Method Article
Здесь мы представляем MATLAB реализации автоматизированного обнаружения и количественного описания липидных капель в флуоресценционной микроскопии изображения деления и подающий надежды дрожжевых клеток.
Липидный метаболизм и его регулирование представляют интерес как для фундаментальных, так и для прикладных наук о жизни и биотехнологии. В этой связи различные виды дрожжей используются в качестве моделей в липидных метаболических исследованиях или для промышленного производства липидов. Липидные капли являются высокодинамическими телами хранения, и их клеточное содержание представляет собой удобное считывание липидного метаболического состояния. Флуоресцентная микроскопия является методом выбора для количественного анализа клеточных липидных капель, так как он опирается на широко доступное оборудование и позволяет анализ отдельных липидных капель. Кроме того, микроскопический анализ изображений может быть автоматизирован, что значительно увеличивает общую пропускную мощность анализа. Здесь мы описываем экспериментальный и аналитический рабочий процесс для автоматизированного обнаружения и количественного описания отдельных липидных капель в трех различных видов дрожжей модели: расщепление дрожжей Schizosaccharomyces pombe и Schizosaccharomyces japonicus, и подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Липидные капли визуализированы с помощью BODIPY 493/503, а клеточный флуоресцентный декетр добавляется в культурные носители, чтобы помочь определить границы клеток. Клетки подвергаются 3D эпифлюоресценции микроскопии в зеленых и синих каналах и в результате z-стек изображения обрабатываются автоматически трубопровода MATLAB. Процедура выводит богатые количественные данные о содержании клеточных липидных капель и индивидуальных характеристиках липидных капель в табличном формате, пригодном для анализа вниз по течению в основных электронных таблицах или статистических пакетах. Мы предоставляем пример ы анализ содержания липидных капель в различных условиях, которые влияют на клеточный метаболизм липидов.
Липиды играют решающую роль в клеточной энергии и метаболизме углерода, синтезе мембранных компонентов и производстве биологически активных веществ. Липидный метаболизм дорабатывается в зависимости от условий окружающей среды, наличия питательных веществ и фазы1клеточного цикла. У людей метаболизм липидов был связан с такими заболеваниями, как ожирение, диабет II типа и рак2. В промышленности липиды, производимые микроорганизмами, такими как дрожжи, представляют собой перспективный источник возобновляемого дизельного топлива3. Клетки хранят нейтральные липиды в так называемых липидных каплях (ЛД). Эти эволюционно сохраненные тела состоят из триацилглицерола, стерилового эфира, внешнего фосфолипидного монослойного и связанных с ними белков1. ЛД возникают в эндоплазмической ретикулум, оказывают клеточного цикла или роста фазы динамики, и имеют важное значение для клеточного липидного гомеостаза1. LD номер и морфология может быть использован а также удобный прокси при анализе метаболизма липидов в различных условиях роста или при скрининге панели мутантов. Учитывая их динамичный характер, методы, способные анализировать свойства отдельных ЛД, представляют особый интерес в исследованиях липидного метаболизма.
Различные виды дрожжей были использованы для описания липидов связанных метаболических путей и их регулирования, или используется в биотехнологии для производства интересных соединений или топлива1. Кроме того, для модели дрожжей, таких как подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae или отдаленно связанных деления дрожжей Schizosaccharomyces pombe, генома всей удаления деформации библиотеки доступны, которые могут быть использованы для высокой пропускной вещи экраны4,5. Недавно состав и динамика LD были описаны в S. pombe6,7,8,9,и мутанты, связанные с липидным метаболизмом, были изолированы в новых дрожжах модели Schizosaccharomyces japonicus10.
