מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

מתאם צלחת מרובה עמודות מאפשר לממשק עמודות כרומטוגרפיה עם לוחות איסוף מרובי בארות לזיקה מקבילה או לטיהור חילופי יון המספקים שיטת טיהור חלבון חסכונית בעלת תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש תחת כוח הכבידה או ואקום מניב כמויות מיליגרם של חלבון באמצעות מכשור סביר.

טיהור חלבונים הוא הכרחי לחקר מבנה החלבון ותפקודו ומשמש בדרך כלל בשילוב עם טכניקות ביופיזיות. זהו גם מרכיב מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים. העידן המתפתח של פרוטאומיקה תפקודית מתדלק את הביקוש לטיהור חלבונים בתפוקה גבוהה וטכניקות משופרות כדי להקל על כך. ההשערה הייתה כי מתאם לוחות מרובה עמודות (MCPA) יכול לממשק עמודות כרומטוגרפיה מרובות של שרפים שונים עם לוחות רב-באר לטיהור מקביל. שיטה זו מציעה שיטה חסכונית ורב-תכליתית של טיהור חלבונים שניתן להשתמש בה תחת כוח משיכה או ואקום, המתחרה במהירות של מערכת אוטומטית. MCPA יכול לשמש כדי לשחזר תפוקות מיליגרם של חלבון על ידי שיטה סבירה ויעילה בזמן עבור אפיון וניתוח הבאים. ה- MCPA שימש לטיהור זיקה בתפוקה גבוהה של תחומי SH3. חילופי יון הוכח גם באמצעות MCPA כדי לטהר חלבון לאחר כרומטוגרפיה זיקה Ni-NTA, המציין כיצד מערכת זו יכולה להיות מותאמת לסוגי טיהור אחרים. בשל ההתקנה שלה עם עמודות מרובות, התאמה אישית אישית של פרמטרים יכול להתבצע באותו טיהור, בלתי ניתן להשגה על ידי שיטות מבוססות צלחת הנוכחי.

טכניקות טיהור חלבונים להשגת כמויות מיליגרם של חלבונים מטוהרים הן הכרחיות לאפיון וניתוח שלהם, במיוחד עבור שיטות ביופיזיות כגון NMR. טיהור חלבונים הוא גם מרכזי בתחומים אחרים של מחקר כגון תהליכי גילוי תרופות ומחקרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון; עם זאת, השגת כמויות כאלה של חלבון טהור יכול להיות צוואר בקבוק עבור טכניקות אלה^1,2,3. השיטה העיקרית לטיהור חלבונים היא כרומטוגרפיה, הכוללת מגוון שיטות המסתמכות על המאפיינים האישיים של חלבונים ותגיהם. ב כרומטוגרפיה זיקה, חלבונים יש חלבון נוסף או מוטיב פפטיד שעובד כתג שיש לו זיקה מצע מסוים על משרף כרומטוגרפיה⁴. שיטת הזיקה הנפוצה ביותר היא כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת (IMAC) באמצעות חלבונים מתויגים על ידי His, ואילו שיטה פופולרית נוספת היא כרומטוגרפיה של חילופי יון המפרידה חלבונים על סמך המטען שלהם. עבור הטוהר הגבוה ביותר, שילוב של כרומטוגרפיה זיקה והחלפת יון משמש לעתים קרובות יחד, בדרך כלל דורש ציוד מעבדה יקר עבור תפוקה גבוהה.

העידן המתפתח של פרוטאומיקה תפקודית מתדלק את הביקוש לטכניקות תפוקה גבוהה לטיהור חלבונים לא ייחודיים לניתוח ספציפי אלא למספר רב של חלבונים בו זמנית לניתוח מקיף ומחקרים רחבים בגנום⁵. כרומטוגרפיה של זיקה מתכת משותקת (IMAC) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לטיהור חלבונים בתפוקה גבוהה^6,7 ובכל זאת המערכות האוטומטיות שלה יקרות ובלתי ניתנות להשגה עבור מעבדות קטנות יותר⁸. החלופות הזולות יותר המבוססות על לוחית רישוי הזמינות כיום משתמשות בשימוש בציוד נגיש מבוסס מעבדה, כגון ואקום. למרות ששיטות אלה מצליחות לשפר את מהירות הטיהור, הן יכולות להשיג טיהור בעל תפוקה גבוהה רק בקנה מידה קטן יותר, רק מניב חלבון בטווח המיקרוגרם. מגבלות אלה אומרות כי ארוז מראש 96 גם מסנן צלחות (למשל, מ GE Healthcare עכשיו בבעלות Cytiva) לא ניתן להשתמש לפני טכניקות ביופיזיות⁹. כרומטוגרפיית הכבידה היא שיטת הטיהור החסכונית ביותר; עם זאת, הגדרת עמודות מרובות אינה נוחה ויכולה להיות מועדת לשגיאה עבור חלבונים מרובים.

מתאם צלחת מרובה עמודות (MCPA) פותח והוכח בהצלחה ובנוחות להפעיל עמודות כרומטוגרפיה זיקה מקבילה בבת אחת כדי לטהר שלו מתויג שמרים SH3 תחומים¹⁰. ה- MCPA מציע שיטת טיהור חסכונית בעלת תפוקה גבוהה שאינה תלויה במכשור יקר. העיצוב הגמיש שלו יכול לטהר ביעילות מיליגרם של חלבון על ידי עמודי כרומטוגרפיה זיקה מרובים תחת כוח הכבידה או סעפת ואקום. יתר על כן, ניתן להתאים סוג, אמצעי אחסון ופרמטרים אחרים עבור כל עמודה בודדת למיטוב מהיר יותר. מחקר זה מדגים כי כרומטוגרפיה חילופי יון על ידי MCPA ניתן להשתמש בשילוב עם כרומטוגרפיה זיקה על ידי MCPA כדי לשפר את הטיהור של התחום Abp1 SH3. בנוסף, ניתן להפריד עד 24 חלבונים שונים במקביל בשיטות אלה.

