Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера

Адаптер пластин с несколькими колонками позволяет сопроцессировать колонны хроматографии с многопробойными коллекторными пластинами для параллельной аффинной или ионообменной очистки, обеспечивая экономичный высокопроизводительный метод очистки белка. Его можно использовать под действием силы тяжести или вакуума, давая миллиграммовые количества белка с помощью доступных приборов.

Очистка белка необходима для изучения структуры и функции белка и обычно используется в сочетании с биофизическими методами. Это также ключевой компонент в разработке новых терапевтических средств. Развивающаяся эра функциональной протеомики подпитывает спрос на высокопроизводительную очистку белка и улучшенные методы, облегчающие это. Было выдвинуто гипотеза, что многоколонный пластинчатый адаптер (MCPA) может соприкосноветь несколько хроматографических колонок различных смол с многопробойными пластинами для параллельной очистки. Этот метод предлагает экономичный и универсальный метод очистки белка, который может использоваться под действием силы тяжести или вакуума, соперничая по скорости с автоматизированной системой. MCPA может быть использован для восстановления миллиграммовых выходов белка доступным и эффективным по времени методом для последующей характеристики и анализа. MCPA используется для высокопроизводительной аффинной очистки доменов SH3. Ионный обмен также был продемонстрирован с помощью MCPA для очистки белка после Ni-NTA аффинной хроматографии, указывая, как эта система может быть адаптирована к другим типам очистки. Благодаря его установке с несколькими колоннами, индивидуальная настройка параметров может быть выполнена в той же очистке, недостижимой современными методами на основе пластин.

Методы очистки белков для достижения миллиграммовых количеств очищенных белков необходимы для их характеристики и анализа, особенно для биофизических методов, таких как ЯМР. Очистка белка также занимает центральное место в других областях исследований, таких как процессы открытия лекарств и исследования белково-белкового взаимодействия; однако достижение таких количеств чистого белка может стать узким местом для этих методик^1,2,3. Основным методом очистки белка является хроматография, которая включает в себя множество методов, которые опираются на индивидуальные особенности белков и их метки. В аффинной хроматографии белки имеют дополнительный белковый или пептидный мотив, который работает как метка, имея сродство к определенному субстрату на хроматографической смоле^4. Наиболее распространенным методом сродства является иммобилизованная аффинная хроматография металлов (IMAC) с использованием помеченных His белков, тогда как другим популярным методом является ионообменная хроматография, которая разделяет белки на основе их заряда. Для обеспечения высочайшей чистоты сочетание аффинной хроматографии и ионного обмена часто используется вместе, что обычно требует дорогостоящего лабораторного оборудования для высокой пропускной способности.

Развивающаяся эра функциональной протеомики подпитывает спрос на высокопроизводительные методы очистки не единичных белков для специфического анализа, а большого количества белков одновременно для всестороннего анализа и исследований генома^5. Иммобилизованная аффинная хроматография металлов (IMAC) является одним из наиболее широко используемых методов высокопроизводительной очистки белка^6,7, но ее автоматизированные системы являются дорогостоящими и недоступными для небольших лабораторий^8. Более доступные альтернативы на основе пластин, которые в настоящее время доступны, используют доступное лабораторное оборудование, такое как вакуум. Хотя эти методы успешны в улучшении скорости очистки, он может достичь высокой пропускной способности очистки только в меньших масштабах, давая только белок в диапазоне микрограммов. Эти ограничения означают, что предварительно упакованные 96 фильтрующие пластины (например, от GE Healthcare, в настоящее время принадлежащей Cytiva) не могут быть использованы до биофизических методов^9. Гравитационная хроматография является наиболее экономичным методом очистки; однако настройка нескольких столбцов неудобна и может быть подвержена ошибкам для нескольких белков.

Был разработан и доказано, что многоколонный пластинчатый адаптер (MCPA) успешно и удобно запускает параллельные сродственные хроматографические колонки одновременно для очистки помеченных His дрожжевых доменов SH3^10. MCPA предлагает экономичный высокопроизводительный метод очистки, который не зависит от дорогостоящих приборов. Его гибкая конструкция может эффективно очищать миллиграммы белка с помощью нескольких аффинных хроматографических колонок под действием силы тяжести или вакуума. Кроме того, тип смолы, объем и другие параметры могут быть скорректированы для каждого отдельного столбца для более быстрой оптимизации. Это исследование демонстрирует, что ионообменная хроматография MCPA может быть использована в сочетании с аффинной хроматографией MCPA для усиления очистки домена Abp1 SH3. Кроме того, с помощью этих методов можно параллельно разделить до 24 различных белков.

