permitindo a detecção multiplexada de até seis tipos diferentes de captura. Os chips padrão incluem os marcadores comuns de tetraspanina (CD81, CD63 e CD9) para captura durante a etapa de incubação, e o usuário pode adicionar pontos de captura personalizados adicionais para isolar populações distintas de EVs separadas das tetraspaninas. Após a etapa de incubação, cada ponto de captura vinculou muitos EVs a ele que expressam o marcador correspondente. Esses EVs capturados podem então ser simplesmente lavados, secos e digitalizados no leitor para quantificar o tamanho das vesículas ligadas ao local de captura entre 50-200 nm para fornecer uma distribuição de tamanho ponderada via SP-IRIS¹⁵. O sistema também oferece três canais de detecção fluorescente para imunomarcar os EVs capturados e fornece a intensidade fluorescente média, que não é limitada pelo tamanho, como medições SP-IRIS, e aspectos de colocalização para cada coloração fluorescente. Isso permite que o usuário defina populações de EVs únicos com base na exibição de quatro biomarcadores diferentes por EV (captura mais três marcadores imunofluorescentes). O sistema pode ir além da medição de proteínas de superfície com imunofluorescência, pois um protocolo de carga opcional permite ao usuário sondar proteínas internas dos EVs capturados e epítopos luminais de marcadores de superfície que abrangem a membrana, além de permitir que o usuário verifique a integridade da membrana EV. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado descrevendo as etapas necessárias para obter dados consistentes sobre o tamanho e o número de EVs, com até quatro biomarcadores diferentes em um único nível de EV em grandes populações de EVs. Essa técnica pode ser usada em fluidos biológicos não processados e EVs isolados usando qualquer número de técnicas, como ultracentrifugação, ultrafiltração, agentes precipitantes, captura de imunoafinidade, microfluídica e cromatografia de exclusão de tamanho.

O protocolo descrito abaixo usa vesículas extracelulares (EV) derivadas de meios de cultura de células HEK 293 e do soro de camundongo usando um método de isolamento estabelecido¹⁶. O protocolo foi aplicado a vários outros fluidos biológicos, meio de cultura de células e vesículas extracelulares purificadas isoladas de fluidos biológicos. Este protocolo é dividido em um procedimento de dois dias com o fluxo de trabalho para um experimento típico mostrado na Figura 1.

Figura 1: Fluxo de trabalho do ensaio. Fluxo de trabalho de ensaio para escolher o tipo de análise a ser concluída para a amostra entre tamanho e contagem, contagem de tamanho e coloração de superfície e contagem de tamanho e coloração de carga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostras de soro foram coletadas de camundongos de acordo com um protocolo aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro Médico da Universidade do Kansas (KUMC). O uso dessas amostras biológicas nesses experimentos também foi aprovado pelo KUMC.

1. Preparação da amostra (Dia 1)

1. Determine a concentração de EV usando rastreamento de nanopartículas ou uma técnica equivalente.
2. Diluir a amostra com a solução de incubação até uma concentração de 5 x 10^7-5 x 10⁸ EVs/mL; é necessário um mínimo de 50 μL.
   NOTA: Para amostras em que a concentração de EV é desconhecida, a proteína total a 1 μg/mL pode ser usada como medida substituta. Se for previsível que a amostra seja de baixa concentração, execute pelo menos uma diluição de 1:1 na solução de incubação antes de carregá-la.
3. Coloque uma placa de 24 poços em uma superfície plana, livre de vibrações e movimentos bruscos.
   NOTA: Para aumentar o contraste, uma folha de papel branca pode ser colocada sob a placa.
4. Adicione água às áreas ao redor dos poços (Figura 2).

Figura 2: Layout da placa de 24 poços. Os locais de onde alíquota ddH₂O (corante azul foi adicionado apenas para fins de visualização) e os poços nos quais os chips serão mantidos são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação e pré-digitalização de chips

1. Remova a placa selada de 48 poços contendo cavacos da geladeira de 4-8 ° C e deixe-os atingir a temperatura ambiente (~ 15 min) antes de abrir a vedação.
   NOTA: Isso é essencial para evitar condensação nos cavacos que podem danificar as manchas. Se for observada condensação na superfície ao remover o chip da embalagem, espere mais tempo antes de remover os outros.
2. Prossiga para a etapa 8 para recuperar o mandril para se preparar para a execução da pré-varredura (Figura 3).
   NOTA: Os dados de pré-varredura serão usados para identificar quaisquer partículas detectáveis nos pontos de captura antes da incubação com a amostra para que possam ser removidas durante a etapa de análise.