1. כרומטוגרפיה של Ni-NTA

1. מכין מאגרים
   הערה: ראה טבלה 1 לקבלת פרטים על כל המאגרים.
   1. לפצות 500 מ"ל של 0.5 M NaOH, הקפד להוסיף את המים מילי-Q הראשון ולאחר מכן הוספת NaOH לאט בעוד הכומה היא על stirrer. סנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   2. הכן 100 מ"ל של 0.1 M ניקל סולפט ומסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   3. הכן 50 מ"ל של 2 M imidazole ומסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   4. הכן ומסנן 0.22 מיקרומטר 1.5 L של מאגר denaturing ב pH 8.0 המורכב 5.3 mM Tris-HCl, 4.7 mM Tris-base (טריס (הידרוקסימתיל)מתילאמין), 13.7 מ"מ NaH₂PO₄, 86.3 מ"מ_{נה 2}HPO₄ ו 6 M גואנידין הידרוכלוריד.
   5. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של פתרון מאגר תמוגה של 10 mM imidazole מומס מאגר denaturing (ראה 1.1.4) באמצעות 2 M מניית imidazole.
   6. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של פתרון חיץ לשטוף של 10 mM imidazole מומס מאגר denaturing (ראה 1.1.4) באמצעות 2 M מניית imidazole.
   7. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של 100 מ"מ מאגר EDTA, להתאים את ה-pH ל 8 באמצעות 1 M NaOH.
   8. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של מאגר elution מורכב 7 מ"ל של 99% חומצה אצטית קרחונית לתוך 6 M guanidine הידרוכלוריד.
      הערה: אם אתה משתמש במאגרים מקוריים, התאם בהתאם לטבלה 1.
2. תאי Lysing (שיטת דנאטרינג)
   1. הוסף 2 מ"ל של מאגר תמוגה לכל 1 גרם של כדורי תא E. coli שנקטפו המכילים את החלבון שלו יתר על התויג. וורטקס במשך מספר דקות עד שהתאים מושעים מחדש. השאירו את הדגימות על נדנדה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. כדורי צנטריפוגה ב lysed ב 18,000 x g במשך 30 דקות. שמור 50 μL בצד ב -20 מעלות צלזיוס מקפיא לנתח מאוחר יותר על ג'ל SDS-PAGE.
   3. בזהירות לשפוך את supernatants לוודא כי גלולה לא מופרע. Lysates צריך להיות ברור, צבע צהוב בהיר. אם lysates מעונן, מדגם צנטריפוגה שוב; שקול sonication אם זמין להשפיל חומצת גרעין.
   4. סנן את supernatants דרך עמודה ריקה (ללא שף אבל עם מסנן) ולאסוף במגש אוסף פתוח. לאחר מכן מעבירים לצינור לשימוש בשלב 1.3.
      הערה: אם אתה משתמש במאגרים המקוריים, לאחר שלב 1.2.1, לטפל בדגימות 3 מחזורים של הקפאה / הפשרה ב -80 מעלות צלזיוס או תהליך על ידי sonication או צרפתית הקש כדי ליז תאים.
3. הכנת הגדרת טיהור ואקום ועמודות שיווי משקל
   הערה: ראה איור 1 עבור MCPA מוגדר עם 24 עמודות.
   1. קבע כמה עמודות דרושות וכן את סוג השרף ואמצעי האחסון הרצויים. ככלל אצבע עבור 100 מ"ל של תרבות אוטואינדוקציה (~ 2 גלולה גרם) המבטא תחומי SH3 מתויגים באמצעות פלסמידים מבוססי T7, להשתמש 0.6 מ"ל של שרף Ni-NTA לכל עמודה להניב כ 3 מ"ג של חלבון מכ 6 מ"ל של ליסטאט.
   2. הכנס את המספר הרצוי של עמודות 12 מ"ל (ללא שרפין אך עם מסנן) לתוך MCPA מורכב מראש (צלחת טפטוף ארוך עם מחצלת איטום מנוקבת). העמודים צריכים להתאים בנוחות בחורים של מחצלת האיטום שנוקבו.
   3. אם נעשה שימוש בפחות מ- 24 עמודות, סגור חורים ריקים בעמודה סגורה ריקה.
   4. קח צלחת אוסף פתוחה ולשים את הצלחת הזאת לתוך הבסיס של סעפת ואקום ולסגור עם החלק העליון של סעפת.
   5. הנח את MCPA התאספו עם עמודות על גבי סעפת ואקום.
   6. חבר צינורות ממערכת משאבת ואקום לתוך / זרבובית בתחתית סעפת ואקום.
   7. ודא כי חרוזי Ni-NTA נמצאים בתמיסה של 50% עם 20% אתנול. לפני שעושים משהו עם החרוזים בעדינות לנער / לערבב את הפתרון חרוז / אתנול לשימוש חוזר באופן שווה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה 5 מ"ל, פיפטה 1.2 מ"ל של פתרון 50% לתוך העמודות. בעוד pipetting לוודא את החרוזים להישאר מעורבים לחלוטין.
   8. לאחר צינור לתוך כל 24 עמודות, להפעיל את משאבת ואקום ולהפעיל את 20% אתנול דרך העמוד לתוך צלחת האיסוף למטה.
   9. לכבות את המשאבה לאחר כל 20% אתנול רץ דרך כל העמודות (Ni-NTA שרפין יכול לסבול ייבוש קצר אם ואקום עדיין מוחל לאחר המאגר עבר דרך העמודה). להשליך את מה שיש בצלחת האיסוף הפתוחה לתוך קופסת פסולת.
      התראה: כל מוצרי הפסולת של חרוזי Ni-NTA מסוכנים, בעת טיפול חרוזים או להיפטר הפסולת, ללבוש כפפות, משקפי מגן PPE אחרים. יתר על כן, להשליך את כל פסולת ניקל סולפט במיכל נפרד לסילוק בודדים מאוחר יותר.
      הערה: אם שוסף חדש או נוצר לאחרונה, ניתן להתעלם משאר השלבים הללו, לעבור לסעיף הבא.
   10. הוסף 3 אמצעי אחסון שרף (1.8 מ"ל) של 100 mM EDTA מאגר באמצעות מזרק 20 מ"ל או התקן מזרק מהדר עם מזרק 50 מ"ל. לאחר מכן הפעל את משאבת ואקום לתת את מאגר EDTA לשטוף דרך ולכבות את המשאבה ברגע שהוא נשטף דרך.
