Un sistema di purificazione delle proteine ad alta produttività economico e versatile che utilizza un adattatore a piastre multi-colonna

Un adattatore a piastre multi-colonna consente di interfacciare le colonne cromatografiche con piastre di raccolta multi-pozzo per l'affinità parallela o la purificazione dello scambio ionico fornendo un metodo economico di purificazione delle proteine ad alta produttività. Può essere utilizzato sotto gravità o sottovuoto producendo quantità di milligrammo di proteine tramite strumentazione conveniente.

La purificazione proteica è imperativa per lo studio della struttura e della funzione proteica e di solito viene utilizzata in combinazione con tecniche biofisiche. È anche una componente chiave nello sviluppo di nuove terapie. L'era in evoluzione della proteomica funzionale sta alimentando la domanda di purificazione delle proteine ad alto contenuto di produzione e tecniche migliorate per facilitare questo. Si è ipotizzato che un adattatore a piastre multi colonna (MCPA) possa interfacciare più colonne cromatografiche di diverse resine con piastre multi-pozzo per la purificazione parallela. Questo metodo offre un metodo economico e versatile di purificazione proteica che può essere utilizzato sotto gravità o sottovuoto, rivaleggiando con la velocità di un sistema automatizzato. L'MCPA può essere utilizzato per recuperare le rese di milligrammo delle proteine con un metodo conveniente ed efficiente in termini di tempo per la successiva caratterizzazione e analisi. L'MCPA è stato utilizzato per la purificazione dell'affinità ad alta produttività dei domini SH3. Lo scambio ionico è stato dimostrato anche attraverso l'MCPA per purificare la cromatografia di affinità post proteina post Ni-NTA, indicando come questo sistema possa essere adattato ad altri tipi di purificazione. Grazie alla sua configurazione con più colonne, la personalizzazione individuale dei parametri può essere effettuata nella stessa purificazione, irraggiungibile dagli attuali metodi a base di piastre.

Le tecniche di purificazione delle proteine per ottenere quantità di milligrammi di proteine purificate sono imperative per la loro caratterizzazione e analisi, specialmente per metodi biofisici come nmr. La purificazione delle proteine è centrale anche in altre aree di studio come i processi di scoperta di farmaci e gli studi di interazione proteina-proteina; tuttavia, il raggiungimento di tali quantità di proteine pure può diventare un collo di bottiglia per queste^{tecniche 1,2,3}. Il metodo principale per la purificazione delle proteine è la cromatografia, che include una varietà di metodi che si basano sulle caratteristiche individuali delle proteine e sui loro tag. Nella cromatografia di affinità, le proteine hanno un motivo proteico o peptidico aggiuntivo che funziona come un tag che ha un'affinità per un certo substrato sulla resina cromatografica⁴. Il metodo di affinità più comune è la cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC) usando proteine con tag His, mentre un altro metodo popolare è la cromatografia a scambio ionico che separa le proteine in base alla loro carica. Per la massima purezza, una combinazione di cromatografia di affinità e scambio ionico viene spesso utilizzata insieme, di solito richiedendo costose attrezzature da laboratorio per un'elevata produttività.

L'era in evoluzione della proteomica funzionale sta alimentando la domanda di tecniche ad alta produttività per purificare proteine non singolari per analisi specifiche ma un gran numero di proteine contemporaneamente per analisi complete e studi a livello genomico⁵. La cromatografia ad affinità metallica immobilizzata (IMAC) è uno dei metodi più utilizzati per la purificazione delle proteine ad alto contenuto^{di produttività 6,7 ma}i suoi sistemi automatizzati sono costosi e inaccessibili per i laboratori più^{piccoli 8.} Le alternative più convenienti basate su lastre attualmente disponibili utilizzano l'uso di apparecchiature accessibili basate su laboratorio, come il vuoto. Sebbene questi metodi siano riusciti a migliorare la velocità di purificazione, possono ottenere solo una purificazione ad alta produttività su scala più piccola, producendo solo proteine nell'intervallo dei microgrammi. Queste limitazioni significano che le piastre di filtro precondizione da 96 pozzi (ad esempio, di GE Healthcare ora di proprietà di Cytiva) non possono essere utilizzate prima delle tecniche biofisiche⁹. La cromatografia a gravità è il metodo di purificazione più conveniente; tuttavia, l'impostazione di più colonne è scomoda e può essere soggetta a errori per più proteine.

Un adattatore a piastre multi colonna (MCPA) è stato sviluppato e dimostrato di eseguire con successo e convenientemente colonne di cromatografia di affinità parallela contemporaneamente per purificare i domini SH3 del lievito con tag His-tagged¹⁰. L'MCPA offre un metodo di purificazione ad alta produttività economico che non dipende da costose strumentazioni. Il suo design flessibile può purificare efficacemente milligrammi di proteine da più colonne cromatografiche di affinità sotto gravità o collettore sottovuoto. Inoltre, il tipo di resina, il volume e altri parametri possono essere regolati per ogni singola colonna per un'ottimizzazione più rapida. Questo studio dimostra che la cromatografia a scambio ionico da parte dell'MCPA può essere utilizzata in combinazione con la cromatografia di affinità dall'MCPA per migliorare la purificazione del dominio Abp1 SH3. Inoltre, fino a 24 proteine diverse possono essere separate in parallelo usando questi metodi.