Figura 3: Imagem do mandril usado para carregar o cavaco na máquina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Usando uma pinça, remova o número desejado de cavacos (um cavaco por amostra) da placa de 48 poços e carregue os cavacos diretamente no mandril para a execução da pré-varredura. Quando todos os chips destinados a serem usados para o experimento tiverem sido carregados e pré-digitalizados conforme descrito na etapa 8, prossiga para a etapa 2.4.
   NOTA: Ao manusear chips, certifique-se de não tocar nos quadrados no centro, pois os pontos de captura de anticorpos estão nessa região e serão danificados se tocados pela pinça (Figura 4).

Figura 4: Chip e manuseio adequado do chip. (A) A linha pontilhada amarela indica a localização dos anticorpos detectados ou o lado funcional do chip. O ID do chip está localizado abaixo da linha ("58"). A figura também mostra o manuseio adequado. (B) Demonstra manuseio inadequado do chip. (C) Lado não funcional do chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Coloque cada chip pré-escaneado com a superfície funcionalizada voltada para cima na placa pré-preparada de 24 poços. A superfície funcionalizada é facilmente reconhecida pela numeração distinta, grades de alinhamento e as três caixas pretas no meio. O lado não funcionalizado é uma superfície plana e uniforme prateada.
5. Use uma pinça de ponta fina para garantir que cada cavaco esteja centralizado dentro do poço (Figura 5).
   NOTA: Centralizar o cavaco dentro do poço é fundamental porque se o cavaco tocar a parede do poço, a amostra pode ser eliminada após o carregamento.

Figura 5: Demonstração da colocação adequada de cavacos no poço. (A) Os cavacos devem ser colocados no meio do poço, sem cantos tocando as laterais do poço. (B) Representação de colocação inadequada do chip, onde os cantos tocam as laterais do poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Carregamento e incubação do chip e da amostra

1. Pipetar 35 μL da amostra preparada (do passo 1) para a microplaqueta.
   NOTA: Tenha cuidado para não adicionar bolhas ou tocar no chip com a ponta da pipeta, pois isso pode impedir a distribuição uniforme da amostra no chip ou danificar os pontos de anticorpos no chip. A amostra deve se espalhar por toda a superfície do chip. No caso de a amostra se desprender da aparas durante o carregamento, adicionar uma amostra adicional ao alvéolo até um volume de 250 μL ou adicionar uma solução de incubação até 250 μL e observar o fator de diluição alterado para essa amostra.
2. Sele a placa, usando o filme da placa incluído no kit para evitar a evaporação da amostra.
3. Incubar a amostra/chip durante a noite (~16 h) na placa selada à temperatura ambiente em uma área livre de vibrações ou movimentos.
   NOTA: Após a incubação noturna, o usuário escolherá a opção apropriada do Dia 2 para sua pergunta de pesquisa. Se apenas o tamanho e a contagem de EV forem desejados, prossiga com a etapa 4 (Dia 2). Se a análise de vários marcadores de superfície for desejada, pule para a etapa 5 (Dia 2).

