Um sistema econômico e versátil de purificação de proteínas de alto rendimento usando um adaptador de placa de várias colunas

Um adaptador de placa de várias colunas permite que as colunas de cromatografia sejam interfaceadas com placas de coleta multi-poços para afinidade paralela ou purificação de troca de íons, proporcionando um método econômico de purificação de proteínas de alto rendimento. Pode ser usado sob gravidade ou vácuo produzindo quantidades de miligramas de proteína através de instrumentação acessível.

A purificação de proteínas é imprescindível para o estudo da estrutura e função proteica e geralmente é usada em combinação com técnicas biofísicas. É também um componente-chave no desenvolvimento de novas terapêuticas. A era em evolução da proteômica funcional está alimentando a demanda por purificação de proteínas de alto rendimento e técnicas aprimoradas para facilitar isso. Foi a hipótese de que um adaptador de placa de várias colunas (MCPA) pode interagir múltiplas colunas de cromatografia de diferentes resinas com placas multi-poço para purificação paralela. Este método oferece um método econômico e versátil de purificação de proteínas que pode ser usado sob gravidade ou vácuo, rivalizando com a velocidade de um sistema automatizado. O MCPA pode ser usado para recuperar o rendimento de miligramas de proteína por um método acessível e eficiente de tempo para caracterização e análise subsequentes. O MCPA tem sido usado para purificação de afinidade de alto rendimento dos domínios SH3. A troca de íons também foi demonstrada através do MCPA para purificar a cromatografia de afinidade proteína pós-Ni-NTA, indicando como este sistema pode ser adaptado a outros tipos de purificação. Devido à sua configuração com várias colunas, a personalização individual dos parâmetros pode ser feita na mesma purificação, inalcançável pelos métodos atuais baseados em placas.

Técnicas de purificação de proteínas para alcançar quantidades miligramas de proteínas purificadas são imprescindíveis à sua caracterização e análise, especialmente para métodos biofísicos como a RMR. A purificação de proteínas também é central em outras áreas de estudo, como processos de descoberta de medicamentos e estudos de interação proteína-proteína; no entanto, alcançar tais quantidades de proteína pura pode se tornar um gargalo para essas técnicas^1,2,3. O principal método de purificação de proteínas é a cromatografia, que inclui uma variedade de métodos que dependem das características individuais das proteínas e suas tags. Na cromatografia de afinidade, as proteínas têm um motivo adicional de proteína ou peptídeo que funciona como uma etiqueta que tem afinidade por um certo substrato na resina cromatografia⁴. O método de afinidade mais comum é a cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) usando proteínas marcadas por His, enquanto outro método popular é a cromatografia de troca de íons que separa proteínas com base em sua carga. Para a maior pureza, uma combinação de cromatografia de afinidade e troca de íons é frequentemente usada em conjunto, geralmente exigindo equipamentos de laboratório caros para alta produtividade.

A era em evolução da proteômica funcional está alimentando a demanda por técnicas de alto rendimento para purificar proteínas não singulares para análise específica, mas um grande número de proteínas simultaneamente para análise abrangente e estudos de genoma⁵. A cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) é um dos métodos mais utilizados para purificação de proteínas de alta produtividade^6,7, mas seus sistemas automatizados são caros e inacessíveis para laboratórios menores⁸. As alternativas mais acessíveis à base de placas que estão atualmente disponíveis empregam o uso de equipamentos acessíveis baseados em laboratório, como um vácuo. Embora esses métodos sejam bem sucedidos em melhorar a velocidade de purificação, ele só pode alcançar purificação de alto rendimento em menor escala, produzindo apenas proteína na faixa de microgramas. Essas limitações significam que as placas de filtro de 96 poços pré-embaladas (por exemplo, da GE Healthcare agora de propriedade da Cytiva) não podem ser utilizadas antes das técnicas biofísicas⁹. A cromatografia gravitacional é o método de purificação mais econômico; no entanto, configurar várias colunas é inconveniente e pode ser propenso a erros para múltiplas proteínas.

Um adaptador de placa de várias colunas (MCPA) foi desenvolvido e comprovado para executar com sucesso e convenientemente colunas de cromatografia de afinidade paralela de uma só vez para purificar os domínios SH3 com sua marca marcada¹⁰. O MCPA oferece um método de purificação de alto rendimento econômico que não depende de instrumentação dispendia. Seu design flexível pode efetivamente purificar miligramas de proteína por múltiplas colunas de cromatografia de afinidade sob gravidade ou coletor de vácuo. Além disso, o tipo de resina, o volume e outros parâmetros podem ser ajustados para cada coluna individual para uma otimização mais rápida. Este estudo demonstra que a cromatografia de troca de íons pelo MCPA pode ser usada em conjunto com a cromatografia de afinidade pelo MCPA para melhorar a purificação do domínio Abp1 SH3. Além disso, até 24 proteínas diferentes podem ser separadas em paralelo usando esses métodos.

