Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Здесь мы представляем протокол для выполнения изоляции и расширения периферической крови моноядерных клеток, полученных цитокиновых CD3^cd56- клетки-убийцы и иллюстрируем их цитотоксический эффект против гематологических и твердых раковых клеток с помощью системы цитометрии в пробирке диагностики.

Приемная клеточная иммунотерапия фокусируется на восстановлении распознавания рака через иммунную систему и улучшает эффективное убийство опухолевых клеток. Цитокин индуцированных убийца (CIK) Т-клеточная терапия, как сообщается, оказывают значительное цитотоксиче эффекты против раковых клеток и уменьшить неблагоприятные последствия хирургии, радиации и химиотерапии в лечении рака. CIK может быть получен из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК), костного мозга и пуповинной крови. Клетки CIK представляют собой разнородную субпопуляцию Т-клеток с CD3^иCD56 и природными фенотипическими характеристиками убийцы (NK), которые включают в себя основные комплексы гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности. Это исследование описывает квалифицированный, клинически применимый, поток цитометрии на основе метода для количественной цитолической способности ПБМК полученных клеток CIK против гематологических и твердых раковых клеток. В цитолическом анализе, клетки CIK совместно инкубируются в различных соотношениях с заранее целевыми опухолевыми клетками. После инкубационного периода, количество клеток-мишеней определяется нуклеиновой кислотой-связывающей пятно для обнаружения мертвых клеток. Этот метод применим как к исследованиям, так и к диагностическим приложениям. Клетки CIK обладают мощной цитотоксичностью, которая может быть изучена в качестве альтернативной стратегии для лечения рака после его доклинической оценки с помощью установки цитометра и отслеживания (CS и T) на основе цитометрии потока системы.

Цитотоксические Т-лимфоциты являются специфической популяцией клеток иммунного эффектора, которая опосредует иммунные реакции против рака. Несколько популяций эпреторных клеток, включая лимфокин-активированный убийца (LAK) клетки, опухолевые лимфоциты (TILs), естественные клетки убийцы (НК), Т-клетки, и цитокин-индуцированных убийца (CIK) клетки были разработаны для приемной Т-клеточной терапии (ACT) целей¹. Существует растущий интерес к клеткам CIK, потому что они представляют собой смесь цитокинов индуцированных цитотоксических клеток населения расширена от аутологичных периферических клеток крови (PMBCs)².

Неконтролируемый рост клеток-прародителей лимфоидов, миелобластов и лимфобластов приводит к трем основным видам рака крови (например, лейкемии, лимфомы и миеломы), твердых опухолей, включая рак , рак легких, рак желудка, рак шейки матки) и саркомы, среди других видов рака³. Клетки CIK представляют собой смесь клеточных популяций, которые демонстрируют широкий спектр основных комплекс гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности и, таким образом, держать обещание для лечения гематологических и передовых опухолей^4,5,6,7. Клетки CIK состоят из комбинации ячеек, в том числе Т-клеток (CD3^иCD56^),НК-Т-клеток (CD3^иCD56⁾и НК-клеток (CD3^-CD56). Оптимизация протокола индукции CIK с использованием фиксированного графика для добавления IFN-З, анти-CD3 антител и IL-2, приводит к расширению ciK-клеток⁸. Цитотоксические возможности клеток CIK против раковых клеток в основном зависит от участия НК группы 2 член D (член C-типа лектин-подобных рецепторов семьи) NKG2D лиганды на опухолевые клетки, и на перфорин-опосредованных путей⁹. Результаты доклинического исследования показали, что IL-15-стимулировали клетки CIK индуцированной мощной цитотоксичности против первичной и острой миелоидной лейкемии клеточных линий в пробирке и выставлены более низкую алореактивность против нормальных ПБМК и фибробластов⁹. В последнее время, результат ы одноразовый здоровый донора полученных CIK (1 х 10⁸/ кг CD3^- клетки) инфузии, как консолидация после немиелоаблятивной аллогенной трансплантации для лечения миелоидных неоплазм в фазе II клинического исследования было опубликовано¹⁰.

В настоящем исследовании мы разработали оптимизированную формулу культуры клеток, состоящую из IFN-Я, IL-1, антител анти-CD3 и IL-2, добавленных в гематопоиетическую среду для увеличения производства CIK, и исследовали цитотоксический эффект клеток CIK против хронических человеческих миелоидный лейкоз (K562) клетки рака яичников (OC-3) клеток.