4. Determinando o tamanho e a contagem de EV (Dia 2)

1. Adicione 1 mL da solução A na lateral de cada poço contendo um chip, tomando cuidado para não adicionar diretamente a solução no chip ou arranhar o chip com a ponta da pipeta.
2. Coloque a placa em um agitador orbital girando a ~500 rpm por 3 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Se as lascas chacoalharem na placa, diminua imediatamente a velocidade de forma que o líquido fique girando, mas não haja barulho.
3. Remova 750 μL de líquido. Evite inclinar a placa durante a remoção de líquidos para evitar a secagem acidental do cavaco.
4. Adicione 750 μL de Solução B usando a técnica descrita na etapa 4.1 e agite a ~ 500 rpm por 3 min em temperatura ambiente.
5. Repita as etapas 4.3-4.4 mais duas vezes para um total de três lavagens com a Solução B.
6. No final da última lavagem, remova 750 μL da solução, deixando 250 μL da Solução B no poço.
7. Adicione 750 μL de água bidestilada (ddH₂O) e agite a ~500 rpm por 3 min em temperatura ambiente.
8. Encha uma placa de Petri de 10 cm com 50 mL de ddH₂O e transfira um chip de cada vez do poço para a placa usando uma pinça.
   NOTA: Tome cuidado para transferir o chip horizontalmente e certifique-se de que não seque. Até oito cavacos podem ser lavados antes de substituir o ddH₂O.
9. No ddH₂O, segure o chip pelas bordas usando uma pinça e gire no prato por três voltas para remover os detritos.
10. Remova o chip em um ângulo de 45° para fora da água e coloque-o em papel absorvente com o ID do chip voltado para cima (Figura 6).
    NOTA: As fichas agora estão prontas para serem lidas. Pule para a etapa 8 para digitalizar no leitor SP-IRIS.

Figura 6: Maneira correta de remover o cavaco da água ddH₂O em um ângulo de 45°. (A) Vista de cima e (B) vista de lado demonstrando o ângulo em que remover o cavaco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Preparação da solução de anticorpos (Dia 2)

1. Adicione 300 μL de solução de bloqueio por chip em um tubo de tamanho apropriado (0,5 a 3 mL).
2. Adicione 0,6 μL de anticorpo por 300 μL da solução de bloqueio. Misture delicadamente batendo no tubo e centrifugue rapidamente.
   NOTA: Anticorpos para CD9, CD81 e CD63 humanos ou CD9, CD81 e CD63 murinos estão incluídos nos kits apropriados. Se outros anticorpos conjugados fluorescentes forem desejados, determine a concentração de coloração ideal usando uma titulação típica em uma faixa de 0,1 a 10 μg/mL com uma carga de amostra constante, como faria para citometria de fluxo.

6. Determinando o tamanho, a contagem e a fenotipagem do EV com coloração imunofluorescente

1. Adicione 1 mL de Solução A na lateral de cada poço contendo um cavaco, tomando cuidado para não adicionar diretamente a solução no cavaco ou arranhar o cavaco com a ponta da pipeta.
2. Coloque a placa em um agitador orbital girando a ~500 rpm por 3 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Se as lascas chacoalharem na placa, diminua imediatamente a velocidade de forma que o líquido fique girando, mas não haja barulho.
3. Remova 750 μL do líquido. Evite inclinar a placa durante a remoção de líquidos para evitar a secagem acidental do cavaco.
4. Adicione 750 μL de Solução A usando a técnica descrita na etapa 6.1 e agite a ~ 500 rpm por 3 minutos em temperatura ambiente.
5. Repita as etapas 6.3 e 6.4 duas vezes para um total de três lavagens com a Solução A.
6. No final da última lavagem, remova 750 μL da solução, deixando 250 μL da Solução A no poço.
   NOTA: Se o usuário desejar Coloração de Carga, prossiga para a etapa 7 neste ponto. Caso contrário, prossiga para a etapa 6.7
7. Adicione 250 μL da solução de anticorpos (etapa 5) a cada chip no poço. Cubra a placa com papel alumínio para proteger da luz e agite por 1 h no agitador orbital à temperatura ambiente.
8. Adicione 500 μL de Solução A, de modo que o volume total por poço seja ~ 1.000 μL.
9. Remova imediatamente 750 μL e adicione 750 μL de solução A e agite a ~ 500 rpm no agitador orbital por 3 min em temperatura ambiente.
10. Remova 750 μL da solução e adicione 750 μL da Solução B e agite a ~ 500 rpm por 3 minutos em temperatura ambiente.
11. Repita a etapa 6.10 mais duas vezes para um total de três lavagens.
12. Adicione 750 μL de água bidestilada (ddH₂O) e agite a ~500 rpm por 3 min em temperatura ambiente.
13. Encha uma placa de Petri de 10 cm com 50 mL de ddH₂O e transfira um chip do poço para a placa usando uma pinça.
    NOTA: Tome cuidado para transferir o chip horizontalmente e certifique-se de que não seque. Até oito cavacos podem ser lavados antes da troca por ddH₂O fresco.
14. No ddH₂O, segure o cavaco pelas bordas usando uma pinça e gire no prato por três rotações para remover os detritos.
15. Remova o chip em um ângulo de 45° para fora da água e coloque-o em papel absorvente com o ID do chip voltado para cima (Figura 6).
    NOTA: As fichas agora estão prontas para serem lidas. Pule para a etapa 8 (Coleta de dados) para obter instruções sobre como configurar os chips para digitalização no leitor.