1. Denaturação da cromatografia Ni-NTA

1. Preparando buffers
   NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter detalhes de todos os buffers.
   1. Coma 500 mL de 0,5 M NaOH, certificando-se de adicionar a água Milli-Q primeiro e, em seguida, adicionar o NaOH lentamente enquanto o béquer está em um agitador. Filtrar usando um filtro de 0,22 μm.
   2. Prepare 100 mL de sulfato de níquel de 0,1 M e filtro usando um filtro de 0,22 μm.
   3. Prepare 50 mL de 2 M de imidazol e filtro usando um filtro de 0,22 μm.
   4. Prepare e 0,22 μm filtro 1,5 L de tampão de desnaturação em pH 8.0 consistindo de 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-base (Tris (hidroximetila)metilamina), 13,7 mM NaH₂PO₄, 86,3 mM Na₂HPO₄ e 6 M de cloridrato de guanidina.
   5. Prepare e 0,22 μm filtro 500 mL de solução tampão de lise de 10 mM imidazol dissolvido em tampão de desnaturação (ver 1.1.4) usando o estoque de 2 M imidazol.
   6. Prepare e 0,22 μm filtro 500 mL de solução tampão de lavagem de 10 mM imidazol dissolvido em tampão de desnaturação (ver 1.1.4) usando o estoque de 2 M imidazol.
   7. Prepare e 0,22 μm filtro 500 mL de tampão EDTA de 100 mM, ajuste pH para 8 usando 1 M NaOH.
   8. Prepare e 0,22 μm filtro 500 mL de tampão de elução composto de 7 mL de ácido acético glacial de 99% em 6 M de cloridrato de guanidina.
      NOTA: Se estiver usando buffers nativos, adapte-se de acordo com a Tabela 1.
2. Células de desnaturação (método de desnaturação)
   1. Adicione 2 mL de tampão de lise a cada 1 g de pelotas de células E. coli colhidas que contenham a proteína his-tagged sobre-expressa. Vórtice por vários minutos até que as células sejam reinsucionadas. Deixe as amostras em um roqueiro por 30 minutos a 4 °C.
   2. Pelotas centrífugas a 18.000 x g por 30 minutos. Mantenha 50 μL de lado no congelador de -20 °C para analisar mais tarde em um gel SDS-PAGE.
   3. Despeje cuidadosamente os supernacantes certificando-se de que a pelota não seja perturbada. Os lysates devem ser uma cor clara e amarela clara. Se os lises estão nublados, a amostra centrífuga novamente; considerar a sônica se disponível para degradar o ácido nucleico.
   4. Filtre os supernantes através de uma coluna vazia (sem resina, mas com filtro) e colete em uma bandeja de coleta aberta. Em seguida, transfira para um tubo para uso na etapa 1.3.
      NOTA: Se usar os buffers nativos, após a etapa 1.2.1, trate as amostras a 3 ciclos de congelamento/degelo a -80 °C ou processo por sônica ou French Press para células de lise.
3. Preparando a configuração de purificação de vácuo e colunas de equilíbrio
   NOTA: Veja Figura 1 para uma configuração MCPA com 24 colunas.
   1. Determine quantas colunas são necessárias, bem como o tipo e volume de resina desejados. Como regra geral para 100 mL de cultura de autoindução (~2 g de pelota) expressando domínios SH3 com sua marca usando plasmídeos baseados em T7, use 0,6 mL de resina Ni-NTA por coluna para produzir cerca de 3 mg de proteína de cerca de 6 mL de liseto.
   2. Insira o número desejado de colunas de 12 mL (sem resina, mas com filtro) em um MCPA pré-montado (placa de gotejamento longo com esteira de vedação perfurada). As colunas devem caber snugly nos orifícios do tapete de vedação que foram perfurados.
   3. Se forem utilizadas menos de 24 colunas, feche os orifícios vazios com uma coluna fechada vazia.
   4. Pegue uma placa de coleta aberta e coloque esta placa na base do coletor de vácuo e feche com a parte superior do coletor.
   5. Coloque o MCPA montado com colunas em cima do coletor de vácuo.
   6. Conecte a tubulação de um sistema de bomba de vácuo à entrada/bocal na parte inferior do coletor de vácuo.
   7. Certifique-se de que as contas Ni-NTA estão em uma solução de 50% com 20% de etanol. Antes de fazer qualquer coisa com as contas suavemente agitar/misturar a solução de contas/etanol para resuspend uniformemente. Em seguida, utilizando uma pipeta de 5 mL, pipeta 1,2 mL da solução de 50% nas colunas. Enquanto pipetting certifique-se de que as contas permanecem totalmente misturadas.
   8. Depois de pipetar em todas as 24 colunas, ligue a bomba de vácuo e passe o etanol de 20% através da coluna e na placa de coleta abaixo.
   9. Desligue a bomba uma vez que todo o etanol de 20% tenha passado por todas as colunas (a resina Ni-NTA pode tolerar uma secagem breve se o vácuo ainda for aplicado após o buffer passar pela coluna). Descarte o que está na placa de coleta aberta em uma caixa de lixo.
      ATENÇÃO: Todos os resíduos das contas Ni-NTA são perigosos, ao manusear as contas ou descartar os resíduos, usar luvas, óculos e outros EPI. Além disso, descarte todos os resíduos de sulfato de níquel em um recipiente separado para descarte individual posteriormente.
      NOTA: Se a resina for nova ou regenerada recentemente, o resto desses passos podem ser ignorados, mova-se para a próxima seção.
   10. Adicione 3 volumes de resina (1,8 mL) de tampão EDTA de 100 mM usando uma seringa de 20 mL ou um dispositivo de seringa repetidor com uma seringa de 50 mL. Em seguida, ligue a bomba de vácuo para deixar o tampão EDTA passar e desligar a bomba depois de lavada.
       NOTA: Esta lavagem deve remover a cor azul níquel, mas se este não for o caso, então repita esta etapa até que todas as colunas tenham perdido sua cor azul. Desligue a bomba e despeje o conteúdo da placa de coleta aberta na caixa de lixo.