       הערה: לשטוף זה צריך להסיר את הצבע הכחול ניקל אבל אם זה לא המקרה ואז לחזור על שלב זה עד כל העמודות איבדו את הצבע הכחול שלהם. מכבים את המשאבה ויוצקים את תכולת צלחת האיסוף הפתוחה לתוך קופסת הפסולת.
   11. הוסף 3 שרף כרכים (1.8 מ"ל) של 0.5 M NaOH מאגר לתוך כל עמודה לפני הפעלת המשאבה והפעלת זה דרך כל עמודה. לוחית איסוף ריקה.
   12. הוסף 4 כמויות שרף (2.4 מ"ל) של 100 מ"מ ניקל סולפט לתוך כל עמודה. הפעל את משאבת ואקום ולהפעיל את זה דרך העמודה שוב.
   13. הוסף 10 שרף כרכים (~ 6000 μL) של מים מילי-Q והפעלת זה דרך העמודים. מכבים את המשאבה ויוצקים את תכולת צלחת האיסוף לתוך קופסת הפסולת.
   14. לשטוף את העמודות פעמיים עם 4 נפחי משרף (2.4 מ"ל) של 10 mM imidazole במאגר לשטוף (denaturing או מקורי) בכל פעם כדי להסיר כל ניקל עודף שיווי משקל. לוחית איסוף ריקה.
       הערה: אם עמודות כלשהן פועלות לאט יותר באופן משמעותי, ניתן לדחוף את העמודה ולבדוק את האוויר דרך ה- MCPA באמצעות מזרק גדול. אם ביטול החסימה מתבצע, השתמש בעמודה אחרת עם מסנן חדש.
   15. אם דגימות שונות מרובות / חלבונים הולכים להיות מטוהרים על MCPA ואז להחליף את צלחת האוסף הפתוח עם 48 x (5 מ"ל / טוב) צלחת איסוף. עם זאת, כאשר רק פועל אותן דגימות חלבון על כל עמודה, זה בסדר להמשיך באמצעות צלחת אוסף פתוח.
4. טעינה, כביסה והתעלות
   1. עם ואקום כבוי, לטעון lysates לתוך עמודות (כמות lysate ישתנה, בדרך כלל מ 1 עד 12 מ"ל או יותר וייתכן שיידרש לטעון בכמה אצוות). השתמש מערבל פלסטיק דק בעדינות לערבב את החרוזים ואת lysate בעמודה כדי למקסם את הכריכה.
   2. לאחר ערבוב עדין של כל עמודה במשך מספר דקות, הפעל את משאבת הוואקום והפעל את הליטסאטים דרך העמודות. אם דגימות חלבון מרובות מנוהלות, להשתמש צלחת איסוף 48 גם ולוודא להחליף את צלחת האוסף עבור צלחת נוספת 48 גם לאחר 4 מ"ל יש לרוץ דרך כמו בארות בצלחות אלה יכול להחזיק רק 4 מ"ל של פתרון. המשך להפעיל את lysate עד שכל ה- lysates יפעל בעמודה. הקפא לוחות איסוף המכילים את הזרימה.
      הערה: עמודות עלולות להפוך ל"חסומות" ולגרום ל- lysate לזרום דרך העמודה לאט בהרבה מכפי שהוא אמור לזרום. זה מזוהה בקלות כמו העמודים הסמוכים יהיה זורם בקצב נורמלי. במקרה כזה, מומלץ להעביר את תערובת הליוזט/שף לעמודה המכילה מסנן חדש.
   3. החלף את צלחת האיסוף עם צלחת אוסף פתוחה ריקה ולאחר מכן להוסיף 9 כרכים שרף (5.4 מ"ל) של 10 mM imidazole לשטוף מאגר לכל עמודה ולהפעיל את ואקום ולהפעיל את לשטוף דרך. חזור על זה 4-5 פעמים. כדי למנוע גלישה, צלחת פסולת ריקה מעת לעת.
      1. לאחר מכן החליפו את צלחת האיסוף בצלחת מתאימה ונקייה (צלחת פתוחה לחלבון אחד בלבד ו-96 באר אם יש מספר חלבונים, מה שמבטיח ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה).
   4. באמצעות מזרק מהדר עם מזרק 12.5 מ"ל, פיפטה ~ 1 שרף נפח (0.75 מ"ל) של מאגר elution denaturing לתוך כל עמודה.
   5. כדי למנוע קצף חלבון, הפעל את משאבת ואקום בסביבה הנמוכה ביותר. בעדינות להרים את MCPA כדי לבדוק שום דבר לא נשאר לטפטף לתוך צלחת האוסף.
      הערה: חלופה ל eluting עם ואקום או כוח הכבידה הוא דוחף בוכנה מזרק 10 מ"ל לתוך החלק העליון של העמודה כדי לדחוף בעדינות את חוצץ elution דרך העמודה. עשה זאת עבור כל עמודה, להיות זהיר בעת הסרת בוכנה מזרק לא להפריע את החרוזים בתחתית העמודה. לאחר חיץ elution כבר דחף דרך, בעדינות להסיר את הבוכנה מזרק מהעמודה האחרונה זה שימש בקצרה להפעיל את משאבת ואקום כדי להסיר את הטיפות האחרונות מן העמודות.
      1. אם נעשה שימוש בצלחת איסוף של 96 באר, בדקו את לוחית האיסוף כדי לוודא שמה שזורם מכל עמודה דרך צלחת הטפטוף הארוכה זורם רק לבאר אחת ושום דבר לא עובר לבארות השכנות על צלחת האיסוף.
   6. עבור elution הבא לחזור על 2 השלבים לעיל ולאסוף טרי multi-well (דגימות שונות) או צלחת אוסף פתוח (אותן דגימות).
   7. צעד אופציונלי, לקחת 50 μL aliquot של כל elution לניתוח טוהר וריכוז.
   8. הוסף 2 מ"ל של 20% אתנול לכל עמודה ולהפעיל את זה באמצעות משאבת ואקום. לאחר מכן הוסיפו עוד 2 מ"ל של 20% אתנול לעמודים והשתמשו בווסטר פלסטיק דק וטרי כדי לערבב את האתנול 20% ואת החרוזים לפני המעבר לצינור 50 מ"ל לאחסון ב 4 מעלות צלזיוס. נקה את העמודות ובדוק שהמים זורמים בחופשיות דרך כל עמוד ולאחר מכן לנקות הכל ולשים בצד לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: עמודות מסוימות יחסמו בסופו של דבר את המסננים שלהן ויפעלו לאט מדי, יש להחליף עמודות אלה או לנקות מסננים. ככזה, מומלץ לבדוק מסננים מעת לעת על ידי הסרת שף ומילוי העמודה במים כדי לראות אם היא זורמת במהירות. ניתן לנקות מסננים על-ידי השארת עמודה סגורה מלאה במאגר התרוממות רוח ורעידות בין לילה.