1. Денатурировающая Ni-NTA хроматография

1. Подготовка буферов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех буферах приведена в таблице 1.
   1. Восполняйте 500 мл 0,5 М NaOH, обязательно сначала добавьте воду Milli-Q, а затем медленно добавляйте NaOH, пока якокер находится на мешалке. Фильтрация с помощью фильтра 0,22 мкм.
   2. Приготовьте 100 мл 0,1 мл сульфата никеля и процедить с помощью фильтра 0,22 мкм.
   3. Приготовьте 50 мл 2 М имидазола и процедилите с помощью фильтра 0,22 мкм.
   4. Готовят и фильтруют 0,22 мкм 1,5 л денатурирующего буфера при рН 8,0, состоящего из 5,3 мМ Tris-HCl, 4,7 мМ Трис-базового (Tris (гидроксиметил)метиламина), 13,7 мМ₂PO_4,86,3 мМ_Na2HPO₄ и 6 М гуанидина гидрохлорида.
   5. Готовят и фильтруют 0,22 мкм 500 мл лизисного буферного раствора имидазола 10 мМ, растворенного в денатурировавшем буфере (см. 1.1.4), используя запас имидазола 2 М.
   6. Готовят и фильтруют 0,22 мкм 500 мл промывочного буферного раствора имидазола 10 мМ, растворенного в денатурировавшем буфере (см. 1.1.4), используя запас имидазола 2 М.
   7. Подготовьте и фильтр 0,22 мкм 500 мл 100 мМ эдта-буфера, отрегулируйте рН до 8 с помощью 1 М NaOH.
   8. Готовят и фильтруют 0,22 мкм 500 мл элюирующего буфера, состоящего из 7 мл 99% ледниковой уксусной кислоты, в 6 М гуанидина гидрохлорида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании собственных буферов адаптируйте в соответствии с таблицей 1.
2. Лизирование клеток (метод денатурации)
   1. Добавьте 2 мл буфера лизиса к каждому 1 г собранных гранул клеток E. coli, которые содержат чрезмерно экспрессированный белок, помеченный His. Вихрь в течение нескольких минут, пока клетки не будут повторно приостановлены. Оставьте образцы на коромысле на 30 минут при 4 °C.
   2. Центрифуга лизефицирует гранулы по 18 000 х г в течение 30 минут. Держите 50 мкл в морозильной камере при -20 °C, чтобы затем проанализировать гель SDS-PAGE.
   3. Осторожно высыпьте супернатанты, следя за тем, чтобы гранула не потревожилась. Лизаты должны быть прозрачного, светло-желтого цвета. Если лизаты мутные, центрифуга снова пробует; рассмотреть возможность ультразвуковой обшивки, если это возможно для разложения нуклеиновой кислоты.
   4. Отфильтруйте супернатанты через пустую колонку (без смолы, но с фильтром) и соберите в открытый лоток для сбора. Затем переложить в пробирку для использования на этапе 1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются нативные буферы, то после этапа 1.2.1 обработайте образцы до 3 циклов замораживания/оттаивания при -80 °C или обработайте ультразвуком или френч-прессом для лиза клеток.
3. Подготовка вакуумной установки очистки и уравновешивающих колонн
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для настройки MCPA с 24 столбцами.
   1. Определите, сколько столбцов необходимо, а также требуемый тип и объем смолы. Как правило, для 100 мл культуры аутоиндукции (~ 2 г гранулы), экспрессирующих помеченные His-х sh3 домены с использованием плазмид на основе T7, используйте 0,6 мл смолы Ni-NTA на столбец, чтобы получить около 3 мг белка из примерно 6 мл лизата.
   2. Вставьте нужное количество колонок 12 мл (без смолы, но с фильтром) в предварительно собранную MCPA (длиннокапельную пластину с проколотым уплотнительным матом). Колонны должны плотно прилегать к отверстиям уплотнительного коврика, которые были проколоты.
   3. Если используется менее 24 столбцов, закройте пустые отверстия пустым закрытым столбцом.
   4. Возьмите открытую пластину сбора и поместите эту пластину в основание вакуумного коллектора и закройте ее верхней частью коллектора.
   5. Поместите собранный MCPA с колоннами на верхнюю часть вакуумного коллектора.
   6. Прикрепите трубку из вакуумной насосной системы к входному/соплу в нижней части вакуумного коллектора.
   7. Убедитесь, что шарики Ni-NTA находятся в 50% растворе с 20% этанолом. Прежде чем делать что-либо с бусинами, аккуратно встряхните / смешайте раствор бисера / этанола для равномерного повторного суспендирования. Затем, используя пипетку 5 мл, пипетку 1,2 мл 50% раствора в колонки. Во время пипетки убедитесь, что бусины остаются полностью смешанными.
   8. После пипетки во все 24 колонны включите вакуумный насос и запустите 20% этанол через колонну и в коллекционную пластину ниже.
   9. Выключите насос, как только весь 20% этанол пройдет через все колонны (смола Ni-NTA может выдерживать кратковременную сушку, если вакуум все еще применяется после того, как буфер прошел через колонну). Утилизируйте то, что находится в открытой тарелке для сбора, в ящик для мусора.
      ВНИМАНИЕ: Все отходы из бусин Ni-NTA опасны при обращении с бусинами или утилизации отходов, ношении перчаток, защитных плат и других СИЗ. Кроме того, утилизируйте все отходы сульфата никеля в отдельном контейнере для индивидуальной утилизации позже.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если смола новая или недавно регенерированная, остальные из этих шагов можно проигнорировать, перейдите к следующему разделу.
   10. Добавьте 3 объема смолы (1,8 мл) буфера ЭДТА 100 мМ с помощью шприца 20 мл или шприца-ретранслятора со шприцем 50 мл. Затем включите вакуумный насос, чтобы буфер ЭДТА промылся, и выключите насос после его промывки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эта стирка должна удалить никель-синий цвет, но если это не так, повторяйте этот шаг, пока все столбцы не потеряют свой синий цвет. Выключите насос и вылейте содержимое открытой тарелки для сбора в ящик для отходов.