Клинический протокол был выполнен и утвержден в соответствии с руководящими принципами Институционального наблюдательного совета Китайского медицинского университета и Комитета по этике исследований больниц. Образцы периферийной крови были собраны у здоровых добровольцев с их информированного согласия.

1. Подготовка материалов

1. Храните реагенты, антитела и химические вещества, как показано на листе данных о материальной безопасности (MSDS). Растворите препараты или цитокины в растворителях в качестве стоковых растворов, а затем аликвот для хранения при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация для подготовкиматериала отмечена в таблице материалов .

2. Изоляция PBMC

1. Разогрейте градиентный раствор плотности(Таблица материалов) до 18-20 градусов по Цельсию перед использованием. Несколько раз переворачивайте бутылку раствора, чтобы обеспечить тщательное смешивание.
2. Соберите 3'5 мл образца венозной крови человека в гепаринилном флаконе и хорошо перемешайте, несколько раз аккуратно инвертируя трубку.
3. Приготовьте 4 мл градиентного раствора плотности в стерильной трубке 15 мл.
4. Тщательно прокладывайте 1 мл образца крови на градиентный раствор плотности.
5. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при 18–20 градусах по Цельсию (выключите перерыв).
6. Тщательно и сразу же аспирировать буйный слой пальто моноядерных клеток (около 1 мл) сразу, чтобы избежать нарушения слоев стерильной трубки 15 мл с помощью 1 мл стерильной пипетки.
7. Добавьте не менее 3 томов (3 мл) фосфатно-буферного сосудистого раствора (PBS) в буйный слой в центрифуге трубки. Приостановить клетки, аккуратно pipetting их вверх и вниз, по крайней мере 3x со стерильной пипеткой.
8. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 18-20 градусах По Цельсию. Аспирируй супернатанта.
9. Приостановить клетку гранулы с 5 мл базальной среды (Таблица материалов) и передать в колбу. Культура клеток в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах По цельсии и 5% CO_2.

3. Индукция и расширение CIK

1. На день 0, культура PBMCs (1 х 10⁶) в свежей базальной среде, содержащей 1000 МЕ /мл IFN-я для 24 ч в увлажненных инкубатор культуры клеток на 37 C и 5% CO₂.
2. На 1-й день освежите среду со свежей базальной средой, содержащей 50 нг/мл анти-CD3 антител, 1 нг/мл rh IL-1 и 1000 U/mL rh IL-2. Освежать среду каждые 3 дня.
3. На 7-й день освежите среду со свежей базальной средой, содержащей 1000 U/mL rh IL-2. Освежать среду каждые 3 дня до конца расширения клеток (День 14).

4. Иммунофенотипирование для оценки клеток CIK

1. Вымойте клетки CIK с 10 мл стерильных PBS. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г и 18-20 градусов по Цельсию, аспирируй супернатант и resuspend клетки с 10 мл PBS. Подсчитайте номер ячейки и жизнеспособность ячейки теста, используя анализ исключения trypan blue.
2. Aliquot клетки CIK в шесть стерильных труб 1,5 мл при плотности 5-10 х 10⁵ клеток / мл PBS. Этикетка и лечить следующим образом: Труба 1, Пустой (без антитела); Трубка 2, добавьте 20 зл изотипа IgG1-FITC; Трубка 3, добавить 20 зл изотипов IgG1-APC mAbs; Трубка 4, добавить 20 зл CD3-FITC; Трубка 5, добавить 20 зл и d56-APC mAbs; и трубка 6, добавить 20 зл CD3-FITC и 20 Зл CD56-APC mAbs.
3. Аккуратно перемешайте клетки CIK с антителами, аккуратно пайпетируя их вверх и вниз, по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки, а затем инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Центрифуга трубки в течение 10 мин при 300 х г и 18-20 градусов по Цельсию. Аспирируйте супернатант и приостанавливаете клетку гранулы один раз с 1 мл PBS. Аккуратно пайпет их вверх и вниз, по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки.
5. Повторите шаг 4.4.
6. Оставьте трубки в темноте перед циклометрическим анализом потока.