7. Coloração de carga opcional

NOTA: Este protocolo permite a rotulagem simultânea de marcadores internos e de superfície.

1. Com 250 μL de Solução A restantes em cada poço, adicione 250 μL de Solução C em cada poço.
2. Coloque imediatamente no agitador orbital e ajuste para ~200 rpm por precisamente 10 min.
   NOTA: Nesta etapa e na etapa 7.8 abaixo, tanto o tempo quanto a velocidade de agitação mais lenta são críticos; Certifique-se de que a velocidade dê apenas um redemoinho lento nos poços e use um cronômetro.
3. Após 10 minutos de incubação com a solução C, adicione 500 μL de solução A a cada poço.
4. Remova imediatamente 750 μL e adicione 750 μL de Solução A e agite a ~500 rpm no agitador orbital por 3 min em temperatura ambiente.
5. Repita a etapa 7.4 mais duas vezes para um total de três lavagens.
6. No final da última lavagem, remova 750 μL da solução, deixando ~ 250 μL da solução no poço com o cavaco.
7. Adicione 250 μL de Solução D a cada poço.
8. Coloque imediatamente no agitador orbital ajustado para ~200 rpm por precisamente 10 min.
9. Após 10 minutos de incubação com a solução C, adicione 500 μL de solução A a cada poço.
10. Remova imediatamente 750 μL e adicione 750 μL de solução A e agite a ~ 500 rpm no agitador orbital por 3 min em temperatura ambiente.
11. Repita a etapa 7.10 duas vezes para um total de três lavagens.
12. Remova 750 μL da solução após a última lavagem e retorne à etapa 6.7 acima para coloração e conclusão do protocolo de ensaio.

8. Coleta de dados

NOTA: O procedimento para coletar dados dos chips usando o ExoView R100 é automatizado e não requer entradas do usuário. Instruções detalhadas podem ser encontradas no Guia do Usuário e no vídeo correspondente para carregar o suporte do chip, ou "mandril", e aquisição de dados¹⁷.

1. Ligue a plataforma de caracterização EV usando os dois interruptores de energia na parte traseira do instrumento e, em seguida, inicie o software do scanner clicando duas vezes no ícone da área de trabalho.
   NOTA: Quando o software do scanner for iniciado, o leitor será definido automaticamente para a tela inicial e, em seguida, solicitará ao usuário que "Abra a porta para carregar os chips".
2. Abra a porta na frente do leitor levantando a maçaneta prateada. Isso ejetará a platina, permitindo que o usuário acesse o mandril e configure uma nova varredura no software.
3. Identifique o local onde o usuário deseja salvar os dados clicando na pasta Salvar e selecionando um local desejado para os dados a serem salvos.
   NOTA: Muitas vezes é útil nomear o local de salvamento com algo perspicaz como o nome do experimento e, em seguida, criar duas subpastas, uma para pré-varreduras e outra para pós-varreduras. Isso facilita a localização e a correspondência dos dados durante a análise.
4. Para escanear os chips, localize os chipfiles no computador de controle.
   NOTA: Os arquivos de chip são mapas do layout do ponto de anticorpo no chip em uso e permitem que o scanner saiba onde digitalizar em cada chip. Em cada kit, há uma chave USB com os arquivos de chip para os chips dentro. Eles devem ser salvos em um local no computador de controle após o recebimento do kit, onde os usuários possam encontrá-los de forma confiável.
5. Carregue os chips no mandril com o número nos cavacos voltado para a alça do mandril e, em seguida, no menu suspenso Chip no computador, selecione cada chip da lista de arquivos de chip e coloque-o no local correspondente apropriado no mandril virtual no software do scanner. Depois de concluído, um prompt na tela solicitando que o usuário coloque o mandril no palco aparecerá.
6. Coloque o mandril carregado no palco; o alinhamento magnético no mandril irá movê-lo automaticamente para o local correto no palco e, em seguida, clique em OK ao lado de Colocar o mandril no palco. O scanner iniciará a rotina automatizada de coleta de dados.
   NOTA: Os dados estão prontos para serem analisados assim que o software relatar o status de varredura de cada chip como bem-sucedido.