Многочисленные методы доступны для изучения содержания и динамики Ld. Большинство используют какой-то окрашивания LDs с липофильных красителей, таких как Нил Красный или BODIPY 493/503. Последний показывает более узкое возбуждение и спектры выбросов, а также повышенную специфичность в отношении нейтральных липидов (ЛД), в отличие от фосфолипидов (мембран)11. Фторметрические и цитометрии потока методы были успешно использованы в различных грибковых видов, чтобы раскрыть гены и условия роста, которые влияют на содержание липидовхранения 12,13,14,15. Хотя эти методы подходят для высокопроизводительных приложений, они не могут измерять числа и морфологию отдельных ЛД в клетках, которые могут значительно отличаться между условиями роста и генотипами. Когерентное раганского рассеяния или цифровой голографической микроскопии являются без этикетки методами, которые дают данные ld-уровня, но требуют специализированного дорогостоящего оборудования16,17,18. Флуоресценция микроскопии, с другой стороны, может обеспечить подробные данные о содержании ЛД, используя при этом широко доступные инструменты и программные средства анализа изображений. Существует несколько аналитических рабочих процессов, которые имеют различные степени сложности и автоматизации в обнаружении ячеек/Ld из данных изображений, и оптимизированы для различных типов клеток, таких как метазоановые клетки с большими LDs19,20 , 21, или подающий надежды дрожжи17,22,23. Некоторые из этих подходов работают только в 2D (например, на максимальных проекционных изображениях), которые могут не описать достоверно содержание клеточного ЛП. Насколько нам известно, не существует инструментов для определения содержания ЛД и морфологии от деления дрожжей микроскопических данных. Разработка автоматизированного и надежного анализа на уровне ЛД обеспечит повышенную чувствительность и повышение статистической мощи, а также даст богатую информацию о нейтральном содержании липидов, в идеале в нескольких видах дрожжей.
Мы разработали рабочий процесс для анализа содержания ЛД из 3D флуоресцентной микроскопии изображений дрожжевых клеток. Клетки жизни окрашены С BODIPY 493/503 и Каскад Синий dextran для визуализации LDs и определить границы клеток, соответственно. Клетки обездвижены на стеклянных слайдах и подвергаются z-стек изображений с помощью стандартного эпифлюоресцентного микроскопа. Изображения затем обрабатываются автоматизированным конвейером, внедряемым в MATLAB, широко используемом (коммерческом) пакете для статистического анализа. Конвейер выполняет предобработку изображения, сегментацию (клетки против фона, удаление мертвых ячеек) и идентификацию LD. Богатые данные ld-уровня, такие как размер ЛД и интенсивность флуоресценции, затем предоставляются в табликовом формате, совместимом с основными программными средствами электронной таблицы. Рабочий процесс был успешно использован для определения влияния наличия источников азота на метаболизм липидов в S. pombe24. Теперь мы демонстрируем функциональность рабочего процесса в S. pombe, S. japonicus и S. cerevisiae, используя условия роста или мутанты, которые влияют на содержание клеточного LD.
1. Подготовка решений и средств массовой информации
2. Культивирование клеток
3. Липид капли окрашивания
4. Настройка микроскопа и визуализации
5. Анализ изображений
Вся процедура обобщена в рисунке 1 для дрожжей деления (подающий надежды дрожжей рабочий процесс является аналогичным), а ниже мы приведены примеры того, как рабочий процесс может быть использован для изучения содержания ЛД в трех различных видов дрожжей в различных условиях, известных повлиять на содержание сотовой ЛД. Каждый пример представляет собой единый биологический эксперимент.
Рисунок 1: Схематическая диаграмма экспериментального и аналитического рабочего процесса. В качестве примера приводится рабочий процесс для дрожжей деления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Во-первых, мы проанализировали S. pombe клетки(Рисунок 2). Дикий тип (WT; h С) клетки были выращены до экспоненциальной фазы либо в сложной среде YES или определенной среде EMM. По сравнению с YES, меньше LDs и выше LD окрашивания интенсивности на единицу объема клеток были обнаружены в EMM(рисунок 2A-C). Кроме того, отдельные LD, образованные в среде EMM, были крупнее и отображались повышенной общей интенсивности окрашивания(рисунок 2D,E). Это согласуется с предыдущими выводами о повышенном содержании липидов в клетках, выращенных в EMM24. Ген ppc1 кодирует фосфопантотенат-цистеин лигаза, необходимая для синтеза коэнзима А. Чувствительный к температуре ppc1-88 мутант показывает заметное снижение содержания ЛД при выращивании при ограничительной температуре31,что является примером клеток с низким сигналом BODIPY 493/503 (рисунок2A). Соответственно, по сравнению с диким типом (выращенным при 32 градусах Цельсия), меньшие ЛД с более низкой общей интенсивностью окрашивания были обнаружены в клетках ppc1-88, выращенных в ДА после перехода на 36 градусов по Цельсию(рисунок 2D,E), без каких-либо видимых изменений в номере LD на единица объема клеток(рисунок 2B).