   11. Добавьте 3 объема смолы (1,8 мл) буфера NaOH 0,5 М в каждую колонку, прежде чем включать насос и запускать его через каждую колонку. Пустая коллекционная тарелка.
   12. Добавьте в каждую колонку 4 объема смолы (2,4 мл) 100 мМ сульфата никеля. Включите вакуумный насос и прогоните его через колонну еще раз.
   13. Добавьте 10 объемов смолы (~6000 мкл) воды Milli-Q и прогонйте ее через колонны. Выключите насос и вылейте содержимое тарелки для сбора в ящик для мусора.
   14. Дважды промывайте колонны с 4 объемами смолы (2,4 мл) имидазола 10 мМ в промывном буфере (денатуривном или нативном) каждый раз, чтобы удалить избыток никеля и уравновесить. Пустая коллекционная тарелка.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо колонны работают значительно медленнее, отсоедините колонну и контрольный воздух можно протолкнуть через MCPA с помощью большого шприца. Если он разблокирован, используйте другой столбец со свежим фильтром.
   15. Если на MCPA будет очищено несколько различных образцов / белков, замените открытую пластину сбора на пластину сбора 48 x (5 мл / скважина). Однако, когда на каждой колонке используются только одни и те же образцы белка, можно продолжать использовать открытую пластину для сбора.
4. Погрузка, мойка и элюирование
   1. При выключении вакуума загружают лизаты в колонны (количество лизата будет варьироваться, как правило, от 1 до 12 мл или более и может потребоваться для загрузки несколькими партиями). Используйте тонкую пластиковую мешалку, чтобы аккуратно смешать шарики и лизат в колонке, чтобы максимизировать связывание.
   2. После осторожного перемешивания каждой колонки в течение нескольких минут включите вакуумный насос и пропущите лизаты через колонны. Если выполняется несколько образцов белка, используйте пластину для сбора 48 скважин и убедитесь, что пластина сбора заменена на другую пластину из 48 скважин после того, как пройдет 4 мл, поскольку колодцы в этих пластинах могут вместить только 4 мл раствора. Продолжайте запускать лизат до тех пор, пока все лизаты не будут запущены через столбец. Заморозьте пластины для сбора, которые содержат проточную часть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Столбцы могут стать «заблокированными», в результате чего лисат проходит через столбец намного медленнее, чем должен. Это легко заметить, так как соседние колонны будут течь с нормальной скоростью. Если это происходит, рекомендуется перенести смесь лизата и смолы в колонку, содержащую свежий фильтр.
   3. Замените пластину сбора пустой открытой пластиной для сбора, а затем добавьте 9 объемов смолы (5,4 мл) 10 мМ буфера для промывки имидазола в каждую колонку и включите вакуум и запустите промывку. Повторите это 4-5 раз. Чтобы избежать переполнения, периодически опорожняйте мусорную плиту.
      1. Затем замените пластину сбора на чистую соответствующую пластину (открытая пластина только для одного белка и 96 хорошо, если есть несколько белков, гарантируя, что A1 находится в верхнем левом углу).
   4. Используя шприц-ретранслятор с шприцем 12,5 мл, пипетка ~ 1 объем смолы (0,75 мл) денатурирует буфер элюирования в каждую колонку.
   5. Чтобы избежать вспенивания белка, включите вакуумный насос при минимальной настройке. Осторожно поднимите MCPA, чтобы убедиться, что ничего не осталось капать в коллекционную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой элюдации вакуумом или гравитацией является проталкивание шприцевого плунжера на 10 мл в верхнюю часть колонны, чтобы мягко протолкнуть буфер элюирования через колонну. Делайте это для каждой колонки, будьте осторожны при снятии шприцевого поршенного поршеня, чтобы не потревожить бусины в нижней части колонны. После того, как буфер элюдения будет проталкнут, аккуратно извлеките плунжер шприца из последней колонны, в которую он использовался, и кратковременно включите вакуумный насос, чтобы удалить последние капли из колонн.
      1. Если была использована сборная пластина из 96 скважин, то проверьте коллекционную пластину, чтобы убедиться, что то, что течет из каждой колонны через длинную капельную пластину, течет только в одну скважину и ничего не элюируется в соседние колодцы на пластине сбора.
   6. Для следующего элюирования повторите вышеуказанные 2 шага и соберите в свежую многоязычную (разные образцы) или открытую коллекционную пластину (те же образцы).
   7. Необязательный шаг, возьмите 50 мкл аликвоты каждого элюирования для анализа чистоты и концентрации.
   8. Добавьте 2 мл 20% этанола в каждую колонку и прогонйте его с помощью вакуумного насоса. Затем добавьте еще 2 мл 20% этанола в колонны и используйте свежую тонкую пластиковую мешалку, чтобы смешать 20% этанол и шарики перед переносом в трубку 50 мл для хранения при 4 °C. Очистите колонны и проверьте, что вода свободно течет через каждую колонну, а затем очистите все и уберите для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые столбцы в конечном итоге будут заблокированы и будут работать слишком медленно, эти столбцы должны быть заменены или фильтры очищены. Таким образом, рекомендуется периодически тестировать фильтры, удаляя смолу и заполняя столб водой, чтобы увидеть, быстро ли она протекает. Фильтры можно очищать, оставляя закрытую колонну, заполненную денатурирующим буфером элюирования и встряхивая на ночь.