9. Análise dos dados

1. Clique duas vezes em ExoView Analyzer na área de trabalho do PC de controle. Após a inicialização do software, clique no botão Dados de pré-varredura e selecione o local da pasta para o conjunto de dados de pré-varredura na seção 8.3.
2. Clique no botão Dados do Postscan e selecione o local da pasta para o conjunto de dados do postscan na seção 8.3.
   NOTA: Se os dados forem detectados corretamente em ambas as pastas, para pelo menos alguns dos chips, o software exibirá o número "X" de chips detectados ao lado do botão de localização do Chipfile. Quando salvos corretamente, os chips detectados devem corresponder ao número de chips verificados.
3. Clique em Avançar na parte inferior da área de carregamento de dados.
4. No menu suspenso da metatabela, cada ficha terá uma célula. Insira os nomes das amostras, fatores de diluição e quais marcadores estão sendo corados em cada canal de detecção clicando na caixa correspondente e digitando as informações; quando concluído, clique em Avançar novamente.
   NOTA: Esses metadados serão salvos com os dados.
5. Controle de qualidade de pré-formas (CQ) clicando na guia Desativar sob o botão CQ no canto superior esquerdo.
   NOTA: Esse recurso permite que sondas e chips específicos sejam desligados para análise. O software fornecerá dois avisos diferentes sobre os dados, um para contagens altas que podem indicar que uma determinada captura está saturada e um alto coeficiente de variação (CV) que identifica quando uma das réplicas de um tipo de captura é diferente das outras.
   1. Clique em um ponto de aviso para CV alto, examine os pontos que estão sendo chamados pelo software e veja se há danos físicos óbvios; quando o dano for identificado, clique no Número do Ponto para desativar esse ponto na análise.
   2. Repita até que todos os avisos tenham sido avaliados e clique em Avançar.
6. Análise de corte de pré-forma clicando na guia Corte localizada ao lado da guia Desativar no botão CQ no canto superior esquerdo.
   NOTA: Isso apresentará a resposta fluorescente do ponto de controle em um gráfico e oferecerá ao usuário duas configurações, um mínimo e um máximo para cada canal de cor (vermelho/verde/azul). Definir o valor de corte para cada canal de detecção fluorescente é o único ajuste de dados que precisa ser feito e é relativamente simples. É importante ressaltar que o ponto de corte final escolhido deve ser consistente em um experimento e, conforme observado, deve estar dentro das regras gerais para 300-400 u.a. em vermelho e verde, e 400-700 u.a. para azul em experimentos típicos; O software também possui guias codificados por cores para o usuário para essas faixas.
   1. Clique na guia Cor Verde para carregar os dados desse canal e exibir os cortes atuais. Examinando o ponto de controle negativo do isotipo, pode-se ver eventos de detecção com intensidades de fluorescência muito baixas; Nesse caso, os usuários normalmente devem esperar definir o verde entre 300-400 UA.
      1. Aumente o mínimo para cada um dos canais de detecção até que a "Avg % Inc" (a % média das partículas detectadas no ponto de controle incluído acima do corte) sob a exibição de dados não tenha avisos conforme indicado pelo realce vermelho ou amarelo nessa célula.
         NOTA: O valor máximo geralmente não precisa ser ajustado do padrão, mas pode ser reduzido para filtrar partículas brilhantes ou limitar a detecção fluorescente a uma faixa mais estreita.
      2. Clique no botão Avançar .
   2. Clique na guia Cor Vermelha para carregar os dados desse canal e exibir os cortes atuais. Novamente, examinando o ponto de controle negativo do isotipo, pode-se ver eventos de detecção com intensidades de fluorescência muito baixas; Nesse caso, os usuários normalmente devem esperar definir o vermelho entre 300-400 UA. Siga os mesmos procedimentos observados nas etapas 9.6.1.1 a 9.6.1.3.
   3. Clique na guia Cor Azul para carregar os dados desse canal e exibir os cortes atuais. Mais uma vez, examinando o ponto de controlo negativo do isotipo, seguir os mesmos procedimentos indicados nos passos 9.6.1.1 a 9.6.1.3.
      NOTA: O canal azul é único, pois o anticorpo no local é autofluorescente em níveis suficientes para exigir um corte ligeiramente maior de 400-700 u.a., mesmo para chips em branco.
7. Após a conclusão da análise de corte, clique em Avançar e o gráfico do mapa de calor aparecerá, o que fornecerá uma visão geral da ligação de partículas no experimento. Existem várias ferramentas de visualização que o usuário pode usar para plotar os dados. Esses gráficos e dados brutos associados podem ser adicionados a um relatório clicando no botão Adicionar relatório de plotagem .
   NOTA: O mapa de calor é a exibição de dados padrão que mostra uma visualização de todas as amostras, todas as capturas de uma detecção específica. A exibição padrão é o total que quantifica os EVs exclusivos vinculados a cada ponto de captura.
8. Clique no botão Exportar relatório e selecione um local para salvar o relatório.
   NOTA: O relatório será aberto em um navegador. Localize o arquivo de planilha da Lista de partículas filtradas anexado ao relatório; esta é a informação a submeter à EVTRACK.
9. Continue adicionando relatórios usando as diferentes seleções de Amostras e Tipos de captura nos menus suspensos na parte superior da tela. Os dados exibidos são controlados com a seleção de botões de detecção de canal no canto superior esquerdo. Defina um fenótipo/seleção de amostra/canal de captura específico clicando em cada botão de cor para desativar (esmaecido) ou ativar (colorido) esse canal de detecção.
10. Clique no botão Adicionar Plotagem ao Relatório para agregar as parcelas desejadas em um relatório.
11. Clique em Exportar Relatório e defina o local de salvamento para o relatório final.