2. החלפת יון - טיהור חלבונים יחיד

1. הכנת המאגרים
   הערה: ראה טבלה 1 לקבלת פרטים אודות כל המאגרים
   1. הכינו חיץ מלח נמוך ב-2 ליטר: 10 מ"מ טריס pH 8.1 (5 מ"מ חומצת טריס, בסיס טריס 5 מ"מ). פתרון סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   2. הכן חיץ מלח גבוה 0.5 L: 10 mM Tris pH 8.1, 4 M NaCl. מדידה 116.9 גרם של NaCl ולעשות עד 0.5 L עם 10 mM Tris pH 8.1 מלמעלה. פתרון סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
2. ביצוע סדרת ריכוז מלח: 0-1 M NaCl.
   הערה: ניתן להתאים את מגוון ריכוזי המלח לכל חלבון.
   1. התקנה 24 x 50 מ"ל שכותרתו צינורות צנטריפוגה בארון תקשורת
   2. באמצעות המאגרים שנעשו לעיל, להכין 24 x 14 מ"ל NaCl דילולים החל 0-1000 μM. התחל על ידי הוספת הנפחים הנדרשים של 4 M NaCl 10 mM Tris. זה יכול להיעשות על ידי במרווחים של 25 מ"מ או 50 מ"מ בהתאם לחלבון.
   3. לאחר מכן להוסיף את הנפחים הנדרשים של 10 mM Tris לכל צינור. הפוך כל צינור מספר פעמים כדי לערבב.
3. הכנת דוגמאות
   1. השג את הדגימות שיש לטהר על-ידי החלפת יון. באופן אופציונלי, לקחת 50 μL aliquot לניתוח מאוחר יותר.
      הערה: דגימות תמיד צריך להישמר קר; אלה עשויים להיות lysates, או אולי פוסט Ni-NTA. דגימות מ- Ni-NTA במאגרי denaturing דורשות חיוג או החלפת מאגר במאגר Tris 10 mM. דגימות מ Ni-NTA במאגרים מקוריים יכול להיות מדולל עם 10 mM Tris מאגר כדי להפחית את ריכוז המלח, כך החלבון יכול להיקשר לשרסום IEX.
   2. ספין דגימות ב 18,000 x g במשך 10 דקות.
   3. בזהירות לשפוך את supernatant לתוך סירת שקילה. הימנע להפריע גלולה.
   4. קח את supernatant בזהירות לתוך מזרק 20 מ"ל ולחבר מסנן 0.22 מיקרומטר.
   5. לאט לאט להוציא את supernatant החוצה דרך המסנן לתוך צינור טרי 50 מ"ל.
   6. אם נדרש דילול, לדלל supernatant עם 10 mM Tris מאגר עשה לעיל (בניסוי זה supernatant היה מדולל 1 ב 2). חנות ב 4 מעלות צלזיוס בינתיים.
4. הכנת מערך טיהור ואקום והתקנת שיווי משקל
   הערה: בפרוטוקול זה, רק עמודה אחת משמשת לטיהור IEX מדגם אחד. לקבלת טיהורים מרובים, עיין בסעיף הבא.
   1. קבע את סוג השרף ואת אמצעי האחסון הרצויים. ככלל אצבע עבור עד 20 מ"ג של תחומי SH3 מתויגים חלקית שלו, השתמש 0.4 מ"ל של שרף זרימה מהירה Q-sepharose לכל עמודה (ראה שלב 2.4.8).
   2. הוסף 24 עמודות ריקות פתוחות (ריקות ללא מסנן בתחתית) לתוך MCPA שהורכב מראש. העמודים צריכים להתאים בנוחות בחורים של מחצלת האיטום שנוקבו.
   3. הנח בוכנה מזרק 10 מ"ל לתוך כל עמודה ריקה למעט המיקום הראשון, שבו הטיהור יתחיל.
   4. לדחוף את החלק התחתון של עמודה פתוחה (עם מסנן) דרך אטם גומי בוכנה מזרק 5 מ"ל (כי כבר פירסינג) כדי ליצור טבעת גומי בסוף העמודה. טבעת גומי זו תבטיח חותם טוב כאשר עמודה זו מוכנסת לכל עמודה ריקה לעיל. לעת עתה, הוסף עמודה זו לעמודה הריקה הראשונה ב- MCPA.
   5. קח צלחת אוסף פתוחה ולשים את הצלחת הזאת לתוך הבסיס של סעפת ואקום ולסגור עם החלק העליון של סעפת.
   6. הנח את ה- MCPA המורכב (עם העמודות) על גבי סעפת הוואקום.
   7. חבר צינורות ממערכת משאבת ואקום למפרצון / זרבובית בתחתית הוואקום.
   8. חותכים קצה פיפטה כחול ~ 2 ס"מ מהתחתית ולהשתמש כדי לקחת עד 800 μL של חרוזי Q-sepharose (או כל שרפרף חילופי יון אחר), להבטיח כי פתרון 50/50 חרוז-אתנול מעורבב כדי למנוע שכבות. פיפטה 800 μL לתוך עמודה אחת פתוחה (עם מסנן) במיקום הראשון וברגע החרוזים להתיישב לתחתית העמודות לעבור על ואקום מספיק כדי לרוץ דרך 20% אתנול.
   9. לשטוף את העמודה המכילה חרוזי sepharose עם 2 x 2 מ"ל של 10 mM Tris. כבה את הוואקום רגע לפני שמאגר Tris עובר כדי למנוע את התייבשות שרף. ניתן לבטל את ההפעלה.
      הערה: אם שרף שימש בעבר, לחדש על ידי כביסה ב 5 כמויות שרף של 4 M NaCl ולאחר מכן 5 שרף כמויות של 10 mM Tris לפני שלב 2.4.9.
5. טעינה, כביסה והתעלות
   1. להעביר את כל המדגם כדי להיות מטוהרים (ראה סעיף 3) לעמודה Q sepharose במיקום הראשון, להשתמש בלולאת פלסטיק קטנה כדי לבחוש מדגם וחרוזים במשך כ ~ 2 דקות לפני החלפת משאבת ואקום.
      הערה: במקרים של עודף על-טבעי (>12 מ"ל), היזהר ממלאת יתר של העמודה. תן לדגימה לעבור ואז להוסיף עוד, ערבוב לפני לתת לרוץ דרך שוב.
   2. אחסן/הקפא את הזרימה לניתוח מאוחר יותר.
   3. מניחים עוד צלחת איסוף פתוחה לתוך סעפת ואקום ולאחר מכן לשטוף כל עמוד sepharose עם 2 x 2 מ"ל של 10 mM Tris ולאחסן.
   4. הכנס צלחת איסוף של 96 באר, וודא ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה.
   5. כדי לאסוף את שבר ההקלה הראשון, הסר את בוכנה המזרק מהעמודה הבאה לאורך, הזז את העמודה Q sepharose למצב זה והצב את בוכנה המזרק במיקום הקודם. ואז פיפטה 1 מ"ל של ריכוז המלח הראשון לתוך עמוד Sepharose Q. הפעל את המשאבה ולאסוף את elution. מכבים את המשאבה בדיוק כמו הקווים הנוזליים ליד החרוזים כדי למנוע ייבוש החרוזים.
   6. כדי לאסוף את שבר elution הבא, להסיר את הבוכנה מזרק מהעמודה הבאה לאורך, להעביר את העמודה Q sepharose למצב זה ולשים את בוכנה מזרק במיקום הקודם.
   7. מוסיפים 1 מ"ל של ריכוז המלח הבא לעמודה וחוזרים על התהליך עד שכל הריכוזים שימשו ו -24 elutions נאספו ב 24 בארות נפרדות. בדוק שום נוזל לא נכנס כל בארות השכנות.
   8. לשטוף את הטור עם 2 מ"ל של 4 M NaCl 10 mM Tris. תן לזה לעבור.
   9. לשטוף עם 2 מ"ל של 20% אתנול. תן אתנול לרוץ עד שהוא רק מעל החרוזים ועמודת חותם לאחסון.
   10. לאחסן 96 צלחת איסוף היטב ולנתח על ידי ספקטרוסקופיה UV ו- SDS PAGE.