1. Denaturazione della cromatografia Ni-NTA

1. Preparazione dei buffer
   NOTA: Vedere la tabella 1 per i dettagli di tutti i buffer.
   1. Compongono 500 mL di NaOH da 0,5 M, assicurandosi di aggiungere prima l'acqua Milli-Q e quindi aggiungendo lentamente il NaOH mentre il becher è su un agitatore. Filtrare utilizzando un filtro da 0,22 μm.
   2. Preparare 100 mL di solfato di nichel da 0,1 M e filtrare utilizzando un filtro da 0,22 μm.
   3. Preparare 50 mL di 2 M imidazolo e filtrare utilizzando un filtro da 0,22 μm.
   4. Preparare e 0,22 μm di filtro 1,5 L di tampone denaturante a pH 8,0 costituito da Tris-HCl da 5,3 mM, 4,7 mM Tris-base (Tris (idrossimetil)metilammina), 13,7 mM NaH₂PO₄, 86,3 mM Na₂HPO₄ e 6 M cloridrato di guanidina.
   5. Preparare e 0,22 μm di filtro 500 mL di soluzione tampone di lisi di 10 mM imidazolo sciolto in tampone denaturante (vedere 1.1.4) utilizzando il 2 M di scorte di imidazolo.
   6. Preparare e 0,22 μm di filtro 500 mL di soluzione tampone di lavaggio di 10 mM imidazolo sciolto in tampone denaturante (vedere 1.1.4) utilizzando il 2 M di scorte di imidazolo.
   7. Preparare e 0,22 μm di filtro 500 mL di tampone EDTA da 100 mM, regolare il pH a 8 utilizzando 1 M NaOH.
   8. Preparare e 0,22 μm di filtro 500 mL di tampone di eluizione costituito da 7 mL di acido acetico glaciale al 99% in cloridrato di guanidina da 6 M.
      NOTA: se si utilizzano buffer nativi, adattarsi in base alla tabella 1.
2. Cellule di lysing (metodo di denaturazione)
   1. Aggiungere 2 mL di tampone di lysis a ogni 1 g di pellet di cellule E. coli raccolti che contengono la proteina is-taggata sovrascritta. Vortice per diversi minuti fino a quando le celle non vengono ri-sospese. Lasciare i campioni su un rocker per 30 minuti a 4 °C.
   2. Pellet centrifugati a 18.000 x g per 30 minuti. Tenere da parte 50 μL nel congelatore a -20 °C per analizzare in seguito un gel SDS-PAGE.
   3. Versare con cura i supernatanti assicurandosi che il pellet non sia disturbato. I lire dovrebbero essere di colore chiaro e giallo chiaro. Se i llysates sono nuvolosi, centrifugare di nuovo il campione; prendere in considerazione la sonicazione se disponibile per degradare l'acido nucleico.
   4. Filtrare i supernatanti attraverso una colonna vuota (senza resina ma con filtro) e raccogliere in un vassoio di raccolta aperto. Quindi trasferire in un tubo per l'uso nel passaggio 1.3.
      NOTA: Se si utilizzano i tamponi nativi, dopo il passaggio 1.2.1, trattare i campioni a 3 cicli di congelamento/disgelo a -80 °C o elaborare per sonicazione o French Press per liscire le cellule.
3. Preparazione della configurazione della purificazione sottovuoto e colonne equilibbranti
   NOTA: Vedi Figura 1 per un MCPA impostato con 24 colonne.
   1. Determinare il numero di colonne necessarie, nonché il tipo e il volume di resina desiderati. Come regola generale per 100 mL di coltura di autoinduzione (~2 g di pellet) che esprimono domini SH3 con tag His-tagged utilizzando plasmidi a base di T7, utilizzare 0,6 mL di resina Ni-NTA per colonna per produrre circa 3 mg di proteine da circa 6 mL di lisato.
   2. Inserire il numero desiderato di colonne da 12 mL (senza resina ma con filtro) in un MCPA preassemblato (piastra a goccia lunga con tappetino di tenuta perforato). Le colonne dovrebbero adattarsi perfettamente ai fori del tappetino di tenuta che sono stati perforati.
   3. Se si utilizza meno di 24 colonne, chiudere i fori vuoti con una colonna chiusa vuota.
   4. Prendi una piastra di raccolta aperta e metti questa piastra nella base del collettore sottovuoto e chiudi con la parte superiore del collettore.
   5. Posizionare l'MCPA assemblato con colonne sopra il collettore a vuoto.
   6. Collegare i tubi da un sistema di pompa per vuoto all'ingresso/ugello nella parte inferiore del collettore sottovuoto.
   7. Assicurarsi che le perline Ni-NTA siano in una soluzione al 50% con 20% di etanolo. Prima di fare qualsiasi cosa con le perline agitare /mescolare delicatamente la soluzione di perline / etanolo per rimorsi uniformemente. Quindi, utilizzando una pipetta da 5 mL, pipettare 1,2 mL della soluzione al 50% nelle colonne. Durante la pipettazione assicurarsi che le perline rimangano completamente miste.
   8. Dopo aver condutto in tutte le 24 colonne, accendere la pompa per vuoto ed eseguire l'etanolo al 20% attraverso la colonna e nella piastra di raccolta sottostante.
   9. Spegnere la pompa una volta che tutto il 20% di etanolo ha attraversato tutte le colonne (la resina Ni-NTA può tollerare una breve asciugatura se il vuoto viene ancora applicato dopo che il tampone è passato attraverso la colonna). Smaltire ciò che è nella piastra di raccolta aperta in una scatola di rifiuti.
      ATTENZIONE: Tutti i prodotti di scarto delle perle Ni-NTA sono pericolosi, quando si maneggiano le perline o si smaltivano i rifiuti, si indossano guanti, occhiali e altri DPI. Inoltre, smaltire tutti i rifiuti di solfato di nichel in un contenitore separato per lo smaltimento individuale in un secondo momento.
      NOTA: Se la resina è nuova o rigenerata di recente, il resto di questi passaggi può essere ignorato, passare alla sezione successiva.
   10. Aggiungere 3 volumi di resina (1,8 ml) di tampone EDTA da 100 mM utilizzando una siringa da 20 ml o un dispositivo di siringa ripetitore con una siringa da 50 ml. Quindi accendere la pompa del vuoto per lasciare che il tampone EDTA si lavi e spegnere la pompa una volta lavata.
       NOTA: Questo lavaggio dovrebbe rimuovere il colore blu nichel, ma se questo non è il caso, ripetere questo passaggio fino a quando tutte le colonne non hanno perso il loro colore blu. Spegnere la pompa e versare il contenuto della piastra di raccolta aperta nella scatola dei rifiuti.