Рисунок 2: Влияние роста носителей и мутации липидного метаболизма на содержание ЛД в S. pombe. Дикий тип (WT) и ppc1-88 клетки были выращены до экспоненциальной фазы в комплексе ДА или определены EMM среды, как указано. Клетки WT были выращены при 32 градусах Цельсия. Чувствительные к температуре ppc1-88 клетки были выращены при температуре 25 градусов по Цельсию и сдвинуты до 36 градусов по Цельсию в течение 2 часов до анализа. (A) Представитель необработанных микроскопических изображений LDs окрашенных с BODIPY 493/503. Для каждого состояния отображается один оптический срез; 10% наложения с перевернутым синим каналом было добавлено, чтобы лучше визуализировать границы клеток. Шкала бар No 10 мкм. (B) Количество выявленных LDs на единицу объема клеток. (C) Интенсивность флуоресценции выявленных ЛД на единицу объема клеток. (D) Распределение общей интенсивности флуоресценции всех выявленных LDs. (E) Распределение объемов всех выявленных LDs. Данные в группах B-E были получены из 242, 124 и 191 клеточных объектов для образцов WT YES, WT EMM и ppc1-88, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Далее, мы количественно содержание ЛД в S. japonicus клеток (чйmatsj-2017)32 из экспоненциальных и раннестационарных культур, выращенных в ДА (Рисунок3A). Клетки, входящие в стационарную фазу, показали заметное снижение количества ЛД на единицу объема клеток по сравнению с экспоненциально растущими клетками(рисунок 3B),в то время как интенсивность нормализованной ЛД флуоресценции несколько снизилась между двумя условиями ( Рисунок 3C). Ранние стационарные фазы LDs, как правило, умеренно больше по размеру и умеренно выше общей интенсивности флуоресценции по сравнению с LDs от экспоненциально растущих клеток (Рисунок 3D, E).
Рисунок 3: Содержание LD в S. japonicus клетки изменяются с фазой роста. Были проанализированы экспоненциально растущие (LOG) и ранние стационарные фазы (STAT). (A) Представитель необработанных микроскопических изображений LDs окрашенных с BODIPY 493/503. Для каждого состояния отображается один оптический срез; 10% наложения с перевернутым синим каналом было добавлено, чтобы лучше визуализировать границы клеток. Шкала бар представляет 10 мкм. (B) Количество выявленных LDs на единицу объема ячейки. (C) Интенсивность флуоресценции выявленных ЛД на единицу объема клеток. (D) Распределение общей интенсивности флуоресценции всех выявленных LDs. (E) Распределение объемов всех выявленных LDs. Данные в группах B-E были получены из 274 и 187 клеточных объектов для образцов LOG и STAT, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Наконец, мы проанализировали S. cerevisiae клетки широко используемого штамма лаборатории BY4741 (MATa his3'1 leu2'0 met15'0 ura3'0) выросли до экспоненциальной и стационарной фазы, соответственно, в сложной среде YPAD. Начинающие дрожжевые клетки обычно накапливают липиды для хранения при вступлении в стационарную фазу1,и мы смогли резюмировать эти выводы (рисунок4). Стационарные клетки содержали несколько меньше LD на единицу объема по сравнению с экспоненциально растущими клетками(Рисунок 4B),но их интенсивность фуорсценсценации LD почти удвоилась (рисунок4C). Это резкое увеличение общего содержания LD было связано с гораздо более высокой интенсивностью флуоресценции и объем отдельных LDs в стационарной фазе(рисунок 4D, E).
Рисунок 4: Содержание LD в S. cerevisiae клетки изменяются с фазой роста. Были проанализированы экспоненциально растущие (LOG) и стационарные фазы (STAT). (A) Представитель необработанных микроскопических изображений LDs окрашенных с BODIPY 493/503. Для каждого состояния отображается один оптический срез; 10% наложения с перевернутым синим каналом было добавлено, чтобы лучше визуализировать границы клеток. Шкала бар представляет 10 мкм. (B) Количество выявленных LDs на единицу объема ячейки. (C) Интенсивность флуоресценции выявленных ЛД на единицу объема клеток. (D) Распределение общей интенсивности флуоресценции всех выявленных LDs. (E) Распределение объемов всех выявленных LDs. Данные в группах B-E были получены из 430 и 441 ячеек объектов для образцов LOG и STAT, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таким образом, наш аналитический рабочий процесс может обнаружить изменения в содержании ЛД, размера и содержания липидов в трех различных и морфологически различных видов дрожжей в различных условиях, которые положительно или отрицательно влияют на содержание клеточного ЛД.