3. חילופי יון - טיהורים בו זמנית של 24 חלבונים שונים

הערה: ראה שלבים 2.1-2.3 לקבלת פרטים על ביצוע מאגרים, סדרה של ריכוזי מלח והכנת דגימות

1. הכנת כיוונון הטיהור
   הערה: אופן ההגדרה של מערכת הטיהור תלוי מאוד במספר החלבונים המטוהרים ובכמה תנאי מלח ייעשה שימוש. כדי לטהר 12 דגימות עד למקסימום של 24 דגימות בו זמנית, צלחת איסוף עבור כל ריכוז מלח המשמש elute נדרש. עבור פחות מ 12 דגימות, ניתן להזיז את עמודות כרומטוגרפיה כמה עמדות בתוך MCPA אותו לפני שינוי לוחות אוסף. במקרה זה, אין צורך למקם את העמודות בעמודות ריקות והם יכולים להיות מחוברים ישירות מחצלת איטום MCPA. הפרוטוקול שלהלן מיועד ל-24 טיהורי חילופי יון בו זמנית.
   1. הנח את ה- MCPA שהורכב ישירות מחובר ל- 24 עמודות ריקות עם מסננים על גבי סעפת הוואקום המכילה צלחת איסוף פתוחה והכן ושטוף 24 עמודות החלפת יון כמו בשיטת טיהור אחת לעיל. לטיהור זה, נוח להשתמש במשדר או במזרק של Eppendorf כדי להיכנס במהירות לפיפטה לעמודות.
2. טעינה, כביסה והתעלות
   1. מניחים צלחת איסוף של 48 באר בבסיס סעפת הוואקום לפני התאמת MCPA (עם עמודי הטיהור שטופים המצורפים). ודא ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה.
   2. פיפטה כל דגימת חלבון (עד 5 מ"ל בכל פעם) לתוך העמודה המתאימה שלהם. מערבבים כל עמוד באמצעות לולאת פלסטיק דקה (לולאה אחת לכל עמודה כדי למנוע זיהום) במשך כ 2 דקות. ואז להפעיל את משאבת ואקום ולתת את הזרימה supernatant דרך.
      הערה: במקרים של עודף על-טבעי, היזהרו ממילוי יתר של העמודות. תן לדגימה לעבור בעמודה שלה ולאחר מכן להוסיף עוד ערבוב לפני שתתן לרוץ שוב.
   3. אחסן/הקפיא את צלחת האיסוף של 48 באר לניתוח מאוחר יותר מכיוון שהיא מכילה את הזרימה עבור כל חלבון.
   4. מניחים עוד צלחת איסוף של 48 באר לתוך סעפת ואקום ולאחר מכן לשטוף כל עמוד sepharose עם 2 x 2 מ"ל של 10 mM Tris.
   5. הכנס את צלחת האיסוף הראשונה של 96 באר לסעפת, תוך הבטחה כי A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן פיפטה 1 מ"ל של ריכוז המלח הראשון לתוך כל עמודה ולאחר מכן להפעיל את משאבת ואקום כדי להפעיל את זה דרך העמודות. הסר את צלחת האוסף, לכסות עם parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לניתוח.
   6. חזור על שלב עבור כל ריכוז מלח רצופים המשמשים כדי elute. ודא כי צלחת אוסף חדשה משמשת עבור כל elution וכי כל צלחת אוסף מסומן ומאוחסן.
   7. לשטוף כל עמודה עם 2 מ"ל של 10 mM Tris, 4 M NaCl.
   8. לשטוף כל עמודה עם 2 מ"ל של 20% אתנול. תן אתנול לרוץ עד שהוא רק מעל החרוזים ועמודי חותם לאחסון.
   9. לאחסן 96 לוחות איסוף היטב ולנתח על ידי ספקטרוסקופיה UV ו SDS-PAGE.