   11. Aggiungere 3 volumi di resina (1,8 mL) di tampone NaOH da 0,5 M in ogni colonna prima di accendere la pompa e farlo scorrere attraverso ogni colonna. Piatto di raccolta vuoto.
   12. Aggiungere in ogni colonna 4 volumi di resina (2,4 mL) di solfato di nichel da 100 mM. Accendere la pompa per vuoto ed eseguire nuovamente questa attraverso la colonna.
   13. Aggiungere 10 volumi di resina (~6000 μL) di acqua Milli-Q e farlo scorrere attraverso le colonne. Spegnere la pompa e versare il contenuto della piastra di raccolta nella scatola dei rifiuti.
   14. Lavare le colonne due volte con 4 volumi di resina (2,4 mL) di imidazolo da 10 mM in tampone di lavaggio (denaturante o nativo) ogni volta per rimuovere eventuali eccessi di nichel ed equilibrati. Piatto di raccolta vuoto.
       NOTA: Se alcune colonne funzionano in modo significativamente più lento, staccare la colonna e controllare che l'aria possa essere spinta attraverso l'MCPA utilizzando una siringa di grandi dimensioni. Se questo viene sbloccato, utilizzare una colonna diversa con un nuovo filtro.
   15. Se più campioni/proteine diversi verranno purificati sull'MCPA, sostituire la piastra di raccolta aperta con una piastra di raccolta 48 x (5 mL / pozza). Tuttavia, quando si eseguono solo gli stessi campioni proteici su ogni colonna, va bene continuare a utilizzare una piastra di raccolta aperta.
4. Carico, lavaggio ed eluizione
   1. Con lo spegnimento sottovuoto, il carico si liscizza in colonne (la quantità di lisato varierà, in genere da 1 a 12 mL o più e potrebbe essere necessario caricarlo in più lotti). Utilizzare un sottile agitatore di plastica per mescolare delicatamente le perline e il lisato nella colonna per massimizzare il legame.
   2. Dopo aver miscelato delicatamente ogni colonna per alcuni minuti, accendere la pompa del vuoto ed eseguire i lire attraverso le colonne. Se vengono eseguiti più campioni di proteine, utilizzare una piastra di raccolta di 48 pozzi e assicurarsi di sostituire la piastra di raccolta con un'altra piastra di 48 po 'dopo che 4 mL sono attraversati poiché i pozzi in queste piastre possono contenere solo 4 mL di soluzione. Continuare a eseguire il lysate fino a quando tutti i lysates non sono stati eseguiti attraverso una colonna. Congelare le lastre di raccolta che contengono il flusso.
      NOTA: le colonne potrebbero diventare "bloccate" causando il flusso del lisato attraverso la colonna molto più lentamente del dovuto. Questo è facilmente individuabile poiché le colonne vicine scorreranno a una velocità normale. In tal caso, si raccomanda di trasferire la miscela lisato/resina in una colonna contenente un filtro fresco.
   3. Sostituire la piastra di raccolta con una piastra di raccolta aperta vuota, quindi aggiungere 9 volumi di resina (5,4 mL) di tampone di lavaggio imidazolo da 10 mM a ogni colonna e accendere il vuoto ed eseguire il lavaggio. Ripeti questo 4-5 volte. Per evitare lo straripamento, svuotare periodicamente la piastra di scarto.
      1. Quindi sostituire la piastra di raccolta con una piastra appropriata pulita (piastra aperta per una sola proteina e 96 bene se ci sono più proteine, assicurando che A1 si trova nell'angolo in alto a sinistra).
   4. Utilizzando una siringa ripetitore con una siringa da 12,5 ml, pipetta ~1 volume di resina (0,75 ml) di tampone di eluizione denaturante in ogni colonna.
   5. Per evitare la schiuma proteica, accendere la pompa per vuoto all'impostazione più bassa. Sollevare delicatamente l'MCPA per controllare che non sia rimasto nulla da gocciolare nella piastra di raccolta.
      NOTA: Un'alternativa all'eluizione con il vuoto o la gravità è spingere uno stantuffo per siringhe da 10 ml nella parte superiore della colonna per spingere delicatamente il tampone di eluizione attraverso la colonna. Eseguire questa attività per ogni colonna, facendo attenzione quando si rimuove lo stantuffo della siringa per non disturbare le perline nella parte inferiore della colonna. Una volta che il tampone di eluizione è stato spinto attraverso, rimuovere delicatamente lo stantuffo della siringa dall'ultima colonna in cui è stato utilizzato e accendere brevemente la pompa del vuoto per rimuovere le ultime gocce dalle colonne.
      1. Se è stata utilizzata una piastra di raccolta da 96 poggiapolsi, controllare la piastra di raccolta per assicurarsi che ciò che scorre da ogni colonna attraverso la lunga piastra a goccia fluirà solo in un pozzo e nulla si eluizza nei pozzi vicini sulla piastra di raccolta.
   6. Per la successiva eluizione ripetere i 2 passaggi precedenti e raccogliere in un nuovo multi-pozzo (campioni diversi) o piastra di raccolta aperta (stessi campioni).
   7. Passo facoltativo, prendere un'aliquota di 50 μL di ogni eluizione per l'analisi della purezza e della concentrazione.
   8. Aggiungere 2 mL di 20% di etanolo a ogni colonna ed eseguire questo attraverso l'utilizzo della pompa per vuoto. Quindi aggiungere altri 2 ml di etanolo al 20% alle colonne e utilizzare un agitatore di plastica sottile fresco per mescolare il 20% di etanolo e le perline prima di trasferirlo in un tubo da 50 ml per lo stoccaggio a 4 °C. Pulire le colonne e verificare che l'acqua fluisca liberamente attraverso ogni colonna e quindi pulire tutto e riporlo per un uso successivo.
      NOTA: alcune colonne alla fine avranno i loro filtri bloccati e verranno eseguiti troppo lentamente, queste colonne dovrebbero essere sostituite o i filtri puliti. Come tale, si consiglia di testare periodicamente i filtri rimuovendo la resina e riempiendo la colonna di acqua per vedere se scorre rapidamente. I filtri possono essere puliti lasciando una colonna chiusa piena di tampone di eluizione denaturante e tremando durante la notte.