5. Распознавание маркеров CD

1. Перенесите суспензию клетки в стерильную 5 мл полистирола круглой нижней трубки с крышкой ситечко (100 мкм сетки) путем мягкого трубачерез через крышку. Поставьте трубки на карусель в порядок.
2. Откройте программное обеспечение для анализа цитометрии потока и создайте экспериментальную папку. Нажмите кнопку New Specimen, чтобы добавить образец и трубку к эксперименту и назвать трубы следующим образом: Tube 1, Blank; Трубка 2, Изотип IgG1-CD3; Трубка 3, Изотип IgG1-CD56; Трубка 4, CD3; Трубка 5, CD56; Трубка 6, CD3CD56.
3. Создайте систему рассеяния gating для популяций клеток CIK(Рисунок 2A).
   1. Выберите трубку 1 (Blank) и нажмите на кнопку Dot Plot, чтобы создать участок FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольник ворота над всей популяции клеток с FSC-A порога йgt;5 х 10^4, чтобы исключить мусор ауда.
   2. Выберите параметр SSC-A/SSC-H для нового точечного участка и нарисуйте многоугольные ворота вокруг всех одиночных ячеек. Выберите параметр Count/FITC (CD3) и Count/APC (CD56) для нового сюжета гистограммы соответственно. Выберите параметр FITC (CD3)/APC (CD56) для нового точечного участка и нарисуйте четыре квадранта для определения четырех субпопуляций.
   3. Запишите данные из 20 000 одиночных ячеек в каждом образце. Нажмите кнопку Load Sample, чтобы сначала проанализировать образец элемента управления Blank. Определите всю популяцию клеток CIK с помощью параметров канала CD56 и CD3.
4. Повторите шаг 5.3 для исследования всех образцов.
5. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, для анализа популяций клеток CIK и перепечатки их в файлы анализа.

6. Культирование и окрашивание хронических миелоидных клеток K562 и клеток рака яичников OC-3

1. Клетки K562
   1. Культура K562 клеток в полных носителях (RPMI базальной среде, содержащей 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) и 50 U/mL антибиотики и настроить глюкозу до 4,5 г/л) при плотности 0,5 х 1 х 10⁶ клеток / мл в колбу клеточной культуры и инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 "C и 5% CO₂.
   2. Перенесите культурные носители, содержащие клетки K562, в стерильные трубки 50 мл и гранулируйте клетки при 300 х г в течение 10 минут при 18–20 градусах По Цельсию в день эксперимента.
   3. Аспирируйте супернатант, resuspend клетки в 5 мл стерильных PBS, и хорошо перемешать осторожно.
   4. Пеллет клетки на 300 х г в течение 10 мин. Аспирировать супернатант, resuspend клетки в PBS, и настроить K562 клеток до концентрации 0,5-1 х 10⁶ клеток / мл.
   5. Добавьте 0,5 л красителя CFSE к 1 мл суспензии клеток K562 в стерильной трубке 15 мл при конечной концентрации 5 мкм. Аккуратно перемешать подвеску, пипетка вверх и вниз, по крайней мере 3x.
   6. Оставьте трубку в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 10-15 мин.
   7. Добавьте 9 мл PBS в трубку и гранулы клетки на 300 х г в течение 10 мин. Декант супернатант, а затем приостановить клеточной гранулы в 10 мл полных носителей. Перенесите суспензию клетки в колбу клеточной культуры и поместите в инкубатор.
2. Oc-3 клетки
   1. Культура OC-3 клеток в полных носителях (DMEM/ F12 среды, содержащей 10% FBS и 50 U/mL антибиотики) при плотности 0,5-1 х 10⁶ клеток в колбе клеточной культуры на 37 C и 5% CO₂.
   2. Аспирируйте культурные носители и мойте клетки PBS за 1 день до начала эксперимента.
   3. Отсоедините клетки, добавив 1 мл клеточного ферментного раствора(Таблица материалов)и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
   4. Приостановить клетки, добавив 5 мл PBS и хорошо перемешать осторожно. Пелле клетки на 300 х г в течение 10 минут и аспирации супернатант. Приостановите работу клеток в PBS и настроить клетки до концентрации 0,5-1 х 10⁶ клеток / мл.
   5. Добавьте 0,5 л красителя CFSE к 1 мл клеточной подвески OC-3 в стерильной трубке 15 мл при конечной концентрации 5 мкм. Аккуратно перемешать подвеску, пипетка вверх и вниз, по крайней мере 3x.
   6. Оставьте трубку в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 10-15 мин.
   7. Добавьте 9 мл PBS в трубку и гранулы клетки на 300 х г в течение 10 мин. Декант супернатант, а затем приостановить клеточной гранулы с полным испытуемым. Семена 5 х 10⁵ клеток / хорошо в 6 хорошо пластины и инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂ ночь.

7. Цитотоксический ассссе

1. Кокультура клеток CIK и K562 (CIK-K562)
   1. Подсчитайте клетки K562 со ступени 6.1.7 и проверьте жизнеспособность клетки, происните синий анализ исключения. Добавьте 1 мл клеток K562 к каждой скважине в6 скважине при плотности 5 х 10 5/мл.
   2. Добавить 1 мл базальной среды с или без клеток CIK от шага 3,4 до 6 хорошо пластины от шага 7.1.1 следующим образом: Ну 1 - Пустой, K562 клетки в одиночку (5 х 10⁵); Ну 2 - CFSE окрашенных K562 клетки в одиночку (5 х 10^5); Ну 3 - клетки CIK (E (эффектор), 25 x 10⁵) - окрашенные CFSE клетки K562 (T «цель», 5 x 10^5); Ну 4 - клетки CIK (E, 50 x 10⁵)
   3. Смешайте клеточные суспензии, аккуратно пайпетируя их вверх и вниз, по крайней мере 3x. Поместите тарелку в инкубатор на 24 ч.
2. Кокультура клеток CIK и OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Добавить 1 мл базальной среды с или без клеток CIK от шага 3,4 до 6 хорошо пластины от шага 6.2.7 следующим образом: Ну 1 - Пустой, OC-3 клетки в одиночку (5 х 10⁵); Ну 2 - CFSE окрашенных OC-3 клетки в одиночку (5 х 10⁵); Ну 3 - клетки CIK (E, 25 x 10⁵⁾- CFSE-окрашенные OC-3 клетки (T, 5 x 10^5); Ну 4 - клетки CIK (E, 50 x 10⁵⁾- CFSE-окрашенные OC-3 клетки (T, 5 x 10⁵).
   2. Смешайте клеточные суспензии, аккуратно пайпетируя их вверх и вниз, по крайней мере 3x. Положите тарелку в инкубатор на 24 ч.
3. 7-Аминоактиномицин D (7-AAD) окрашивание красителя
   1. Урожай CIK-K562 подвески ячейки от шага 7.1.3 непосредственно в 15 мл стерильной трубки.
   2. Урожай как подвески и адептов клетки из группы CIK-OC-3 от шага 7.2.2.
      1. Перенесите суспензию клетки в стерильную трубку 15 мл. Вымойте колодец с 1 мл стерильных PBS, собирать PBS, и добавить в трубку. Добавьте 0,5 мл раствора фермента диссоциации клеток и инкубируют в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
      2. Добавьте 1 мл раствора из той же трубки в соответствующую скважину и аккуратно перемешайте клетки, пополнив их вверх и вниз по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки. Соберите все клетки в одной трубке.
   3. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин, аспирируй супернатант и resuspend клетки в 1 мл стерильных PBS. Пеллет клетки на 300 х г в течение 10 минут, аспирации супернатант, и resuspend клеток в 100 л стерильных PBS.
   4. Добавьте в клеточный суспензию 5 кЛ 7-AAD красителя (50 нг/Л. Аккуратно перемешать клетки, пипетка их вверх и вниз, по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки. Инкубировать в течение 10 минут и оставить в темноте перед анализом.
4. Цитолитический ассикул
   1. Смешайте суспензию ячейки со ступени 7.3.4 и повторите шаги 5.1 и 5.2 один раз.
   2. Нажмите кнопку New Specimen, чтобы добавить образец и трубку к эксперименту и назвать трубки следующим образом: Трубка 1, K562 (или OC-3) клетки только; Трубка 2, CFSE окрашенных K562 (или OC-3) клетки только; Трубка 3, E:T - 5:1; Трубка 4, E:T и 10:1.
   3. Создайте систему рассеяния Gating для цитолитического асссе(Рисунок 3A).
      1. Выберите трубку 1 и нажмите на кнопку Dot Plot, чтобы создать участок FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольник ворота над всеми событиями с FSC-A порога йgt;5 х 10^4, чтобы исключить мусор аулаизм клетки.
      2. Выберите параметр SSC-A/CFSE для нового точечного участка. Выберите параметр 7-AAD/CFSE для нового точечного участка и нарисуйте ворота из четырех квадрантов, чтобы определить четыре субпопуляции.
      3. Нажмите кнопку Load Sample, чтобы сначала проанализировать пустой образец управления.
      4. Отрегулируйте напряжение SSC-A и FSC-A. Определите популяцию мертвых клеток с помощью параметров канала CFSE и 7AD. Запись данных из^клеток CFSE в каждом образце.
   4. Повторите раздел 7.4.6 для исследования всех образцов.
   5. Откройте файлы, содержащие статистические значения каждого отдельного образца, для анализа нежизнеспособных популяций ячеек и экспорта данных в файлы анализа.