לדוגמה, ה- MCPA טיהר בהצלחה 14 מוטציות AbpSH3 בתנאים דאנטוריים באמצעות Ni-NTA (איור 2A). מזהם קטן ~ 25 kDa ניתן לראות, אולם החלבון הוא עדיין טהור במידה רבה. מזהם זה הוא האמין להיות YodA, חלבון משותף מטוהר נפוץ נמצא E. coli¹¹. איור 2B מציג את הטיהור של 11 תחומי SH3 שונים בתנאים מקוריים. מזהם קטן לראות בתנאי denaturing מוסר בתנאים מקומיים. פעולה זו מראה כי MCPA יכול לשמש להשוואת טיהורים המורכבים מאגרים מקוריים או denaturing כמפורט בטבלה 1. 

באיור 3מוצגים נתונים מייצגים לטיהור lysate באמצעות IEX MCPA . זה מרמז כי AbpSH3 ניתן להפריד מרוב המזהמים כפי שהוא elutes מאוחר יותר בין 425 mM ל 700 מ"מ. ריכוז המלח הדרוש כדי ללטף את החלבון מהעמודה מתייחס לחוזק האינטראקציה האלקטרוסטטית בין החלבון לשורף. רוב החלבונים החיידקיים יש pIs נמוך; עם זאת החלבון של עניין הוא שלילי מאוד ונראה שיש pI נמוך יותר. תשואות טובות של חלבון AbpSH3 טהור במידה ניכרת נמצאו עם כמה מזהמים במשקל מולקולרי גבוה יותר AbpSH3 לראות להקות ב ~ 5 kDa. IEX באמצעות MCPA ולכן יכול לשמש כצעד הראשון בפרוטוקול טיהור כפי שהוא יכול לבודד כמויות מספיקות של חלבון מן המזהמים הנוכחיים lysate.

טיהור נוסף על ידי IEX באמצעות ה- MCPA הוכח בהצלחה על שברים שהושמטו מהפעלת NI-NTA MCPA (איור 4). באופן ניכר, שתי פסגות עיקריות נפתרו עם מקסימום ב 400 ו 700 מ"מ מלח, אשר עשוי להתאים להפרדת גרסה חתוכה N-מסוף של חלבון זה. באמצעות ניתוח נתונים נוסף של DSF התברר כי השיא 1 היה מעט פחות יציב והיה לו T_m מעט נמוך יחסית לשיא 2. בהשוואה לריצה IEX של lysate, השברים הכולל הם הרבה יותר נקיים ולהראות את היתרון של הפעלת צעד Ni-NTA לפני IEX. אמנם יש זיהום קל עם חלבונים במשקל מולקולרי גבוה יותר, השברים הם עדיין טהורים במידה רבה הניבו נתונים ביופיזיים טובים באמצעות NMR ו מבחני denaturation תרמית / כימית.

איור 1: תצוגה קדמית של מכשיר ה- MCPA. (A) תצוגה קדמית של מכשיר MCPA עם 24 עמודות מצורפות. העמודים מרווחים באופן שווה בתוך מחצלת איטום 96 גם כדי להנחות את elutions לתוך צלחת אוסף 96, 48 או פתוח. (B) תצוגה עליונה של מחצלת האיטום. (C) תצוגה תחתונה של אותו מחצלת איטום. (D) תצוגה קדמית של MCPA עם עמודות ובוכנות מזרק מחוברות. נתון זה שונה מ דומינגז ואח '¹⁰. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמה לתצורה של 1 x 24 עמודות, טיהור מוטנטים שונים של SH3 בתנאים של תפירה ותנאים מקוריים. (A)טיהור של מוטציות AbpSH3 שונות. זיהום קל ניתן להבחין ~ 25 kDa על פני כל נתיב. (B)טיהור מקורי של 11 תחומי SH3 שמרים שונים. המזהמים הוסרו מכל נתיב ואינם נראים עוד על ג'ל. נתון זה שונה דומינגז ואח '¹⁰. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: טיהור lysate באמצעות IEX באמצעות MCPA. (A)קריאות ספיגה של כל התרוממות מחילופי היונים (IEX) נמדדו על ידי צלחת LVis (BMG). הקריאות זוממות כנגד ריכוז NaCl המקביל של האלוטינה. הפסגה עם ריכוז החלבון הגבוה ביותר נראית ב 700 mM NaCl. (B)ניתוח SDS-PAGE של אלוטות מלח IEX המוצגות ב- (A). סמן המשקל המולקולרי מוצג בצד שמאל של הג'ל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: טיהור בריכת VJM2 (לאחר Ni-NTA) באמצעות IEX באמצעות מערכת MCPA.