2. Ионный обмен - Очистка одного белка

1. Подготовка буферов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех буферах приведена в таблице 1
   1. Приготовьте 2 л низкосолевого буфера: 10 мМ Tris pH 8,1 (5 мМ Tris Acid, 5 мM Tris Base). Фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
   2. Приготовьте 0,5 л буфера с высоким содержанием соли: 10 мМ Tris pH 8,1, 4 М NaCl. Измерьте 116,9 г NaCl и сделайте до 0,5 л с 10 мМ Tris pH 8,1 сверху. Фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
2. Создание серии концентраций соли: 0-1 M NaCl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон концентраций соли может быть скорректирован для каждого белка.
   1. Установите 24 x 50 мл маркированных центрифужных трубок в стойку
   2. Используя буферы, изготовленные выше, подготовьте 24 х 14 мл разбавлений NaCl в диапазоне от 0 до 1000 мкМ. Начните с добавления необходимых объемов 4 М NaCl 10 мМ Tris. Это может быть сделано с шагом 25 мМ или 50 мМ в зависимости от белка.
   3. Затем добавьте необходимые объемы 10 мМ Трис к каждой трубке. Переверяйте каждую трубку несколько раз, чтобы перемешать.
3. Подготовка образцов
   1. Получение образцов, которые должны быть очищены ионным обменом. При желании возьмите аликвоту 50 мкл для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы всегда должны храниться в холодном цвете; это могут быть лизаты, или, может быть, после Ni-NTA. Образцы из Ni-NTA в денатурных буферах требуют диализа или буферного обмена в буфере Tris 10 мМ. Образцы из Ni-NTA в нативных буферах могут быть разбавлены буфером Tris 10 мМ для снижения концентрации соли, чтобы белок мог связываться со смолой IEX.
   2. Отжимают образцы при 18 000 х г в течение 10 минут.
   3. Осторожно вылейте супернатант в весовую лодку. Не нарушайте гранулу.
   4. Осторожно возьмите супернатант в шприц 20 мл и прикрепите фильтр 0,22 мкм.
   5. Медленно выталкивайте супернатант через фильтр в свежую трубку объемом 50 мл.
   6. Если требуется разбавление, разбавляют супернатант с буфером Триса 10 мМ, сделанным выше (в этом эксперименте супернатант разбавляли 1 из 2). Тем временем хранить при 4 °C.
4. Подготовка установки вакуумной очистки и уравновешивания
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для очистки IEX одного образца используется только одна колонка. О множественных очистках см. в следующем разделе.
   1. Определите желаемый тип и объем смолы. Как правило, для получения до 20 мг частично чистых his-помеченных доменов SH3 используйте 0,4 мл смолы быстрого потока Q-сефарозы на столбец (см. шаг 2.4.8).
   2. Вставьте 24 открытых пустых столбца (пустых без фильтра внизу) в предварительно собранный MCPA. Колонны должны плотно прилегать к отверстиям уплотнительного коврика, которые были проколоты.
   3. Поместите шприц-поршень на 10 мл в каждую пустую колонну, кроме первой позиции, где начнется очистка.
   4. Протолкните дно открытой колонны (с фильтром) через резиновую прокладку плунжера шприца 5 мл (которая была пробита), чтобы сформировать резиновое кольцо на конце колонны. Это резиновое кольцо обеспечит хорошее уплотнение, когда эта колонна вставлена в каждую пустую колонну выше. На данный момент вставьте этот столбец в первый пустой столбец в MCPA.
   5. Возьмите открытую пластину сбора и поместите эту пластину в основание вакуумного коллектора и закройте ее верхней частью коллектора.
   6. Поместите собранный MCPA (с колоннами) поверх вакуумного коллектора.
   7. Прикрепите трубку из вакуумной насосной системы к входному отверстию/соплу в нижней части вакуума.
   8. Отрежьте синий наконечник пипетки ~ 2 см от дна и используйте, чтобы взять 800 мкл шариков Q-сефарозы (или любой другой ионообмонной смолы), гарантируя, что раствор этанола 50/50 50 смешивается, чтобы избежать наслоения. Пипетка 800 мкл в одну открытую колонну (с фильтром) в первом положении и как только шарики оседают на дно колонн, включают вакуум, достаточный для прохождения через 20% этанол.
   9. Вымойте колонну, содержащую бусины сефарозы, 2 х 2 мл 10 мМ Трис. Выключите вакуум непосредственно перед прохождением буфера Tris, чтобы предотвратить высыхание смолы. Бег можно отбросить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если смола использовалась ранее, регенерируете путем промывки в 5 объемах смолы 4 M NaCl, а затем 5 объемов смолы 10 мM Tris перед этапом 2.4.9.
5. Погрузка, мойка и элюирование
   1. Перенесите весь образец, который должен быть очищен (см. раздел 3), в колонну Q sepharose в первом положении, используйте небольшую пластиковую петлю для перемешивания образца и шариков в течение примерно ~ 2 минут перед включением вакуумного насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях избытка супернатанта (>12 мл) остерегайтесь переполнения колонны. Дайте образцу пройти, затем добавьте еще, смешивая, прежде чем снова пробежать.
   2. Сохраните/заморозьте прохождение для последующего анализа.
   3. Поместите еще одну открытую пластину сбора в вакуумный коллектор, а затем вымойте каждую колонну сефарозы 2 x 2 мл 10 мМ Tris и храните.
   4. Вставьте пластину для сбора 96 скважин, убедившись, что A1 находится в левом верхнем углу.
   5. Чтобы собрать первую фракцию элюирования, снимите плунжер шприца со следующей колонны, переместите столбец Q sepharose в это положение и поставьте плунжер шприца в предыдущее положение. Затем пипетка 1 мл первой концентрации соли в колонку Q сефарозы. Включите насос и соберите элюирование. Выключите насос так же, как жидкость выстилкивается рядом с бусинами, чтобы избежать высыхания бусин.
   6. Чтобы собрать следующую фракцию элюирования, извлеките плунжер шприца из следующей колонны, переместите столбец Q sepharose в это положение и поставьте плунжер шприца в предыдущее положение.
   7. Добавьте 1 мл следующей концентрации соли в колонку и повторяйте процесс до тех пор, пока не будут использованы все концентрации и не будет собрано 24 элюирования в 24 отдельных скважинах. Проверьте, не попала ли жидкость в соседние скважины.
   8. Промыть колонну 2 мл 4 М NaCl 10 мМ Трис. Пусть это пройдет.
   9. Промыть 2 мл 20% этанола. Дайте этанолу работать до тех пор, пока он не окажется чуть выше шариков и герметичной колонны для хранения.
   10. Храните 96 листов сбора скважин и анализируйте с помощью УФ-спектроскопии и SDS PAGE.