A Figura 7 (painel esquerdo) mostra uma imagem composta de três cores de EVs derivadas de mídia condicionada HEK293 ligada ao ponto CD63 no chip e corada para CD81, CD63 e CD9 nos seguintes canais verde, vermelho e azul, respectivamente. A Figura 7 (painel superior direito) é uma imagem ampliada que mostra que cada um dos EVs capturados pode exibir a colocalização de uma ou mais cores com intensidades variadas em cada canal. A diferença na coloração das EVs capturadas representa a heterogeneidade da expressão das três tetraspaninas em vesículas únicas e pode ser quantificada pelo software de análise de dados. A Figura 7 (painel inferior direito) exibe os histogramas de dimensionamento dos EVs, que estão acima de 50 nm. O histograma de dimensionamento mostra que os EVs capturados no ponto CD63 têm um tamanho de modo de 50 nm. A colocalização de cores, intensidade e tamanho de cada EV vinculado à imagem do ponto representa os dados fenotípicos, que compõem os dados fundamentais na medição.

Figura 7: A imagem tricolor do ponto completo mostra um ponto de captura CD63 completo com EVs derivados de HEK293 ligados e corados para antiCD9-CF488, antiCD81-CF555, antiCD63-CF647. A imagem ampliada mostra a detecção digital de fenótipos EV únicos usando colocalização fluorescente. A distribuição de tamanho derivada do SP-IRIS para este chip é mostrada no canto inferior direito. As EVs foram coletadas de meio condicionado de HEK293T células. As células foram cultivadas a 80% de confluência e, em seguida, lavadas com PBS e cultivadas por 48 h em meio contendo FBS depletado de EV (10% vol / vol). O meio condicionado coletado ao final das 48 h foi então girado a 2.500 x g para remover os detritos celulares e o sobrenadante restante contendo EVs foi analisado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 8 mostra a imagem composta de três cores e o histograma de intensidade para dois exemplos de tipos de respostas de controle de isotipo que um usuário pode encontrar. O painel superior (exemplo de amostra 1, EX1) mostra a operação nominal, o ponto de controle do isotipo não tem ligação com intensidade fluorescente maior que a assinatura autofluorescente em azul (>500) e (>300 u.a.) em vermelho e verde, permitindo ao usuário definir cortes baixos. O painel inferior (amostra não específica 1, NS1) mostra quando os EVs se ligam ao controle do isotipo e resulta em coloração de alta intensidade, conforme mostrado pelo histograma. Nesse cenário, os dados sobre os pontos específicos do marcador não são confiáveis, porque cobrem a mesma faixa de intensidade que os EVs no ponto de controle, a inferência de que os EVs nos pontos ativos são especificamente recrutados lá não é mais válida. Quando esse fenômeno ocorre, geralmente está relacionado ao estado da amostra.