   11. Adicione 3 volumes de resina (1,8 mL) de 0,5 M naoH buffer em cada coluna antes de ligar a bomba e executá-lo através de cada coluna. Placa de coleta vazia.
   12. Adicione 4 volumes de resina (2,4 mL) de sulfato de níquel de 100 mM em cada coluna. Ligue a bomba de vácuo e passe esta através da coluna mais uma vez.
   13. Adicione 10 volumes de resina (~6000 μL) de água Milli-Q e passando por estas colunas. Desligue a bomba e despeje o conteúdo da placa de coleta na caixa de lixo.
   14. Lave as colunas duas vezes com 4 volumes de resina (2,4 mL) de imidazol de 10 mM em tampão de lavagem (desnaturação ou nativo) cada vez para remover qualquer excesso de níquel e equilíbrio. Placa de coleta vazia.
       NOTA: Se alguma coluna estiver sendo significativamente mais lenta, desprender a coluna e verificar o ar pode ser empurrada através do MCPA usando uma seringa grande. Se isso for desbloqueado, use uma coluna diferente com um filtro fresco.
   15. Se várias amostras/proteínas diferentes forem purificadas no MCPA, substitua a placa de coleta aberta por uma placa de coleta de 48 x (5 mL/bem). No entanto, quando apenas executam as mesmas amostras de proteína em cada coluna, é bom continuar usando uma placa de coleta aberta.
4. Carregando, lavando e eluting
   1. Com o vácuo desligado, a carga é colocada em colunas (a quantidade de lise vai variar, normalmente de 1 a 12 mL ou mais e pode ser necessária para carregar em vários lotes). Use um agitador de plástico fino para misturar suavemente as contas e o lise na coluna para maximizar a ligação.
   2. Depois de misturar suavemente cada coluna por alguns minutos, ligue a bomba de vácuo e execute os lisates através das colunas. Se várias amostras de proteínas estiverem sendo executadas, use uma placa de coleta de 48 poços e certifique-se de trocar a placa de coleta por outra placa de 48 poços depois que 4 mL tiver corrido, pois os poços nessas placas só podem conter 4 mL de solução. Continue funcionando até que todos os lysates sejam executados através de uma coluna. Congele as placas de coleta que contenham o fluxo através do fluxo.
      NOTA: As colunas podem ficar "bloqueadas" fazendo com que o lisesato flua através da coluna muito mais lento do que deveria. Isso é facilmente detectado como as colunas vizinhas estarão fluindo a uma taxa normal. Se isso ocorrer, recomenda-se que a mistura lysate/resina seja transferida para uma coluna contendo um filtro fresco.
   3. Substitua a placa de coleta por uma placa de coleta aberta vazia e, em seguida, adicione 9 volumes de resina (5,4 mL) de 10 mM de tampão de lavagem imidazol a cada coluna e ligue o vácuo e passe a lavagem. Repita isso 4-5 vezes. Para evitar o transbordamento, esvazie periodicamente a placa de resíduo.
      1. Em seguida, substitua a placa de coleta por uma placa limpa apropriada (placa aberta para apenas uma proteína e 96 bem se houver múltiplas proteínas, garantindo que a A1 esteja no canto superior esquerdo).
   4. Utilizando uma seringa repetidora com uma seringa de 12,5 mL, pipeta ~1 volume de resina (0,75 mL) de tampão de eluição desnaturing em cada coluna.
   5. Para evitar espuma de proteína, ligue a bomba de vácuo no ajuste mais baixo. Levante suavemente o MCPA para verificar se nada é deixado para gotejar na placa de coleta.
      NOTA: Uma alternativa para eludir com o vácuo ou gravidade é empurrar um êmbolo de seringa de 10 mL para a parte superior da coluna para empurrar suavemente o tampão de elução através da coluna. Faça isso para cada coluna, sendo cuidadoso ao remover o êmbolo da seringa para não perturbar as contas na parte inferior da coluna. Uma vez que o tampão de elução tenha sido empurrado, remova suavemente o êmbolo da seringa da última coluna em que foi usado e ligue brevemente a bomba de vácuo para remover as últimas gotas das colunas.
      1. Se uma placa de coleta de 96 poços tiver sido usada, então verifique a placa de coleta para garantir que o que está fluindo de cada coluna através da placa de gotejamento longo esteja fluindo apenas em um poço e nada está eluvando em poços vizinhos na placa de coleta.
   6. Para a próxima elução, repita as 2 etapas acima e colete em um novo multi-poço (amostras diferentes) ou placa de coleta aberta (mesmas amostras).
   7. Etapa opcional, tome uma alíquota de 50 μL de cada eluição para análise de pureza e concentração.
   8. Adicione 2 mL de 20% de etanol a cada coluna e execute isso usando a bomba de vácuo. Em seguida, adicione mais 2 mL de 20% de etanol às colunas e use um agitador de plástico fino fresco para misturar o etanol de 20% e as contas antes de transferir para um tubo de 50 mL para armazenamento a 4 °C. Limpe as colunas e verifique se a água flui livremente através de cada coluna e, em seguida, limpe tudo e guarde para uso posterior.
      NOTA: Algumas colunas eventualmente terão seus filtros bloqueados e funcionarão muito lentamente, essas colunas devem ser substituídas ou filtros limpos. Como tal, recomenda-se testar periodicamente filtros removendo a resina e enchendo a coluna com água para ver se ela flui rapidamente. Os filtros podem ser limpos deixando uma coluna fechada cheia de tampão de eluição desnaturação e tremendo durante a noite.