3. Ионный обмен - Одновременная очистка 24 различных белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о создании буферов, серии концентраций соли и подготовке проб см. на этапах 2.1-2.3.

1. Подготовка установки очистки
   ПРИМЕЧАНИЕ: То, как настроена система очистки, во многом зависит от того, сколько белков будет очищено и сколько солевых состояний будет использоваться. Для очистки 12 образцов максимум до 24 образцов одновременно требуется сборная пластина для каждой концентрации соли, используемой для элюирования. Для менее чем 12 образцов можно переместить хроматографические колонки на несколько позиций в пределах одного MCPA перед изменением коллекционных пластин. В этом случае нет необходимости размещать колонны в пустых колоннах и их можно непосредственно прикрепить к уплотнительному мату MCPA. Приведенный ниже протокол предназначен для 24 одновременных ионообмосных чисток.
   1. Поместите собранный MCPA непосредственно прикрепленным к 24 пустым колоннам с фильтрами поверх вакуумного коллектора, который содержит открытую коллекторную пластину, и подготовьте и промыте 24 ионообмных колонны, как в одном методе очистки выше. Для этой очистки удобно использовать ретранслятор Эппендорфа или шприц для быстрой пипетки в колонны.
2. Погрузка, мойка и элюирование
   1. Поместите 48-скважинную коллекторную пластину в основание вакуумного коллектора перед установкой MCPA (с прикрепленными промытыми очистными колоннами). Убедитесь, что A1 находится в левом верхнем углу.
   2. Пипетка каждого образца белка (до 5 мл за раз) в соответствующую колонку. Перемешайте каждую колонку, используя тонкую пластиковую петлю (по одной петле для каждой колонки, чтобы избежать загрязнения) в течение примерно 2 минут. Затем включите вакуумный насос и дайте супернатанту протекать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях избыточного супернатанта остерегайтесь переполнения колонн. Пусть образец пройдет через столбец, затем добавьте еще, смешивая, прежде чем снова пробежать.
   3. Храните/замораживает 48-скважинную коллекционную пластину для последующего анализа, так как она содержит проточную часть для каждого белка.
   4. Поместите еще одну 48-скважинную коллекторную пластину в вакуумный коллектор, а затем промыть каждую колонну сефарозы 2 x 2 мл 10 мМ Tris.
   5. Вставьте первую 96-скважинную коллекторную пластину в коллектор, убедив, что A1 находится в верхнем левом углу, а затем пипетку 1 мл первой концентрации соли в каждую колонну, а затем включите вакуумный насос, чтобы запустить его через колонны. Снимите пластину для сбора, накройте парапленкой и храните при 4 °C для анализа.
   6. Повторите шаг для каждой последующей концентрации соли, используемой для элюирования. Убедитесь, что для каждого элюляции используется новая пластина для сбора, а также что каждая пластина для сбора помечена и хранится.
   7. Промывайте каждую колонну 2 мл 10 мМ Tris, 4 М NaCl.
   8. Вымойте каждую колонку 2 мл 20% этанола. Дайте этанолу работать до тех пор, пока он не окажется чуть выше бусин и герметизных колонн для хранения.
   9. Храните 96 пластин для сбора скважин и анализируйте с помощью УФ-спектроскопии и SDS-PAGE.