(A)קריאות ספיגה של התרוממות שנאספו מחילופי היונים (IEX) נמדדו באמצעות NanoDrop. הקריאות זוממות כנגד ריכוז NaCl המקביל של האלוטינה. (B)ניתוח SDS-PAGE של אלוטות מלח IEX המוצגות ב- (A). סמן המשקל המולקולרי מוצג בצד שמאל של הג'ל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב מאגרים, טיהור Ni-NTA וטיהורים מקומיים ומאגרי מלח נמוכים וגבוהים.

השיטה היא חזקה ופשוטה לשימוש עבור ביוכימאים חלבון לא מנוסה יחסית, עם זאת יש כמה שיקולים לזכור.

זהירות לגבי מילוי יתר של צלחות איסוף

צלחת אוסף 48 באר עצמו מחזיק רק 5 מ"ל לבאר בעוד כל 96-באר מחזיק רק 2 מ"ל. יש לזכור זאת בעת הוספת מאגר והפעלת מדגם דרך העמודה מכיוון שקיים סיכון למילוי יתר של הבארות. בפרט, יש לנקוט טיפול בעת העברת הדגימות הגדולות יותר לעמודת הכרומטוגרפיה לטיהור. במקרים שבהם יש עודף supernatant, לחלק בחלקים, מספיק כדי למלא את העמודה, אשר יש לאפשר לרוץ דרך לפני הוספת החלק הבא כדי למנוע מילוי יתר ואובדן של מדגם. לאחר כל תוספת של supernatant, טור צריך להיות מעורבב עם לולאת פלסטיק קטנה, כדי להגדיל את הסבירות של חלבון מחייב את החרוזים, לפני הפעלת המשאבה. כדי לעקוב אחר כיוון הצלחת ולכן התוכן של בארות, ודא כי הפינה שכותרתו 'A1' הוא תמיד בפינה השמאלית העליונה של הצלחת לפני תחילת הטיהור.

חלבון אלוט

בעת התרוממות רוח בשלב IEX וזיקה, ואקום משמש על ההגדרה הנמוכה ביותר כדי למשוך את מאגר elution דרך העמודה. זה מאיץ את קצב הזרימה בהשוואה לכוח הכבידה אם כי אם ריכוז החלבון גבוה, זה יכול להוביל לתמיסת החלבון לקצף ופוטנציאל denature. במקרה זה, חלופה היא להשתמש בוכנה מזרק על גבי העמודה הפתוחה כדי לדחוף את המאגר דרך העמודה. במקרה זה, בוכנה מזרק צריך להיות בעדינות (לא בכוח) דחף למטה לתוך העמודה כדי לדחוף את הנוזל דרך ולתוך צלחת האוסף מתחת. יש להקפיד בעת הסרת צלחת האיסוף כדי להבטיח כל טיפות elution שנותרו על MCPA לא לשפוך לתוך בארות שכנות, גרימת זיהום.

תחזוקת שף ועמודות

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא התחדשות של שרפים Ni ועמודות. יש ליצור מחדש עמודות בתחילתו או בסופו של פרוטוקול הטיהור. אם התחדשות מתרחשת בסוף, אתרף צריך להיות מאוחסן 20% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס. מסנני עמודות הכרומטוגרפיה עלולים להפוך ל"חסומים" ולגרום לדגימה לזרום דרך העמודה בקצב איטי בהרבה מכפי שהיא אמורה לזרום. במקרה כזה, יש להחליף עמודות או להסיר ולנקות מסננים על ידי השרייה במאגר דנאטורה בן לילה ושטיפה במים.

כפי שהוכח תחת שלב 3, ניתן לנצל את המגוון של מכשיר MCPA לטיהור חלבונים מרובים ביעילות כמו מדגם יחיד. פרוטוקול חילופי היונים יכול להיות מותאם לצרכי הניסוי, תוך התאמה למספר הדגימות השונות ומספר ריכוזי המלח הנמצאים בשימוש. לדוגמה, אם פחות מ-12 דגימות מטוהרות בו-זמנית, הדבר יכלול כל שילוב של הזזת העמודות לאחר כל elution בתוך אותה צלחת ו/או החלפת לוחות איסוף עבור כל elution. אם למשל, רק 4 חלבונים היו להיות מטוהרים במקביל, העמודות ניתן להעביר על פני צלחת אוסף אחד כדי לאסוף elutions של עד 4 ריכוזי מלח לפני החלפת צלחות. MCPA הוא מסוגל טיהור באמצעות שרפים שונים - זיקה וחילופי יון כבר נדונו אבל כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובית אפשרית גם ויש פוטנציאל נוסף עבור כרומטוגרפיה אימונואפיניות¹². למרות שיטה זו התמקדה טיהורים בקנה מידה קטן מרובים, MCPA יכול לשמש רק עמוד כרומטוגרפיה גדול אחד לטיהור מכמה ליטרים של תרבות חיידקית, ללא צורך במשאבה מדגם או FPLC יקר.

שימוש ב- MCPA לחילופי יון בתפוקה גבוהה כפי שנדון ידרוש לוחות אוסף נפרדים מרובים, עד 24. זה יכול להיות לא מעשי ודורש הרבה מקום על ספסל מעבדה סטנדרטי העליון סיכון מוגבר לטעות אנוש. יתר על כן, מדידת ספיגת חלבון של elutions מ 24 דגימות שונות עשוי להיות מאתגר. במצב זה פיפטה רב ערוצית יהיה מועיל ויהפוך את ההעברה של דגימות מרובות מהר יותר וקל יותר. עבור כמויות קטנות, שקול להשתמש בלוח LVis (BMG) המכיל 16 microdrops כפי שהוא מאפשר מדידה של הריכוזים ישירות, ללא צורך להשתמש כל ריאגנטים אחרים כגון ריאגנט Assay ברדפורד.