2. Scambio ionica - Purificazione di proteine singole

1. Preparazione dei buffer
   NOTA: Vedere la tabella 1 per i dettagli di tutti i buffer
   1. Preparare un tampone di sale basso da 2 L: 10 mM Tris pH 8.1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Soluzione filtrante con filtro da 0,22 μm.
   2. Preparare un tampone di sale alto 0,5 L: 10 mM Tris pH 8.1, 4 M NaCl. Misurare 116,9 g di NaCl e raggiungere 0,5 L con il pH Tris da 10 mM 8.1 dall'alto. Soluzione filtrante con filtro da 0,22 μm.
2. Produzione serie di concentrazione di sale: 0-1 M NaCl.
   NOTA: L'intervallo di concentrazioni di sale può essere regolato per ogni proteina.
   1. Installazione di tubi di centrifuga etichettati da 24 x 50 mL in un rack
   2. Utilizzando i tamponi sopra effettuati, preparare diluizioni NaCl da 24 x 14 mL che vanno da 0 a 1000 μM. Iniziare aggiungendo i volumi richiesti di 4 M NaCl 10 mM Tris. Questo potrebbe essere fatto con incrementi di 25 mM o 50 mM a seconda delle proteine.
   3. Quindi aggiungere i volumi richiesti di Tris da 10 mM a ciascun tubo. Invertire ogni tubo più volte per mescolare.
3. Preparazione dei campioni
   1. Ottenere i campioni da purificare mediante scambio ionici. Facoltativamente, prendere un'aliquota di 50 μL per l'analisi in un secondo momento.
      NOTA: I campioni devono essere sempre tenuti freddi; questi possono essere lysati, o forse post Ni-NTA. I campioni di Ni-NTA nei buffer di denaturazione richiedono l'analisi o lo scambio tampone in buffer Tris da 10 mM. I campioni di Ni-NTA nei tamponi nativi potrebbero essere diluiti con tampone Tris da 10 mM per ridurre la concentrazione di sale in modo che la proteina possa legarsi alla resina IEX.
   2. Campioni di spin a 18.000 x g per 10 minuti.
   3. Versare con cura il supernatante in una barca di pesare. Evitare di disturbare il pellet.
   4. Prendere il supernatante con attenzione in una siringa da 20 ml e attaccare un filtro da 0,22 μm.
   5. Espellere lentamente il supernatante attraverso il filtro in un tubo fresco da 50 ml.
   6. Se è necessaria la diluizione, diluire il supernatante con tampone Tris da 10 mM fatto sopra (In questo esperimento il supernatante è stato diluito 1 su 2). Conservare a 4 °C nel frattempo.
4. Preparazione della configurazione di purificazione sottovuoto e configurazione dell'equilibrazione
   NOTA: In questo protocollo, viene utilizzata una sola colonna per la purificazione IEX di un campione. Per più purificazioni, vedere la sezione successiva.
   1. Determinare il tipo e il volume di resina desiderati. Come regola generale per un massimo di 20 mg di domini SH3 parzialmente puri, utilizzare 0,4 mL di resina a flusso rapido Q-sefarose per colonna (vedere il passaggio 2.4.8).
   2. Inserire 24 colonne vuote aperte (vuote senza filtro in basso) in un MCPA preassemblato. Le colonne dovrebbero adattarsi perfettamente ai fori del tappetino di tenuta che sono stati perforati.
   3. Posizionare uno stantuffo per siringhe da 10 ml in ogni colonna vuota tranne la prima posizione, da cui inizierà la purificazione.
   4. Spingere la parte inferiore di una colonna aperta (con filtro) attraverso una guarnizione in gomma stantuffo a siringa da 5 ml (che è stata perforata) per formare un anello di gomma all'estremità della colonna. Questo anello di gomma garantirà una buona tenuta quando questa colonna viene inserita in ogni colonna vuota sopra. Per il momento, inserire questa colonna nella prima colonna vuota dell'MCPA.
   5. Prendi una piastra di raccolta aperta e metti questa piastra nella base del collettore sottovuoto e chiudi con la parte superiore del collettore.
   6. Posizionare l'MCPA assemblato (con colonne) sopra il collettore a vuoto.
   7. Collegare i tubi di un sistema di pompa per vuoto all'ingresso/ugello nella parte inferiore del vuoto.
   8. Tagliare una punta di pipetta blu ~ 2 cm dal fondo e utilizzare per assumere 800 μL di perline Q-sefarose (o qualsiasi altra resina scambiatrice di ioni), assicurando che la soluzione di etanolo di perline 50/50 sia mescolata per evitare la stratificazione. Pipetta 800 μL in una colonna aperta (con filtro) in prima posizione e una volta che le perline si depositano sul fondo delle colonne accendere il vuoto abbastanza da passare attraverso il 20% di etanolo.
   9. Lavare la colonna contenente perline di sefarose con 2 x 2 mL di Tris da 10 mM. Spegnere il vuoto poco prima che il tampone Tris si esaurisa per evitare che la resina si asciughi. Il run off può essere scartato.
      NOTA: Se la resina è stata utilizzata in precedenza, rigenerare lavandosi in 5 volumi di resina da 4 M NaCl e quindi 5 volumi di resina di 10 mM Tris prima del passo 2.4.9.
5. Carico, lavaggio ed eluizione
   1. Trasferire tutto il campione da purificare (vedere sezione 3) alla colonna Q di sefarose in prima posizione, utilizzare un piccolo anello di plastica per mescolare campioni e perline per circa ~2 minuti prima di accendere la pompa per vuoto.
      NOTA: In caso di sovranatante (>12 mL), attenzione al riempimento eccessivo della colonna. Lasciare scorrere il campione e aggiungerne altri, mescolando prima di lasciarlo scorrere di nuovo.
   2. Archiviare/bloccare il flusso per l'analisi in un secondo momento.
   3. Posizionare un'altra piastra di raccolta aperta nel collettore sottovuoto, quindi lavare ogni colonna di sefarose con 2 x 2 mL di Tris da 10 mM e conservare.
   4. Inserire una piastra di raccolta di 96 po po' di raccolta, assicurandosi che A1 si trova nell'angolo in alto a sinistra.
   5. Per raccogliere la prima frazione di eluizione, rimuovere lo stantuffo della siringa dalla colonna successiva lungo, spostare la colonna di sefarose Q in questa posizione e mettere lo stantuffo della siringa nella posizione precedente. Quindi pipetta 1 mL della prima concentrazione di sale nella colonna di sefarose Q. Accendere la pompa e raccogliere l'eluizione. Spegnere la pompa proprio come le linee liquide vicino alle perline per evitare di asciugare le perline.
   6. Per raccogliere la frazione di eluizione successiva, rimuovere lo stantuffo della siringa dalla colonna successiva lungo, spostare la colonna di sefarose Q in questa posizione e mettere lo stantuffo della siringa nella posizione precedente.
   7. Aggiungere 1 mL della successiva concentrazione di sale alla colonna e ripetere il processo fino a quando non sono state utilizzate tutte le concentrazioni e sono state raccolte 24 eluizioni in 24 pozzi separati. Controllare che nessun liquido sia entrato in pozzi vicini.
   8. Lavare la colonna con 2 mL di 4 M NaCl 10 mM Tris. Lascia che tutto questo si esaurisa.
   9. Lavare con 2 mL di 20% di etanolo. Lasciare correre l'etanolo fino a quando non è appena sopra le perline e la colonna di tenuta per la conservazione.
   10. Conservare 96 piastre di raccolta dei pozzi e analizzarle tramite spettroscopia UV e SDS PAGE.