2. Intercâmbio de íons - Purificação de proteína única

1. Preparando os buffers
   NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter detalhes de todos os buffers
   1. Prepare um tampão de sal baixo de 2 L: 10 mM Tris pH 8.1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Solução de filtro usando um filtro de 0,22 μm.
   2. Prepare um tampão de sal de 0,5 L: 10 mM Tris pH 8.1, 4 M NaCl. Medir 116,9 g de NaCl e fazer até 0,5 L com os 10 mM Tris pH 8.1 de cima. Solução de filtro usando um filtro de 0,22 μm.
2. Fazendo série de concentração de sal: 0-1 M NaCl.
   NOTA: A gama de concentrações de sal pode ser ajustada para cada proteína.
   1. Configuração tubos de centrífuga rotulados de 24 x 50 mL em um rack
   2. Usando os buffers feitos acima, prepare diluições de 24 x 14 mL NaCl que variam de 0-1000 μM. Comece adicionando os volumes necessários de 4 M NaCl 10 mM Tris. Isso poderia ser feito por incrementos de 25 mM ou 50 mM, dependendo da proteína.
   3. Em seguida, adicione os volumes necessários de 10 mM Tris a cada tubo. Inverta cada tubo várias vezes para misturar.
3. Preparando amostras
   1. Obtenha as amostras para serem purificadas pela troca de íons. Opcionalmente, tome uma alíquota de 50 μL para análise posteriormente.
      NOTA: As amostras devem ser sempre mantidas frias; estes podem ser lysates, ou talvez pós Ni-NTA. Amostras de Ni-NTA em buffers de desnaturação requerem dialyzing ou troca de buffer em buffer Tris de 10 mM. Amostras de Ni-NTA em tampões nativos poderiam ser diluídas com tampão Tris de 10 mM para reduzir a concentração de sal para que a proteína possa se ligar à resina IEX.
   2. Gire amostras a 18.000 x g por 10 minutos.
   3. Despeje cuidadosamente o sobrenante em um barco de pesagem. Evite perturbar a pelota.
   4. Leve o supernatante cuidadosamente em uma seringa de 20 mL e conecte um filtro de 0,22 μm.
   5. Ejete lentamente o supernasal através do filtro em um tubo fresco de 50 mL.
   6. Se for necessária diluição, dilui o supernaente com tampão tris de 10 mM feito acima (Neste experimento, o supernaente foi diluído 1 em 2). Armazene a 4 °C enquanto isso.
4. Preparando a configuração de purificação de vácuo e configuração de equilíbrio
   NOTA: Neste protocolo, apenas uma coluna é usada para purificação IEX de uma amostra. Para múltiplas purificações, consulte a próxima seção.
   1. Determine o tipo e o volume de resina desejados. Como regra geral para até 20 mg de domínios SH3 parcialmente puros, use 0,4 mL de resina de fluxo rápido Q-sepharose por coluna (ver passo 2.4.8).
   2. Insira 24 colunas vazias (vazias sem filtro na parte inferior) em um MCPA pré-montado. As colunas devem caber snugly nos orifícios do tapete de vedação que foram perfurados.
   3. Coloque um êmbora de 10 mL em cada coluna vazia, exceto na primeira posição, onde a purificação começará.
   4. Empurre a parte inferior de uma coluna aberta (com filtro) através de uma junta de borracha de 5 mL (que foi perfurada) para formar um anel de borracha no final da coluna. Este anel de borracha garantirá uma boa vedação quando esta coluna estiver inserida em cada coluna vazia acima. Por enquanto, insira esta coluna na primeira coluna vazia do MCPA.
   5. Pegue uma placa de coleta aberta e coloque esta placa na base do coletor de vácuo e feche com a parte superior do coletor.
   6. Coloque o MCPA montado (com colunas) em cima do coletor de vácuo.
   7. Conecte a tubulação de um sistema de bomba de vácuo à entrada/bocal na parte inferior do vácuo.
   8. Corte uma ponta de pipeta azul ~ 2 cm da parte inferior e use para ocupar 800 μL de contas Q-sepharose (ou qualquer outra resina de troca de íons), garantindo que a solução de 50/50 de etanol de contas seja misturada para evitar camadas. Pipeta 800 μL na única coluna aberta (com filtro) na primeira posição e uma vez que as contas se acomodam na parte inferior das colunas ligue o vácuo o suficiente para passar pelo etanol de 20%.
   9. Lave a coluna contendo contas de sepharose com 2 x 2 mL de 10 mM Tris. Desligue o vácuo pouco antes do tampão Tris passar para evitar que a resina seque. Fugir pode ser descartado.
      NOTA: Se a resina tiver sido usada anteriormente, regenere lavando em 5 volumes de resina de 4 M NaCl e, em seguida, 5 volumes de resina de 10 mM Tris antes do passo 2.4.9.
5. Carregando, lavando e eluting
   1. Transfira toda a amostra para ser purificada (ver seção 3) para a coluna Q sepharose na primeira posição, use um pequeno laço plástico para agitar a amostra e as contas por cerca de ~2 minutos antes de ligar a bomba de vácuo.
      NOTA: Em casos de excesso de supernaspeuta (>12 mL), cuidado com o excesso de enchimento da coluna. Deixe a amostra passar e adicione mais, misturando antes de deixar passar novamente.
   2. Armazenar/Congelar o fluxo para análise posteriormente.
   3. Coloque outra placa de coleta aberta no coletor de vácuo e depois lave cada coluna de sepharose com 2 x 2 mL de 10 mM Tris e armazene.
   4. Insira uma placa de coleta de 96 poços, certificando-se de que a A1 esteja no canto superior esquerdo.
   5. Para coletar a primeira fração de elução, remova o êmbolo da seringa da próxima coluna, mova a coluna Q sepharose para esta posição e coloque o êmbolo da seringa na posição anterior. Em seguida, pipeta 1 mL da primeira concentração de sal na coluna Q sepharose. Ligue a bomba e colete a elução. Desligue a bomba assim como as linhas líquidas perto das contas para evitar secar as contas.
   6. Para coletar a próxima fração de elução, remova o êmbolo da seringa da próxima coluna, mova a coluna Q sepharose para esta posição e coloque o êmbolo da seringa na posição anterior.
   7. Adicione 1 mL da próxima concentração de sal à coluna e repita o processo até que todas as concentrações tenham sido utilizadas e 24 eluções tenham sido coletadas em 24 poços separados. Verifique se nenhum líquido entrou em nenhum poço vizinho.
   8. Lave a coluna com 2 mL de 4 M NaCl 10 mM Tris. Deixe isso passar.
   9. Lave com 2 mL de 20% de etanol. Deixe o etanol funcionar até que esteja logo acima das contas e da coluna de vedação para armazenamento.
   10. Armazene 96 placas de coleta de poços e analise por espectroscopia UV e PÁGINA SDS.