Цель юристого протокола состоит в том, чтобы изолировать и расширить цитокин-индуцированных киллеров (CIK) Т-клеток из периферических моноцитов крови и оценить цитотоксический эффект CIK против гематологической злокачественности и твердых раковых клеток, соответственно. Индукция CIK была определена признанием CD3/CD56. На рисунке 1А показан протокол индукции и расширения CIK. Репрезентативные результаты стратегии gating для анализа субпопуляции CD3^иCD56^и Т-клеток от здоровых доноров иллюстрируются на рисунке 1B. На рисунке 1C показан статистический анализ доли CIK от трех особей.

Рисунок 2А показывает, что доля^клеток CD3^иCD56 (0,65% для оригинального PBMC, левой нижней панели и 27,4% для клеток CIK, собранных в день^14-й,правая нижняя панель) значительно увеличилась после 14 дней расширения. В нашей культурной системе, клетки CIK дали около половины сторазных изменений по сравнению с первоначальным числом PBMCs(Рисунок 2B).

На рисунке 3 показано цитотоксическое действие CIK против клеток хронического миелоидного лейкоза человека K562 и клеток рака яичников человека OC-3. Клетки K562 или OC-3 (цель, T) были окрашены нелюфлуоресцентным красителем (CFSE), который был расщеплён внутриклеточными эстеразами в жизнеспособных клетках, а затем стал высокофлуоресцентным красителем. В цитотоксическом исследовании кокультуры, CFSE окрашенных K562 или OC-3 клетки были cotreated с клетками CIK в течение 24 ч. В конце инкубации, общая клетка были собраны и окрашены 7-AAD краситель, который является нуклеиновой кислоты связывающей краситель, который используется в качестве зонда жизнеспособности для исключения мертвых клеток. Размер и детализация^клеток CIK и CFSE иллюстрируются на рисунке 3A. Окрашенные CFSE клетки K562 (целевые клетки, T) были совместно обработаны клетками CIK (эффекторные клетки, E) в соотношении E/T 0:1, 5:1 и 10:1, соответственно. Были оценены 7-AAD^- клетки CFSE^и K562. Статистические результаты были получены в результате трех независимых экспериментов. Базальная лиза означает процент клеточной смерти при отсутствии ээффекторных клеток (E:T и 0:1). На рисунке 3B показана очевидная цитотоксичность CIK против клеток OC-3 (E:T и 10:1) после 24 ч инкубации.

Рисунок 1: Диаграмма потока цитокинов индукции клеток-убийц и расширения. (A) PBMCs от согласия здоровых доноров были первоначально подвержены rhIFN-я (День 0), а затем rhIL-2, rhIL-1 ", и анти-CD3 mAb (День 1) каждые 3 дня (День 4). Впоследствии, среда была обновлена с rhIL-2-содержащих среды каждые 3 дня, и клетки были собраны на день 14. (B) Морфология клеток CIK в течение 7 дней индукции. Активация и расширение клеток CIK были проведены, как описано в протоколе. Клетки наблюдались под световым микроскопом в дни 1, 5 и 7, соответственно (увеличение 40x, шкала бар 200 мкм). (C)Количество клеток выполнялось еженедельно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Доля CD3^иCD56^и Т-клеток из репрезентативной выборки PBMC. (A) Лимфоциты были признаны по определенному размеру и детализации. Выбранная популяция одной ячейки для анализа цитометрией потока. (B) Статистический анализ эффективности расширения CIK от трех здоровых доноров был проведен с использованием t-теста (яп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Цитотоксические эффекты клеток CIK против хронического миелоидного лейкоза человека K562 и рака яичников человека OC-3 клеток. (A) После coculture с клетками CIK для 24 h, клетки цели K562 были узнаны и закрыты на основе окрашивания красителя CFSE. Квадрант иллюстрация общей популяции клеток под выбранным параметром 7-AAD/CFSE и кумулятивной цитотоксичности клеток CIK в указанном соотношении E:T. (B) Цитотоксический эффект клеток CIK против клеток OC-3 в соотношении E:T и 10:1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Описанный метод представляет собой быстрый, удобный и надежный протокол для изоляции и расширения цитотоксических цитокинов- индуцированных киллером (CIK) Т-клеток из цельных образцов крови здоровых доноров. Он также показывает цитотоксический эффект CIK против лейкемии (K562) и раковых клеток яичников (OC-3) с помощью системы цитометрии потока и отслеживания (CS и T) системы. Клетки CIK могут быть индуцированы и расширены в хороших мануфактурных практиках (GMP) условиях с помощью Цитокинов класса GMP и среды без сыворотки для дальнейшего клинического вливания^11. Тем не менее, эффективность ИНДукции и расширения CIK демонстрирует индивидуальные различия^12,13,14. Кроме того, безопасность является преимуществом вливания пациентов полученных клеток CIK для терапии раковых клеток. Было сообщено, что клетки CIK оказывают цитолитическое воздействие на эпителиальные твердые раковые клетки в основном в NKG2D-зависимым образом. В гематологических раковых клетках блокирование NKG2D с помощью специфического антитела значительно подавляет цитотоксичность, вызванную CIK, против клеток NKG2D-low K562; однако, это лечение не имеет никакого влияния на клетки HL-60, не имеющие NKG2D^15. Кроме того, клетки CIK проявляют меньшую активность в отношении клеток K562 по сравнению с клетками CD8^и CIK^16. В этом исследовании, мы обнаружили, что CIK выставлены больший цитотоксический потенциал против рака яичников OC-3 клеток по сравнению с лейкемией K562 клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что точные молекулярные механизмы, с помощью которых эффекторы CIK убивают опухолевые клетки, пока не ясны.