3. Scambio ionici - Purificazione simultanea di 24 proteine diverse

NOTA: Vedere i passaggi 2.1-2.3 per informazioni dettagliate sulla produzione di tamponi, una serie di concentrazioni di sale e la preparazione di campioni

1. Preparazione dell'impostazione di purificazione
   NOTA: Il modo in cui viene istituito il sistema di purificazione dipende in larga misura dal numero di proteine purificate e dal numero di condizioni di sale che verranno utilizzate. Per purificare 12 campioni fino al massimo di 24 campioni contemporaneamente, è necessaria una piastra di raccolta per ogni concentrazione di sale utilizzata per elutare. Per meno di 12 campioni, è possibile spostare le colonne cromatografiche alcune posizioni all'interno dello stesso MCPA prima di cambiare le piastre di raccolta. In questo caso, non è necessario posizionare le colonne in colonne vuote e possono essere direttamente attaccate al tappetino di tenuta MCPA. Il protocollo che segue è per 24 purificazione simultanea dello scambio ionici.
   1. Posizionare l'MCPA assemblato direttamente attaccato a 24 colonne vuote con filtri sopra il collettore sottovuoto che contiene una piastra di raccolta aperta e preparare e lavare 24 colonne di scambio ionico come nel singolo metodo di purificazione sopra. Per questa purificazione, è conveniente utilizzare un ripetitore O una siringa Eppendorf per pipettare rapidamente in colonne.
2. Carico, lavaggio ed eluizione
   1. Posizionare una piastra di raccolta di 48 pompaggio nella base del collettore sottovuoto prima di montare l'MCPA (con le colonne di purificazione lavate attaccate). Assicurarsi che A1 si trova nell'angolo in alto a sinistra.
   2. Pipettare ogni campione proteico (fino a 5 mL alla volta) nella colonna corrispondente. Mescolare ogni colonna utilizzando un sottile anello di plastica (un anello per ogni colonna per evitare la contaminazione) per circa 2 minuti. Quindi accendere la pompa per vuoto e lasciare fluire il supernatante.
      NOTA: In caso di sovranatante, fai attenzione al riempimento eccessivo delle colonne. Lasciare che il campione attraverso la sua colonna, quindi aggiungerne altri, mescolando prima di lasciare scorrere di nuovo.
   3. Conservare/congelare la piastra di raccolta da 48 pozzi per un'analisi successiva in quanto contiene il flusso per ogni proteina.
   4. Posizionare un'altra piastra di raccolta di 48 pomp pompaggio nel collettore sottovuoto, quindi lavare ogni colonna di sefarose con 2 x 2 mL di Tris da 10 mM.
   5. Inserire la prima piastra di raccolta da 96 pomp pompati nel collettore, assicurandosi che A1 si trova nell'angolo in alto a sinistra e quindi pipettare 1 mL della prima concentrazione di sale in ogni colonna e quindi accendere la pompa del vuoto per far scorrere questo attraverso le colonne. Rimuovere la piastra di raccolta, coprire con parafilm e conservare a 4 °C per l'analisi.
   6. Passo di ripetizione per ogni successiva concentrazione di sale utilizzata per elute. Assicurarsi che per ogni eluizione sia utilizzata una nuova piastra di raccolta e che ogni lastra di raccolta sia etichettata e conservata.
   7. Lavare ogni colonna con 2 mL di Tris da 10 mM, 4 M NaCl.
   8. Lavare ogni colonna con 2 mL di 20% di etanolo. Lasciare correre l'etanolo fino a quando non è appena sopra le perline e sigillare le colonne per la conservazione.
   9. Conservare 96 piastre di raccolta dei pozzi e analizzarle tramite spettroscopia UV e SDS-PAGE.