3. Intercâmbio de íons - Purificações simultâneas de 24 proteínas diferentes

NOTA: Veja os passos 2.1-2.3 para obter detalhes sobre como fazer buffers, uma série de concentrações de sal e preparar amostras

1. Preparando a configuração de purificação
   NOTA: A forma como o sistema de purificação é configurada depende muito de quantas proteínas serão purificadas e quantas condições de sal serão utilizadas. Para purificar 12 amostras até o máximo de 24 amostras simultaneamente, é necessária uma placa de coleta para cada concentração de sal usada para eluto. Para menos de 12 amostras, é possível mover as colunas cromatografias algumas posições dentro do mesmo MCPA antes de trocar as placas de coleta. Neste caso, não há necessidade de colocar as colunas em colunas vazias e elas podem ser diretamente anexadas ao tapete de vedação do MCPA. O protocolo abaixo é para 24 purificações simultâneas de troca de íons.
   1. Coloque o MCPA montado diretamente ligado a 24 colunas vazias com filtros na parte superior do coletor de vácuo que contém uma placa de coleta aberta e prepare e lave 24 colunas de troca de íons como no método de purificação único acima. Para esta purificação, é conveniente usar um repetidor Eppendorf ou seringa para rapidamente pipeta em colunas.
2. Carregando, lavando e eluting
   1. Coloque uma placa de coleta de 48 poços na base do coletor de vácuo antes de encaixar o MCPA (com as colunas de purificação lavadas anexadas). Certifique-se de que A1 está no canto superior esquerdo.
   2. Pipeta cada amostra de proteína (até 5 mL por vez) em sua coluna correspondente. Mexa cada coluna usando um laço plástico fino (um laço para cada coluna para evitar contaminação) por aproximadamente 2 minutos. Em seguida, ligue a bomba de vácuo e deixe o supernatante fluir.
      NOTA: Em casos de excesso de supernanato, cuidado com o excesso de preenchimento das colunas. Deixe a amostra passar por sua coluna e adicione mais, misturando antes de deixar passar novamente.
   3. Armazene/Congele a placa de coleta de 48 poços para análise posterior, pois esta contém o fluxo através de cada proteína.
   4. Coloque outra placa de coleta de 48 poços no coletor de vácuo e, em seguida, lave cada coluna de sepharose com 2 x 2 mL de 10 mM Tris.
   5. Insira a primeira placa de coleta de 96 poços no coletor, garantindo que o A1 esteja no canto superior esquerdo e, em seguida, pipeta 1 mL da primeira concentração de sal em cada coluna e, em seguida, ligue a bomba de vácuo para executar isso através das colunas. Retire a placa de coleta, cubra com parafilm e armazene a 4 °C para análise.
   6. Repita o passo para cada concentração de sal sucessiva usada para eluto. Certifique-se de que uma nova placa de coleta seja usada para cada elução e que cada placa de coleta seja rotulada e armazenada.
   7. Lave cada coluna com 2 mL de 10 mM Tris, 4 M NaCl.
   8. Lave cada coluna com 2 mL de 20% de etanol. Deixe o etanol funcionar até que esteja logo acima das contas e colunas de vedação para armazenamento.
   9. Armazene 96 placas de coleta de poços e analise por espectroscopia UV e SDS-PAGE.