Figura 8: Análise de corte. A imagem superior esquerda mostra um ponto de controle nominal e os histogramas fluorescentes associados (canto superior direito), onde as partículas acima do corte são mostradas na área sombreada, a imagem inferior esquerda apresenta um exemplo de ligação EV inespecífica ao ponto de controle e as áreas sombreadas no histograma fluorescente são aquelas acima do ponto de corte, na mesma faixa que EVs positivos no ponto de captura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 9 representa a colocalização de proteína EV única de EVs derivados de soro humano. Os EVs foram capturados usando anticorpos de captura anti-CD63, CD9, CD81 e mlgG e corados para CD81 (verde), HSP72 (vermelho) e CD9 (azul). A Figura 9 mostra que o CD81 é o marcador mais acumulado em EVs derivadas do soro humano. Enquanto, o nível de CD63 é o mais baixo em comparação com CD81 e CD9. Entre os EVs capturados por anticorpos anti-CD63, CD9 e CD81, a proporção de HSP72 em EV capturados por CD63 é maior, enquanto esse nível é semelhante entre EVs capturados por anticorpos anti-CD9 e CD81. Esta detecção da localização específica de HSP72 e CD63 entre todos os EVs não HSP72 positivos que também carregam os marcadores de tetraspanina demonstra a capacidade única de coleta de dados de interferometria e fluorescência de partícula única.

Figura 9: Colocalização de proteína EV única. EVs derivados de humanos foram capturados usando anticorpos de captura anti-CD63, CD9, CD81 e mlgG (isotipo) e corados para CD81 (verde), HSP72 (vermelho) e CD9 (azul). A população EV foi fotografada usando o modo de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os métodos atuais de caracterização de EV dependem em grande parte de EVs purificados, o que é restrito pelas limitações experimentais atuais dos métodos de purificação de EV 9,10,11,12,13. A imagem de refletância interferométrica de partícula única (SP-IRIS) é uma tecnologia eficaz que pode eliminar as etapas de purificação necessárias para a análise da amostra e, portanto, economizar tempo e reduzir os custos associados aos fluxos de trabalho típicos de EV. A entrada de amostra necessária é geralmente muito pequena, deixando o restante da amostra disponível para métodos analíticos adicionais.