Ad esempio, l'MCPA ha purificato con successo 14 mutanti AbpSH3 in condizioni di denaturazione tramite Ni-NTA (Figura 2A). Si può vedere un piccolo contaminante ~ 25 kDa, tuttavia la proteina è ancora in gran parte pura. Si ritiene che questo contaminante sia YodA, una proteina co-purificata comune trovata in E. coli¹¹. La figura 2B mostra la purificazione di 11 diversi domini SH3 in condizioni native. Il piccolo contaminante visto in condizioni di denaturazione viene rimosso in condizioni native. Ciò dimostra che l'MCPA può essere utilizzato per il confronto di purificazione composte da tamponi autoctoni o denaturanti elencati nella tabella 1. 

I dati rappresentativi per la purificazione di un lisato tramite IEX MCPA sono riportati nella figura 3. Ciò suggerisce che AbpSH3 può essere separato dalla maggior parte dei contaminanti in quanto eluisce in seguito tra 425 mM e 700 mM. La concentrazione di sale necessaria per eluirsi dalla colonna si riferisce alla forza dell'interazione elettrostatica tra la proteina e la resina. La maggior parte delle proteine batteriche ha bassi ibi; tuttavia la proteina di interesse è molto negativa e sembra avere un pI inferiore. Buone rese di proteine AbpSH3 considerevolmente pure sono state recuperate con alcuni vari contaminanti ad alto peso molecolare AbpSH3 visti come bande a ~ 5 kDa. IEX via MCPA può quindi essere utilizzato come primo passo di un protocollo di purificazione in quanto può isolare quantità sufficienti di proteine dagli attuali contaminanti in un lisato.

Un'ulteriore purificazione da parte di IEX mediante MCPA è stata dimostrata con successo su frazioni eluizzate da una corsa MCPA Ni-NTA (Figura 4). Notevolmente, due picchi principali sono stati risolti con massimi a 400 e 700 mM di sale, che possono corrispondere alla separazione di una versione troncata N-terminale di questa proteina. Attraverso ulteriori analisi dei dati DSF è stato reso evidente che il picco 1 era leggermente meno stabile e aveva un T_{m leggermente inferiore} rispetto al picco 2. Rispetto alla corsa IEX del lisato, le frazioni in generale sono molto più pulite e mostrano il vantaggio di eseguire un passaggio Ni-NTA prima di IEX. Sebbene vi sia una leggera contaminazione con proteine di peso molecolare più elevato, le frazioni sono ancora in gran parte pure e hanno prodotto buoni dati biofisici utilizzando NMR e saggi di denaturazione termica / chimica.

Figura 1: Una visione d'anticipo dello strumento MCPA. (A) Vista frontale dello strumento MCPA con 24 colonne attaccate. Le colonne sono distanziate uniformemente all'interno del tappetino di tenuta del pozzo 96 per guidare le eluizioni in una piastra da collezione aperta 96, 48 o aperta. (B) Vista dall'altodel tappetino di tenuta. Questa cifra è stata modificata da Dominguez et^al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio di configurazione a colonna 1 x 24, purificazione di vari mutanti SH3 in condizioni denaturanti e native. (A) Denaturazione della purificazione di vari mutanti AbpSH3. Una leggera contaminazione può essere individuata di ~ 25 kDa su ogni corsia. (B) Purificazione nativa di 11 diversi domini SH3 di lievito. I contaminanti sono stati rimossi da ogni corsia e non più visibili sul gel. Questa cifra è stata modificata Dominguez et^al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Purificazione del lisato mediante IEX tramite MCPA. (A) Le letture di assorbanza di tutte le eluizioni dello scambio ionico (IEX) sono state misurate da una piastra LVis (BMG). Le letture sono tracciate rispetto alla corrispondente concentrazione nacl dell'eluizione. Il picco con la più alta concentrazione proteica è visto a 700 mM NaCl. (B) Analisi SDS-PAGE delle eluizioni saline IEX presentate nella letteraA. Il marcatore di peso molecolare è mostrato a sinistra del gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Purificazione del pool VJM2 (post Ni-NTA) mediante IEX tramite sistema MCPA.