Como exemplo, o MCPA conseguiu purificar com sucesso 14 mutantes AbpSH3 em condições de desnaturação via Ni-NTA (Figura 2A). Um pequeno contaminante ~ 25 kDa pode ser visto, no entanto a proteína ainda é em grande parte pura. Acredita-se que este contaminante seja YodA, uma proteína co-purificada comum encontrada em E. coli¹¹. A Figura 2B mostra a purificação de 11 diferentes domínios SH3 em condições nativas. O pequeno contaminante visto em condições de desnaturação é removido em condições nativas. Isso mostra que o MCPA pode ser usado para comparação de purificações compostas de tampões nativos ou desnaturados conforme listado na Tabela 1. 

Os dados representativos para a purificação de um lisato via IEX MCPA são mostrados na Figura 3. Isso sugere que o AbpSH3 pode ser separado da maioria dos contaminantes, pois se estornando-se mais tarde entre 425 mM e 700 mM. A concentração de sal necessária para elutar a proteína da coluna relaciona-se com a força da interação eletrostática entre a proteína e a resina. A maioria das proteínas bacterianas tem pIs baixos; no entanto, a proteína dos juros é muito negativa e parece ter um iI menor. Bons rendimentos de proteína AbpSH3 consideravelmente pura foram recuperados com alguns vários contaminantes de peso molecular mais alto AbpSH3 vistos como bandas a ~ 5 kDa. O IEX via MCPA pode, portanto, ser usado como o primeiro passo em um protocolo de purificação, pois pode isolar quantidades suficientes de proteína dos contaminantes atuais em um lisato.

A purificação adicional pelo IEX utilizando o MCPA foi demonstrada com sucesso em frações elucidadas a partir de uma corrida Ni-NTA MCPA(Figura 4). Notavelmente, dois picos principais foram resolvidos com máxima de 400 e 700 mM de sal, o que pode corresponder à separação de uma versão truncada n-terminal desta proteína. Através de uma análise adicional de dados DSF, ficou evidente que o pico 1 era ligeiramente menos estável e tinha um T_m ligeiramente menor em relação ao pico 2. Em comparação com a execução IEX do lysate, as frações em geral são muito mais limpas e mostram o benefício de executar um passo Ni-NTA antes da IEX. Embora haja uma ligeira contaminação com proteínas de maior peso molecular, as frações ainda são em grande parte puras e têm gerado bons dados biofísicos usando ensaios de RNF e denaturação térmica/química.

Figura 1: Uma visão frontal do instrumento MCPA. (A) Visão frontal do instrumento MCPA com 24 colunas anexadas. As colunas são espaçadas uniformemente dentro do tapete de vedação de 96 poços para guiar as eluções em uma placa de coleta 96, 48 ou aberta. (B) Vista superior do tapete de vedação. (C) Vista inferior do mesmo tapete de vedação. (D) Visão frontal do MCPA com colunas e êmbolos de seringa ligados. Este valor foi modificado a partir de Dominguez et al.¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um exemplo de uma configuração de coluna 1 x 24, a purificação de vários mutantes SH3 sob desnaturação e condições nativas. (A) Purificação de desnaturação de vários mutantes AbpSH3. Uma pequena contaminação pode ser detectada de ~ 25 kDa em cada pista. (B) Purificação nativa de 11 diferentes domínios de leveduras SH3. Os contaminantes foram removidos de cada pista e não mais visíveis em gel. Este número foi modificado Dominguez et al.¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Purificação do lisato utilizando IEX via MCPA. (A) As leituras de absorvência de todas as eluções da troca de íons (IEX) foram medidas por uma placa LVis (BMG). As leituras são traçadas contra a concentração de NaCl correspondente da elução. O pico com maior concentração de proteínas é visto em 700 mM NaCl. (B) Análise SDS-PAGE das eluções de sal IEX apresentadas em (A). O marcador de peso molecular é mostrado à esquerda do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Purificação do Pool VJM2 (pós Ni-NTA) utilizando IEX via sistema MCPA.