Например, MCPA успешно очистил 14 мутантов AbpSH3 в условиях денатурирования с помощью Ni-NTA(рисунок 2A). Можно увидеть небольшое загрязняюще ~ 25 кДа, однако белок все еще в значительной степени чистый. Считается, что этим загрязнителем является YodA, общий совместно очищенный белок, обнаруженный в E. coli^11. На рисунке 2B показана очистка 11 различных доменов SH3 в нативных условиях. Мелкий загрязнитель, наблюдаемый в условиях денатурирования, удаляется в нативных условиях. Это показывает, что MCPA может быть использован для сравнения очищений, состоящих из нативных или денатурировающих буферов, как указано в таблице 1. 

Репрезентативные данные для очистки лизата через IEX MCPA показаны на рисунке 3. Это говорит о том, что AbpSH3 может быть отделен от большинства загрязняющих веществ, поскольку он элюируется позже от 425 мМ до 700 мМ. Концентрация соли, необходимая для элюирования белка из колонки, относится к силе электростатического взаимодействия между белком и смолой. Большинство бактериальных белков имеют низкий уровень пи; однако интересуя белок очень отрицательный и, по-видимому, имеет более низкий pI. Хорошие выходы значительно чистого белка AbpSH3 были восстановлены с некоторыми различными загрязняющими веществами с более высокой молекулярной массой AbpSH3, рассматриваемыми как полосы при ~ 5 кДа. Поэтому IEX через MCPA может быть использован в качестве первого шага в протоколе очистки, поскольку он может изолировать достаточное количество белка из присутствующих загрязняющих веществ в лизате.

Дальнейшая очистка IEX с использованием MCPA была успешно продемонстрирована на фракциях, элюированных из ni-NTA MCPA пробега(рисунок 4). Примечательно, что два основных пика были разрешены максимумами соли 400 и 700 мМ, что может соответствовать разделению N-концевой усеченной версии этого белка. Благодаря дальнейшему анализу данных DSF стало очевидно, что пик 1 был немного менее стабильным и имел немного более низкий T m по сравнению_с пиком 2. По сравнению с IEX-пробегом лизата, фракции в целом намного чище и показывают преимущество выполнения шага Ni-NTA перед IEX. Хотя существует небольшое загрязнение белками с более высокой молекулярной массой, фракции по-прежнему в значительной степени чисты и дают хорошие биофизические данные с использованием ЯМР и термических / химических анализов денатурации.

Рисунок 1:Вид прибора MCPA спереди. (A)Вид спереди прибора MCPA с прикрепленными 24 колонками. Колонны равномерно расположены внутри 96-колодезаметичного коврика, чтобы направить элюирование в пластину 96, 48 или открытую коллекцию. (B)Вид сверху уплотнительного мата.(C)Вид снизу того же уплотнительного мата.(D)Вид спереди MCPA с прикрепленными колоннами и шприцевыми плунжерами. Эта цифра была изменена по сравнению с Dominguez et al.^10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Пример конфигурации колонны 1 х 24, очистка различных мутантов SH3 в условиях денатурации и нативных условий. (A) Денатурировка очистки различных мутантов AbpSH3. Небольшое загрязнение может быть замечено ~ 25 кДа на каждой полосе. (B) Нативная очистка 11 различных доменов ДРОЖЖЕЙ SH3. Загрязняющие вещества были удалены с каждой полосы и больше не видны на геле. Эта цифра была изменена Dominguez et al.¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Очистка лисата с помощью IEX через MCPA. (A)Показания поглощения всех элюидов из ионообмена (IEX) измерялись с помощью пластины LVis (BMG). Показания строятся по соответствующей концентрации naCl элюирования. Пик с самой высокой концентрацией белка наблюдается при 700 мМ NaCl. (B) SDS-PAGE анализ элюций соли IEX, представленных в (A). Маркер молекулярной массы показан слева от геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Очистка пула VJM2 (после Ni-NTA) с использованием IEX через систему MCPA.