Отслеживание жизнеспособности целевых клеток и оценка цитотоксического потенциала клеток-эффектора с использованием цитометрии потока стала стандартным и обычным методом для клинического обследования^17. Было высказано предположение, что негативное влияние наблюдается на жизнеспособность клеток и выражение маркеров активации, таких как CD3^и населения в CFSE окрашенных лимфоцитов с потоком цитометрии^18,19. Таким образом, окрашивание целевых раковых клеток является более эффективной стратегией для оценки цитотоксического воздействия первичных клеток CIK. ИФН-З, ОКТ3 и Ил-2 являются основными цитокинов или стимуляторами для дифференциации и пролиферации CIK. Кроме того, другие факторы, такие как тимоголобулин, ИЛ-1, Ил-10, Ил-15, также являются стимуляторами. В настоящее время сыворотка человека, богатая тромбоцитами плазма и даже сыворотка крупного рогатого скота плода используются в качестве средних добавок, которые могут повысить пролиферацию клеток CIK. Хотя сыворотка или плазма обогащены питательными веществами и факторами роста, добавление аллогенных продуктов животного происхождения представляет источник, партии и много вариаций, которые приводят к экспериментальной изменчивости, и неизбежно смятение исследований с терапевтическими исходами для культивированных клеток. В этом исследовании мы использовали коммерчески доступные без сыворотки, без альбумина, и ксено-бесплатные GMP-класса средств массовой информации дополняется клинического класса цитокинов для успешной культуры клеток CIK. Недостатком использования ксено-свободных или аллогено-свободных добавок является то, что они снижают эффективность пролиферации клеток.

Двухцветные методы отслеживания клеток, предусмотренные в протоколах, независимо вычисляют жизнеспособные или мертвые клетки-цели-эффектора в прямом анализе цитотоксичности. В наших стратегиях gating, клетки cfSE^и целевые можно очевидно различить от клеток эффектора CIK(рисунок 3). Самое главное, процесс индукции и расширения CIK должен быть квалифицированным и показать высокую жизнеспособность. Для дальнейших вливания нескольких доз, состояние криоконсервации, и жизнеспособность и цитотоксичность после оттаивания, являются другими критическими проблемами. Фактическое соотношение конкретного лисиса равняется пропорции 100 x (%Образец лиза - %Базальный лиза)/(100 - % базальный лиза). В отличие от других исследований^18,20, рекомендуется, чтобы все целевые клетки быть исследованы, чтобы выявить точную и фактическую цитотоксичность клеток CIK.

В заключение, протокол, описанный в этом исследовании, предназначен для увеличения числа пБМК полученных клеток CIK от здоровых доноров и для оценки их цитотоксических функций против раковых клеток с двухцветными фотоактивируемыми зондами для селективного отслеживания клетки-мишени с помощью цитометрии потока с системой диагностики in vitro (IVD).

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих конфликтов финансовых интересов.

Это исследование было поддержано больницей Китайского медицинского университета (DMR-Cell-1809).