Além disso, a capacidade de medir EVs de maneira específica do antígeno é muito importante para a pesquisa fundamental de EV, bem como para a detecção de eventos raros em aplicações diagnósticas e terapêuticas. No entanto, EVs específicos da doença podem estar presentes em baixas concentrações no sangue em relação a outros EVs circulantes e contaminantes ^2,11,12. O protocolo pode ser modificado para incorporar outros anticorpos para a detecção dessas subpopulações usando anticorpos marcados com fluorescência com excitação a 488 nm, 555 nm ou 647 nm, respectivamente. Nesse caso, um controle biológico positivo e negativo deve ser desenvolvido contra o qual uma série de titulações pode ser usada para otimizar a detecção do marcador de interesse. Deve-se notar, neste caso, que o método de seleção positiva empregado pelo SP-IRIS pode se tornar prejudicial para este experimento, pois o marcador de interesse não pôde colocalizar fortemente com o pull down da tetraspanina, dificultando a detecção. Se essa situação surgir, é vantajoso capturar EVs no chip usando o marcador de interesse, superando assim o viés de seleção positiva nas manchas de tetraspanina. A capacidade de marcação generalizada da imagem SP-IRIS torna possível detectar até quatro marcadores em um ponto de captura específico, o que requer discussão sobre como projetar e interpretar a detecção de novos marcadores por SP-IRIS e controles apropriados. Ao usar o ponto de controle do isotipo como o único controle para um chip, estamos realmente considerando se há uma ligação de amostra inespecífica do anticorpo diretamente ao ponto de captura do isotipo durante a configuração de corte. Se observarmos assinatura de colocalização semelhante no controle do isotipo e no ponto específico do marcador, isso é indicativo de que os EVs não estão especificamente presos ao controle e o protocolo deve ser examinado. A seleção de boas amostras de controle positivo e negativo pode ajudar os usuários a diferenciar se a ligação não específica é dos anticorpos no chip ou dos anticorpos primários marcados com fluorescência. Se houver suspeita de ligação de EVs ao ponto de controle do isotipo, uma amostra de EV de controle negativo pode ser incubada em uma concentração fixa em um chip e corada com a concentração de coloração normal do anticorpo de interesse. As configurações de corte devem ser executadas conforme descrito na seção 9 Coleta de dados, etapa 9.6. Confirme se não há ligação nos pontos para o marcador de interesse. Os pontos de corte estabelecidos na amostra EV negativa podem ser aplicados ao restante das amostras do experimento. Sempre que um controle positivo estiver disponível, é útil executar um teste de coloração de titulação para determinar a concentração ideal de coloração com anticorpos adicionais.

A vantagem da detecção específica usada no SP-IRIS para EVs também pode apresentar limitações para a técnica. A etapa de incubação na seção 3 é inerentemente um método de seleção positiva, que não fornece informações sobre partículas que podem estar presentes na amostra, mas não exibem marcadores correspondentes aos tipos de captura em um chip específico, pois serão lavados após a captura e não realizados durante a análise. Devido ao fato de que não há marcador universal aceito presente em todos os EVs, os usuários devem revisar seus dados como uma população medida e considerar a quantidade de partículas capturadas em relação às medidas ortogonais da concentração total de partículas para decidir se os dados de captura SP-IRIS representam todos os EVs em uma amostra específica.

A técnica SP-IRIS tem sido aplicada a outras nanopartículas biológicas (por exemplo, vírus patogênicos e vetores virais)¹⁸. Para aplicar o SP-IRIS à detecção de outras partículas biológicas, um anticorpo de captura ou sonda contra um marcador de superfície precisa ser selecionado para permitir sua imunocaptura no chip. Atualmente, partículas biológicas de até 200 nm de diâmetro podem ser caracterizadas usando SP-IRIS. Não há limite inferior de diâmetro se a leitura de fluorescência for utilizada, pois o SP-IRIS tem sensibilidade de sonda de detecção única. Para garantir o rigor e a reprodutibilidade dos estudos SP-IRIS e facilitar a integração com os demais dados de EV, propomos o uso da plataforma EV Track¹⁹. O upload de dados totais não é prático (gigabytes) e só é acessível para aqueles que usam o software ExoView. Portanto, propomos que, para cada amostra interrogada e parte de uma publicação, o arquivo da Lista de Partículas Filtradas que pode ser facilmente exportado com o mapa de calor seja carregado no EV Track. Este arquivo tem os dados completos de partículas e as configurações de corte a partir das quais qualquer figura ou pergunta pode ser verificada ou respondida.

Em conclusão, o SP-IRIS oferece um método eficaz e eficiente de caracterização de EV que fornece uma maneira simples de fazer medições de rotina de tamanho único de EV e exibição de biomarcadores. Esses dados recém-disponíveis podem revelar detalhes ocultos sobre a estequiometria da carga de EV, detecção direta de subpopulações raras e ajudar a pavimentar o caminho para novos avanços em nossa compreensão do importante papel dos EVs na saúde e na doença.

Clayton Deighan e George Daaboul são funcionários e acionistas da NanoView Biosciences Inc.

Este trabalho foi patrocinado em parte pelo Programa de Prêmio de Aquisição de Recursos e Equipamentos de Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade do Kansas. PCG, LKC, FD e AR foram apoiados com fundos do NIA R21 AG066488-01.