(A) As leituras de absorvência das eluções coletadas da troca de íons (IEX) foram medidas utilizando-se um NanoDrop. As leituras são traçadas contra a concentração de NaCl correspondente da elução. (B) Análise SDS-PAGE das eluções de sal IEX apresentadas em (A). O marcador de peso molecular é mostrado à esquerda do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição de tampões, desnaturação de Ni-NTA e purificações nativas e troca de íons baixos e altos tampões de sal.

O método é robusto e simples de usar para bioquímicos de proteínas relativamente inexperientes, no entanto, há algumas considerações a serem consideradas.

Cuidado com o excesso de placas de coleta

A placa de coleta de 48 poços em si contém apenas 5 mL por poço, enquanto cada 96-well possui apenas 2 mL. Isso precisa ser mantido em mente ao adicionar buffer e executar a amostra através da coluna, pois há o risco de encher demais os poços. Em particular, é preciso ter cuidado ao transferir as amostras maiores para a coluna de cromatografia para purificação. Nos casos em que houver excesso de supernanato, divida em partes, suficientes para preencher a coluna, que deve ser permitida a execução antes de adicionar a próxima parte para evitar qualquer excesso de preenchimento e perda de amostra. Após cada adição de supernascido, a coluna deve ser misturada com um pequeno laço plástico, para aumentar a probabilidade de ligação proteica às contas, antes de ligar a bomba. Para acompanhar a orientação da placa e, portanto, o conteúdo dos poços, certifique-se de que o canto rotulado 'A1' esteja sempre no canto superior esquerdo da placa antes de iniciar a purificação.

Proteína de eluição

Ao eludir no IEX e passo de afinidade, o vácuo é usado na configuração mais baixa para puxar o buffer de eluição através da coluna. Isso acelera a taxa de fluxo em comparação com a gravidade, embora se a concentração de proteínas for alta, pode levar à solução proteica para espuma e potencialmente desnatura. Se este for o caso, uma alternativa é usar um êmbolo de seringa em cima da coluna aberta para empurrar o buffer através da coluna. Neste caso, o êmbolo da seringa deve ser gentilmente (não com força) empurrado para baixo na coluna para empurrar o líquido através e para dentro da placa de coleta abaixo. Deve-se tomar cuidado ao remover a placa de coleta para garantir que quaisquer gotas de elução remanescentes no MCPA não derramem em poços vizinhos, causando contaminação.

Manutenção de resina e colunas

Um passo crítico neste protocolo é a regeneração das resinas e colunas Ni. As colunas devem ser regeneradas no início ou no fim do protocolo de purificação. Se a regeneração ocorrer no final, a resina deve ser armazenada em 20% de etanol a 4 °C. Os filtros da coluna cromatografia podem ficar "bloqueados" fazendo com que a amostra flua através da coluna a uma taxa muito mais lenta do que deveria. Se este for o caso, as colunas precisam ser substituídas ou filtros removidos e limpos, encharcando o tampão de desnaturação durante a noite e enxaguando com água.

Como demonstrado no passo 3, a diversidade do instrumento MCPA pode ser explorada para a purificação de múltiplas proteínas tão efetivamente quanto uma única amostra. O protocolo de troca de íons pode ser adaptado para atender às necessidades do experimento, adaptando-se ao número de diferentes amostras e número de concentrações de sal que estão sendo utilizadas. Por exemplo, se menos de 12 amostras forem purificadas simultaneamente, envolveria qualquer combinação de mover as colunas após cada elução dentro da mesma placa e/ou trocar placas de coleta por cada eluição. Se, por exemplo, apenas 4 proteínas estavam sendo purificadas em paralelo, as colunas podem ser movidas através de uma placa de coleta para coletar eluções de até 4 concentrações de sal antes de trocar de placas. O MCPA é capaz de purificar usando várias resinas - afinidade e troca de íons já foram discutidas, mas a cromatografia de interação hidrofóbica também é possível e há ainda potencial para cromatografia imunoaffinity¹². Embora este método tenha se concentrado em múltiplas purificações em pequena escala, o MCPA pode ser usado para apenas uma única coluna de cromatografia grande para purificação de vários litros de cultura bacteriana, sem a necessidade de uma bomba de amostra ou um FPLC caro.

O uso do MCPA para troca de íons de alto rendimento como discutido exigiria múltiplas, até 24, placas de coleta separadas. Isso pode ser impraticável e exigir muito espaço em um banco de laboratório padrão e aumento do risco de erro humano. Além disso, medir a absorção de proteínas de eluções de 24 amostras diferentes pode ser um desafio. Nesta situação, uma pipeta multicanal seria benéfica e tornaria a transferência de várias amostras mais rápida e fácil. Para pequenos volumes, considere usar uma placa LVis (BMG) contendo 16 microdrops, pois permite medir diretamente as concentrações, sem a necessidade de usar outros reagentes, como o reagente de ensaio de Bradford.