בעוד שהשימוש במשאבת ואקום מאפשר מהירות טיהור מהירה פי 3 ממה שהושג באמצעות כוח משיכה¹⁰בלבד , מבלי להתפשר על שלמות השאף, הוא יוצר כמה בעיות אחרות. שמירה על כוחו של ואקום במהלך הטיהור, למשל, דורש את כל העמודות להיחסם עם בוכנה מזרק 10 מ"ל אשר צריך להוציא לפני החדרת העמודה ארוז עם שרף. הוצאת הוכנות אחת אחת היא גם תהליך מתוזמן והתנגדות הוואקום עלולה להקשות על הסרתן מהעמודה.

פרטים של טיהור IEX חלבון מרובים באמצעות MCPA ניתנים בפרוטוקול. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה יותר יעילה בזמן וניתן לשליטה, כל הפרמטרים עבור כל טיהור יכולים להיות מניפולציה על-ידי המשתמש. עם זאת, ברוב מעבדות הביוכימיה חלבון, כולל בתעשייה, כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה היא השיטה המועדפת של טיהור חלבון, אשר מעולה במונחים של תפוקה, רבייה והעברת שיטה וחוסן. מערכות אלה כגון יצרנית החלבון על ידי ביוסולוטיונים חלבון ומערכת טיהור ביומולקולה AKTA FPLC יכול להקל על בעיית צוואר הבקבוק טיהור בהצלחה רבה. למרות שמערכות אלה משיגות תוצאות מעולות, ההפרדה שאנו רואים באמצעות מערכת MCPA עדיין טובה מספיק כדי להשיג חלבון טוהר גבוה. מעניין, המעבדה שלנו גם משתמשת FPLC להתחיל AKTA לבצע כרומטוגרפיה חילופי יון ולמרות הרזולוציה עשויה להיות גבוהה יותר עם שיפוע ליניארי מסוגל עם מכונה זו, זה בעיקר יותר זמן רב כדי להפעיל דגימות מרובות וזה הרבה יותר מאתגר לאמן תלמידים חסרי ניסיון במערכת זו.

קיימות חלופות טיהור זולות יותר באופן משמעותי. לדוגמה, GE Healthcare מדעי החיים (כיום Cytiva) וסיגמא אולדריץ' מוכרים 96 לוחות סינון ומחסניות ארוזים מראש עם שרפים טיהור ספציפיים. לוחות סינון אלה מציעים טיהור תפוקה גבוהה בקנה מידה קטן אך רק טיהור בטווח התשואה מיקרוגרם. יתר על כן, QIAvac 24 פלוס מ QIAGEN משתמש בעמודות ספין תחת ואקום עם זאת, זה לא מעשי לאיסוף זרימה דרך או שוטף.

העיצוב הגמיש של ה- MCPA מאפשר טיהור חלבונים מקביל, אם כי הזזה ידנית של עמודות וצלחות בשיטת MCPA עשויה להגדיל טעויות אנוש בהשוואה למערכות FPLC סטנדרטיות. עם זאת, טעינה ידנית של הדגימות לעמודות אמינה יותר עבור משתמשים לא מנוסים מאשר טעינת דגימות לעמודות באמצעות FPLCs סטנדרטיים, שם ניתן לבצע טעויות בקלות רבה יותר מכיוון שהיא כרוכה בהחלפת שסתומים ומשאבות הדורשים הכשרה מקיפה יותר. ברור כי מערכות אוטומטיות לחלוטין לטיהור חלבונים מתאימות יותר מאשר MCPA לקבוצות טיהור בתעשייה ובמעבדות אקדמיות שעובדות באופן שגרתי על טיהור. עם זאת, עבור מעבדות קטנות אשר לא יכול להרשות לעצמו את הציוד היקר ותחזוקה רוצה להימנע הכשרה נרחבת או רק מדי פעם לעבוד על טיהור חלבון, MCPA מציעה מערכת חלופית יעילה אשר עדיין מקבל הפרדה טובה והוא זול וקל להקים.

MCPA מורכב מכשור פשוט וזול המאפשר עמודות מרובות להיות ממשק עבור טיהור מקביל בו זמנית לייצר כמויות מיליגרם של חלבונים. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת מודולריות של העמודות הבודדות להגדיל את התפוקה. זה ייחודי לשיטה זו ולא ניתן להשיגו באמצעות ערכות טיהור מבוססות צלחת נוכחיות.

טיהור חלבונים יישאר חיוני במחקר ואפיון של חלבונים ופיתוח של טיפולים. טכניקות ביופיזיות כגון NMR וקריסטלוגרפיה של חלבונים מסתמכות על כמויות מיליגרם של חלבון טהור, ולכן מערכות הביטוי והטיהור הנוכחיות זקוקות לפיתוח נוסף כדי לשפר את העלות והזמן של השגת^{זה 2,13,14}. כפי שנדון, למערכות טיהור אוטומטיות יש יתרונות רבים על פני שיטות לא אוטומטיות אולם הן נשארות יקרות מדי עבור מעבדות בקנה מידה קטן יותר הדורשות מכשור יקר והדרכה. MCPA הוא הרבה יותר זול עם עלות התחלתית של $45^10. בנוסף, MCPA זה אינו זקוק להכשרה מקיפה או תחזוקה רציפה ואם מתעוררות בעיות אלה ניתן לפתור בקלות. מאגרים קורוזיביים כגון מאגרי denaturing המשמשים Ni-NTA יכול corrode מערכות טיהור אם הם לא ניקו כראוי. עם זאת, העיצוב הגמיש של MCPA מאפשר ניקוי מהיר, תיקון והחלפה של תאים במידת הצורך. לסיכום, MCPA יקל יעיל, טיהור חלבון תפוקה גבוהה יותר עבור מעבדות קטנות יותר עד מערכות אוטומטיות במחיר סביר יותר הוקמו¹⁰.

למחברים אין מה לחשוף.

מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר המענק P20GM103451 ומענק מחקר פנימי מאוניברסיטת ליברפול.