(A)Показания поглощения собранных элюидов из ионного обмена (IEX) измеряли с помощью NanoDrop. Показания строятся по соответствующей концентрации naCl элюирования. (B) SDS-PAGE анализ элюций соли IEX, представленных в (A). Маркер молекулярной массы показан слева от геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав буферов, денатурация Ni-NTA и нативные очистки и ионообменные буферы с низким и высоким содержанием соли.

Метод надежен и прост в использовании для относительно неопытных биохимиков белка, однако есть несколько соображений, которые следует иметь в виду.

Предостережение при переполнении коллекционных пластин

Сама коллекторная плита из 48 скважин вмещает только 5 мл на скважину, в то время как каждая 96-скважинная вмещает только 2 мл. Это необходимо иметь в виду при добавлении буфера и прохождении пробы через колонну, поскольку существует риск переполнения скважин. В частности, необходимо проявлять осторожность при переносе более крупных образцов в хроматографическую колонку для очистки. В тех случаях, когда имеется избыток супернатанта, разделите на части, достаточные для заполнения колонки, которую следует дать пробежать перед добавлением следующей части, чтобы предотвратить перелив и потерю образца. После каждого добавления супернатанта колонку следует смешать с небольшой пластиковой петлей, чтобы увеличить вероятность связывания белка с шариками, перед включением насоса. Чтобы отслеживать ориентацию плиты и, следовательно, содержание скважин, убедитесь, что маркированный угол «A1» всегда находится в верхнем левом углу пластины перед началом очистки.

Элюющий белок

При элюмируемости на ступени IEX и аффинности вакуум используется на самом низком уровне для протягивания буфера элюирования через колонну. Это ускоряет скорость потока по сравнению с гравитацией, хотя, если концентрация белка высока, это может привести к тому, что белковый раствор вспенится и потенциально детретирует. Если это так, альтернативой является использование шприцевого плунжера поверх открытого столбца, чтобы протолкнуть буфер через столбец. В этом случае шприц-плунжер следует осторожно (не сильно) протолкнуть вниз в колонну, чтобы протолкнуть жидкость через и в коллекционную пластину внизу. При снятии коллекторной пластины следует проявлять осторожность, чтобы любые капли элюирования, оставшиеся на MCPA, не разливаются в соседние колодцы, вызывая загрязнение.

Обслуживание смолы и колонн

Критическим шагом в этом протоколе является регенерация Смол и колонок Ni. Колонны должны быть регенерированы либо в начале, либо в конце протокола очистки. Если регенерация происходит в конце, смолу следует хранить в 20% этаноле при 4 °C. Колоночные фильтры хроматографии могут стать «заблокированными», в результате чего образец проходит через столбец с гораздо меньшей скоростью, чем должен. В этом случае колонны необходимо заменить или удалить фильтры и очистить, замочив в денатуривном буфере на ночь и промыв водой.

Как показано на этапе 3, разнообразие инструмента MCPA может быть использовано для очистки нескольких белков так же эффективно, как один образец. Протокол ионного обмена может быть адаптирован к потребностям эксперимента, адаптируясь к количеству различных образцов и количеству используемых концентраций соли. Например, если одновременно очищается менее 12 образцов, это будет включать в себя любую комбинацию перемещения колонн после каждого элюирования в пределах одной и той же пластины и/или замены сборных пластин для каждого элюирования. Если, например, только 4 белка очищались параллельно, колонны можно перемещать по одной пластине сбора для сбора элюций до 4 концентраций соли перед заменой пластин. MCPA способен очищаться с использованием различных смол - сродство и ионный обмен уже обсуждались, но гидрофобная хроматография взаимодействия также возможна и существует дополнительный потенциал для иммуноаффиновой хроматографии^12. Хотя этот метод был сосредоточен на нескольких мелкомасштабных очистках, MCPA можно использовать только для одной большой хроматографической колонки для очистки от нескольких литров бактериальной культуры, без необходимости в насосе для образцов или дорогостоящем FPLC.

Использование MCPA для высокопроизводительного ионного обмена, как обсуждалось, потребует нескольких, до 24, отдельных пластин сбора. Это может быть непрактично и потребовать много места на стандартной лабораторной столешнице и повышенного риска человеческой ошибки. Кроме того, измерение поглощения белка элюивами из 24 различных образцов может быть сложной задачей. В этой ситуации многоканальная пипетка была бы полезна и сделала бы передачу нескольких образцов быстрее и проще. Для небольших объемов рассмотрите возможность использования пластины LVis (BMG), содержащей 16 микрокадр, поскольку она позволяет измерять концентрации напрямую, без необходимости использования каких-либо других реагентов, таких как реагент Брэдфорда.