Embora o uso de uma bomba de vácuo permita uma velocidade de purificação 3x mais rápida do que o que é alcançado usando apenas a gravidade¹⁰, sem comprometer a integridade da resina, ela cria alguns outros problemas. Manter a força do vácuo durante a purificação, por exemplo, requer que todas as colunas sejam bloqueadas com um êmbolo de seringa de 10 mL que precisa ser retirado antes de inserir a coluna embalada com resina. Tirar os êmbolos um a um também é um processo oportuno e a resistência do vácuo pode dificultar a remoção da coluna.

Detalhes de uma purificação de IEX de proteína múltipla usando o MCPA são dados no protocolo. Este método de maior throughput é eficiente e controlável, todos os parâmetros para cada purificação podem ser manipulados pelo usuário. No entanto, na maioria dos laboratórios de bioquímica de proteínas, incluindo a indústria, a cromatografia líquida de proteínas rápidas é o método preferido de purificação de proteínas, que é superior em termos de throughput, reprodutibilidade e transferência de método e robustez. Esses sistemas como o Fabricante de Proteínas por Biosoluções de Proteína e o sistema de purificação de biomoléculas AKTA FPLC podem aliviar o problema do gargalo de purificação com grande sucesso. Apesar desses sistemas obterem resultados superiores, a separação que vemos usando o sistema MCPA ainda é boa o suficiente para obter proteína de alta pureza. Curiosamente, nosso laboratório também usa o AKTA start FPLC para realizar cromatografia de intercâmbio de íons e, embora a resolução possa ser maior com um gradiente linear capaz com esta máquina, é notavelmente mais demorado para executar várias amostras e é muito mais desafiador treinar alunos inexperientes neste sistema.

Existem outras alternativas de purificação significativamente mais baratas à base de placas. Por exemplo, as ciências da vida da GE Healthcare (agora Cytiva) e Sigma Aldrich vendem placas de filtro de 96 poços pré-embaladas e cartuchos com resinas de purificação específicas. Estas placas de filtro oferecem purificação de alto rendimento em pequena escala, mas apenas purificando na faixa de rendimento do micrograma. Além disso, o QIAvac 24 Plus da QIAGEN usa colunas de spin sob vácuo, no entanto, não é prático para coletar fluxo através ou lava.

O design flexível do MCPA permite a purificação de proteínas paralelas, embora mover manualmente colunas e placas usando o método MCPA potencialmente aumenta os erros humanos em comparação com os sistemas FPLC padrão. No entanto, carregar manualmente as amostras em colunas é mais confiável para usuários inexperientes do que carregar amostras em colunas usando FPLCs padrão, onde erros podem ser mais facilmente cometidos, pois envolve a troca de válvulas e bombas que requer treinamento mais extenso. É claro que sistemas totalmente automatizados para purificação de proteínas são mais adequados do que o MCPA para grupos de purificação em laboratórios industriais e acadêmicos que trabalham rotineiramente na purificação. No entanto, para pequenos laboratórios que não podem pagar os equipamentos e manutenção caros e querem evitar treinamentos extensos ou apenas ocasionalmente trabalhar na purificação de proteínas, o MCPA oferece um sistema alternativo eficaz que ainda obtém boa separação e é barato e fácil de configurar.

O MCPA consiste em uma instrumentação simples e barata que permite que várias colunas sejam interfacedas para purificação paralela simultânea para produzir quantidades miligramas de proteínas. Além disso, essa técnica permite a modularidade das colunas individuais aumentando o rendimento. Este é exclusivo deste método e não pode ser alcançado usando kits de purificação baseados em placas atuais.

A purificação de proteínas permanecerá essencial no estudo e caracterização das proteínas e no desenvolvimento da terapêutica. Técnicas biofísicas como A RMN e cristalografia proteica dependem de quantidades miligramas de proteína pura, portanto, os sistemas de expressão e purificação atuais precisam de mais desenvolvimento para melhorar o custo e o tempo de alcançar este^2,13,14. Como discutido, os sistemas de purificação automatizados têm muitas vantagens sobre métodos não automatizados, no entanto, permanecem muito caros para laboratórios de menor escala que exigem instrumentação e treinamento caros. O MCPA é consideravelmente mais barato com um custo inicial de $45¹⁰. Além disso, este MCPA não precisa de treinamento extensivo ou manutenção contínua e, caso surjam problemas, estes podem ser facilmente resolvidos. Tampões corrosivos, como os tampões de desnaturação usados para o Ni-NTA, podem corroer os sistemas de purificação se não forem limpos corretamente. No entanto, o design flexível do MCPA permite a limpeza rápida, reparo e troca de compartimentos, se necessário. Em conclusão, o MCPA facilitará a purificação eficaz e de proteína de maior rendimento para laboratórios menores até que sistemas automatizados mais acessíveis sejam estabelecidos¹⁰.

Os autores não têm nada a revelar.

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de bolsas P20GM103451 e uma bolsa de pesquisa interna da Universidade de Liverpool.