(A) Le letture di assorbanza delle eluizioni raccolte dallo scambio ionico (IEX) sono state misurate utilizzando un NanoDrop. Le letture sono tracciate rispetto alla corrispondente concentrazione nacl dell'eluizione. (B) Analisi SDS-PAGE delle eluizioni saline IEX presentate nella letteraA. Il marcatore di peso molecolare è mostrato a sinistra del gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione dei tamponi, denaturazione ni-NTA e depurazione nativa e scambio ionica tamponi di sale bassi e alti.

Il metodo è robusto e semplice da usare per biochimici delle proteine relativamente inesperti, tuttavia ci sono alcune considerazioni da tenere a mente.

Attenzione alle piastre di raccolta di riempimento eccessivo

La piastra di raccolta da 48 porcile stessa contiene solo 5 mL per pozzo, mentre ogni 96 po 'contiene solo 2 mL. Questo deve essere tenuto a mente quando si aggiunge buffer ed esegue il campione attraverso la colonna in quanto vi è il rischio di riempire espiacciare i pozzi. In particolare, occorre prestare attenzione quando si trasferiscono i campioni più grandi alla colonna cromatografica per la purificazione. Nei casi in cui vi sia un sovranatante in eccesso, dividere in parti, sufficiente per riempire la colonna, che dovrebbe essere permesso di passare prima di aggiungere la parte successiva per evitare qualsiasi riempimento eccessivo e perdita di campione. Dopo ogni aggiunta di supernatante, la colonna deve essere mescolata con un piccolo anello di plastica, per aumentare la probabilità che le proteine si attacchino alle perline, prima di accendere la pompa. Per tenere traccia dell'orientamento della piastra e quindi del contenuto dei pozzali, assicurarsi che l'angolo etichettato 'A1' sia sempre nell'angolo in alto a sinistra della piastra prima di iniziare la purificazione.

Proteina eluitante

Quando si eluizza nel passaggio IEX e affinità, il vuoto viene utilizzato sull'impostazione più bassa per estrarre il buffer di eluizione attraverso la colonna. Ciò accelera la portata rispetto alla gravità anche se se la concentrazione proteica è alta, può portare alla soluzione proteica per schiumare e potenzialmente denaturare. In tal caso, un'alternativa è utilizzare uno stantuffo per siringhe sopra la colonna aperta per spingere il buffer attraverso la colonna. In questo caso, lo stantuffo della siringa deve essere spinto delicatamente (non con forza) verso il basso nella colonna per spingere il liquido attraverso e nella piastra di raccolta sottostante. Prestare attenzione quando si rimuove la piastra di raccolta per assicurarsi che eventuali gocce di eluizione rimanenti sull'MCPA non si riversino nei pozzi vicini, causando contaminazione.

Manutenzione di resina e colonne

Un passo critico in questo protocollo è la rigenerazione delle resine e delle colonne Ni. Le colonne devono essere rigenerate all'inizio o alla fine del protocollo di purificazione. Se la rigenerazione avviene alla fine, la resina deve essere conservata in 20% di etanolo a 4 °C. I filtri a colonna cromatografica possono diventare "bloccati" causando il flusso del campione attraverso la colonna a una velocità molto più lenta di quanto dovrebbe. In tal caso, le colonne devono essere sostituite o i filtri rimossi e puliti immergendosi nel tampone di denaturazione durante la notte e risciacquando con acqua.

Come dimostrato al passaggio 3, la diversità dello strumento MCPA può essere sfruttata per la purificazione di più proteine con la stessa efficacia di un singolo campione. Il protocollo di scambio ionici può essere adattato alle esigenze dell'esperimento, adattandosi al numero di campioni diversi e al numero di concentrazioni di sale utilizzate. Ad esempio, se meno di 12 campioni vengono purificati simultaneamente, ciò implicherebbe qualsiasi combinazione di spostamento delle colonne dopo ogni eluizione all'interno della stessa piastra e/o scambio di piastre di raccolta per ogni eluizione. Se ad esempio, solo 4 proteine venivano purificate in parallelo, le colonne possono essere spostate su una piastra di raccolta per raccogliere eluizioni fino a 4 concentrazioni di sale prima di cambiare le piastre. MCPA è in grado di purificazione utilizzando varie resine - affinità e scambio ionico sono già stati discussi, ma è anche possibile la cromatografia di interazione idrofobica e vi è un ulteriore potenziale di cromatografia immunoaffinit๲. Sebbene questo metodo si sia concentrato su più purificazione su piccola scala, l'MCPA può essere utilizzato per una sola colonna cromatografica di grandi dimensioni per la purificazione da diversi litri di coltura batterica, senza la necessità di una pompa campione o di un costoso FPLC.

L'uso dell'MCPA per lo scambio ionica ad alta produttività come discusso richiederebbe più, fino a 24, piastre di raccolta differenziata. Questo potrebbe essere poco pratico e richiedere molto spazio su un banco di laboratorio standard e un aumento del rischio di errore umano. Inoltre, misurare l'assorbanza proteica delle eluizioni da 24 campioni diversi può essere impegnativo. In questa situazione una pipetta multicanale sarebbe vantaggiosa e consentirebbe il trasferimento di più campioni più rapidamente e più facilmente. Per piccoli volumi, prendere in considerazione l'utilizzo di una piastra LVis (BMG) contenente 16 microdrop in quanto consente di misurare direttamente le concentrazioni, senza la necessità di utilizzare altri reagenti come il reagente del saggio bradford.