Хотя использование вакуумного насоса обеспечивает в 3 раза более быструю скорость очистки, чем та, которая достигается с помощью только гравитации^10,без ущерба для целостности смолы, это создает некоторые другие проблемы. Например, для поддержания прочности вакуума во время очистки требуется, чтобы все колонны были заблокированы шприцевым плунжером 10 мл, который необходимо вынуть перед вставкой колонны, упакованной смолой. Извлечение плунжеров один за другом также является своевременным процессом, и сопротивление вакуума может затруднить их извлечение из колонны.

Подробная информация о множественной очистке белка IEX с использованием MCPA приведена в протоколе. Этот метод с более высокой пропускной способностью эффективен по времени и контролируется, все параметры для каждой очистки могут управляться пользователем. Однако в большинстве лабораторий биохимии белка, включая промышленность, быстрая жидкостная хроматография белка является предпочтительным методом очистки белка, который превосходит с точки зрения пропускной способности, воспроизводимости и переноса метода и надежности. Эти системы, такие как Protein Maker by Protein Biosolutions и AKTA FPLC biomolecule purification system, могут с большим успехом облегчить проблему узкого места очистки. Несмотря на то, что эти системы получают превосходные результаты, разделение, которое мы видим с помощью системы MCPA, все еще достаточно хорошо для получения белка высокой чистоты. Интересно, что наша лаборатория также использует AKTA start FPLC для выполнения ионообметонной хроматографии, и хотя разрешение может быть выше с линейным градиентом, способным с этой машиной, значительно трудоемко запускать несколько образцов, и гораздо сложнее обучать неопытных студентов этой системе.

Существуют и другие значительно более дешевые альтернативы очистки на основе пластин. Например, GE Healthcare life sciences (теперь Cytiva) и Sigma Aldrich продают предварительно упакованные 96 фильтрующие пластины и картриджи со специфическими очистными смолами. Эти фильтрующие пластины обеспечивают мелкомасштабную высокопроизводительную очистку, но только очистку в диапазоне выхода микрограммов. Кроме того, QIAvac 24 Plus от QIAGEN использует спин-колонны под вакуумом, однако он непрактичен для сбора потока или промывки.

Гибкая конструкция MCPA обеспечивает параллельную очистку белка, хотя ручное перемещение колонн и пластин с использованием метода MCPA потенциально увеличивает человеческие ошибки по сравнению со стандартными системами FPLC. Тем не менее, ручная загрузка образцов на колонны более надежна для неопытных пользователей, чем загрузка образцов на колонны с использованием стандартных ФРЮК, где ошибки могут быть более легко допущены, поскольку это связано с переключением клапанов и насосов, что требует более обширной подготовки. Понятно, что полностью автоматизированные системы очистки белка лучше подходят, чем MCPA для групп очистки в промышленных и академических лабораториях, которые регулярно работают над очисткой. Тем не менее, для небольших лабораторий, которые не могут позволить себе дорогостоящее оборудование и содержание и хотят избежать обширного обучения или только изредка работать над очисткой белка, MCPA предлагает эффективную альтернативную систему, которая по-прежнему получает хорошее разделение и дешева и проста в настройке.

MCPA состоит из простых и недорогих приборов, которые позволяют сопряжению нескольких столбцов для одновременной параллельной очистки для получения миллиграммовых количеств белков. Кроме того, этот метод позволяет модульность отдельных колонн увеличивать пропускную способность. Это уникально для этого метода и не может быть достигнуто с использованием современных наборов очистки на основе пластин.

Очистка белка будет оставаться важной при изучении и характеристике белков и разработке терапевтических средств. Биофизические методы, такие как ЯМР и кристаллография белка, полагаются на миллиграммовые количества чистого белка, поэтому современные системы экспрессии и очистки нуждаются в дальнейшем развитии, чтобы улучшить стоимость и время достижения этих^2,13,14. Как уже говорилось, автоматизированные системы очистки имеют много преимуществ перед неавтоматизированными методами, однако они остаются слишком дорогостоящими для небольших лабораторий, требующих дорогостоящих приборов и обучения. MCPA значительно дешевле со стартовой стоимостью $45^10. Кроме того, этот MCPA не нуждается в обширном обучении или постоянном обслуживании, и если возникнут какие-либо проблемы, они могут быть легко решены. Коррозионные буферы, такие как денатурирующие буферы, используемые для Ni-NTA, могут разъедать системы очистки, если они не очищены должным образом. Однако гибкая конструкция MCPA позволяет при необходимости быстро очищать, ремонтировать и менять отсеки. В заключение, MCPA будет способствовать эффективной, высокопроизводительной очистке белка для небольших лабораторий до тех пор, пока не будут созданы более доступные автоматизированные системы^10.

Авторам нечего раскрывать.

Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны премией за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером гранта P20GM103451 и внутренним исследовательским грантом От Ливерпульского университета.