Mentre l'uso di una pompa per vuoto consente una velocità di purificazione 3 volte più veloce di quella raggiunta^{utilizzando solo gravità 10}, senza compromettere l'integrità della resina, crea alcuni altri problemi. Mantenere la resistenza del vuoto durante la purificazione, ad esempio, richiede che tutte le colonne siano bloccate con uno stantuffo per siringhe da 10 ml che deve essere tolto prima di inserire la colonna imballata con resina. Estogliare i pistoni uno per uno è anche un processo tempestivo e la resistenza del vuoto può renderli difficili da rimuovere dalla colonna.

I dettagli di una purificazione IEX a più proteine utilizzando l'MCPA sono forniti nel protocollo. Questo metodo a velocità effettiva più elevata è efficiente in termini di tempo e controllabile, tutti i parametri per ogni purificazione possono essere manipolati dall'utente. Tuttavia, nella maggior parte dei laboratori di biochimica proteica, compresa l'industria, la cromatografia liquida proteica veloce è il metodo preferito per la purificazione delle proteine, che è superiore in termini di produttività, riproducibilità e trasferimento di metodi e robustezza. Questi sistemi come protein Maker by Protein Biosolutions e il sistema di purificazione biomolecolare AKTA FPLC possono alleviare con grande successo il problema del collo di bottiglia della purificazione. Nonostante questi sistemi ottengano risultati superiori, la separazione che vediamo utilizzando il sistema MCPA è ancora abbastanza buona da ottenere proteine ad alta purezza. È interessante notare che il nostro laboratorio utilizza anche l'AKTA start FPLC per eseguire la cromatografia a scambio ionico e sebbene la risoluzione possa essere più alta con un gradiente lineare in grado con questa macchina, è notevolmente più dispendioso in termini di tempo eseguire più campioni ed è molto più difficile addestrare studenti inesperti su questo sistema.

Esistono altre alternative di purificazione a base di piastre significativamente più economiche. Ad esempio, GE Healthcare life sciences (ora Cytiva) e Sigma Aldrich vendono piastre e cartucce precondizione da 96 filtri per pozzi con resine di purificazione specifiche. Queste piastre filtranti offrono una purificazione ad alta produttività su piccola scala, ma solo purificanti nell'intervallo di snervazione del microgrammo. Inoltre, il QIAvac 24 Plus di QIAGEN utilizza colonne di spin sotto vuoto, tuttavia, non è pratico per raccogliere il flusso attraverso o lavaggi.

Il design flessibile dell'MCPA consente la purificazione parallela delle proteine, anche se lo spostamento manuale di colonne e piastre utilizzando il metodo MCPA potenzialmente aumenta gli errori umani rispetto ai sistemi FPLC standard. Tuttavia, il caricamento manuale dei campioni su colonne è più affidabile per gli utenti inesperti rispetto al caricamento di campioni su colonne utilizzando FPC standard, dove gli errori possono essere commessi più facilmente in quanto comporta la commutazione di valvole e pompe che richiedono una formazione più ampia. È chiaro che i sistemi completamente automatizzati per la purificazione delle proteine sono più adatti dell'MCPA per i gruppi di purificazione nell'industria e nei laboratori accademici che lavorano regolarmente sulla purificazione. Tuttavia, per i piccoli laboratori che non possono permettersi le costose attrezzature e la manutenzione e vogliono evitare un'ampia formazione o solo occasionalmente lavorare sulla purificazione delle proteine, l'MCPA offre un sistema alternativo efficace che ottiene ancora una buona separazione ed è economico e facile da configurare.

L'MCPA è costituito da una strumentazione semplice ed economica che consente di interfacciare più colonne per la purificazione parallela simultanea per produrre quantità di milligrammi di proteine. Inoltre, questa tecnica consente la modularità delle singole colonne aumentando la velocità effettiva. Questo è unico per questo metodo e non può essere ottenuto utilizzando gli attuali kit di purificazione a piastre.

La purificazione delle proteine rimarrà essenziale nello studio e nella caratterizzazione delle proteine e nello sviluppo di terapie. Tecniche biofisiche come NMR e cristallografia proteica si basano su quantità milligrammi di proteine pure, quindi gli attuali sistemi di espressione e purificazione necessitano di ulteriore sviluppo per migliorare il costo e i tempi^{di raggiungimento di questo 2,13,14}. Come discusso, i sistemi di purificazione automatizzati hanno molti vantaggi rispetto ai metodi non automatizzati, tuttavia rimangono troppo costosi per i laboratori su piccola scala che richiedono costose strumentazioni e formazione. L'MCPA è considerevolmente più economico con un costo iniziale di $ 45^10. Inoltre, questo MCPA non ha bisogno di formazione estesa o manutenzione continua e in caso di problemi questi possono essere facilmente risolti. Tamponi corrosivi come i tamponi di denaturazione utilizzati per il Ni-NTA possono corrodere i sistemi di purificazione se non vengono puliti correttamente. Tuttavia, il design flessibile dell'MCPA consente una rapida pulizia, riparazione e cambio dei compartimenti, se necessario. In conclusione, l'MCPA faciliterà una purificazione efficace e più elevata delle proteine per i laboratori più piccoli fino a quando non saranno stabiliti sistemi automatizzati^{più convenienti 10}.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata da un Institutional Development Award (IDeA) del National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione P20GM103451 e una borsa di ricerca interna dell'Università di Liverpool.