Понимание липидного метаболизма и его регуляции имеет важное значение как для базовой биологии, так и для клинического и биотехнологического применения. Содержание ЛД представляет собой удобное считывание состояния липидного метаболизма клетки, при этом флуоресцентная микроскопия является одним из основных методов, используемых для определения содержания ЛД. Представленный протокол позволяет автоматизированное обнаружение и количественное описание отдельных ЛД в трех различных и морфологически различных видов дрожжей. Насколько нам известно, подобных инструментов для расщепления дрожжей не существует. Скрипты MATLAB, необходимые для обработки изображений, включены в качестве дополнительных файлов, а также доступны в репозитории Figshare (DOI 10.6084/m9.figshare.7745738) вместе со всеми необработанными и обработанными изображениями и табулярными данными из этой рукописи, подробные описания выводных файлов CSV и R-скриптов для анализа и визуализации данных ниже по течению. Также последняя версия скриптов MATLAB доступна на GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).
Успешный анализ ЛД во многом зависит от качества полученных изображений с флуоресценцией. Для оптимальной работы алгоритмов сегментации для микроскопии следует использовать чистые стеклянные горки, лишенные частиц пыли, клетки должны образовывать монослой (фактическое количество клеток на поле зрения не является критическим параметром) и не должны содержать большую долю мертвых клеток. Кроме того, z-stack изображения должны начаться немного ниже и конец немного выше клеток. В зависимости от конкретной микроскопической настройки пользователям может потребоваться настроить некоторые параметры в скриптах обработки изображений (например, "th" для порога интенсивности фона изображения). В то время как текущий метод способен обнаруживать и описывать отдельные LD в сегментированных объектах ячейки, рабочий процесс не производит действительно одноклеточных данных из-за трудностей с автоматизированным разделением всех отдельных ячеек. Вместо этого сообщается о содержании LD на единицу объема клеток, обобщенных для всей выборки. Это ограничение может препятствовать интерпретации данных при анализе неоднородных популяций клеток. Кроме того, следует соблюдать осторожность при работе с клетками с измененным транспортом малых молекул (например, мутантов насоса efflux), так как это может повлиять на внутриклеточную концентрацию BODIPY 493/503 и окрашивание ЛД, как это наблюдается в виде липофильных красителей Нила Красных33 , 34.
Окрашивание среды с клетками непроницаемой Каскад Синий флуоресцентный декесцент является удобным способом отличия клеток от фона35, которые могут быть применены ко многим (если не все) дрожжей видов. Он также помогает с автоматизированным удалением мертвых клеток от анализа, поскольку они станут синими при окрашивании. Любые умирающие или больные (и, следовательно, частично проницаемые для декстран) клетки, обнаруженные как живые, могут быть удалены в ходе шагов анализа данных, основанных на значении "IntensityMedianBlue" обнаруженных клеток. В принципе, весь рабочий процесс может быть использован для обнаружения различных других клеточных структур, таких как очаги репарации ДНК, при условии, что структуры могут быть помечены подходящими флюорофорами. Рабочий процесс также должен быть применим к клеткам других (дрожжевых) видов, что еще больше расширяет его полезность.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Чарльзуниверситет гранты PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 и SVV 260310. Мы благодарим Ондржея Зебеста за помощь в микроскопии и разработке конвейера анализа изображений. Мы благодарим лабораторию ReGenEx за штаммы S. cerevisiae, а также лабораторию JapoNet и Хиронари Ники за штаммы S. japonicus. Ppc1-88 штамм был предоставлен Дрожжи генетический ресурсный центр Японии. Микроскопия проводилась в Лаборатории конфокальной и флуоресценцийной микроскопии, совместно финансируемой Европейским фондом регионального развития и государственным бюджетом Чешской Республики (Проект No. К.1.05/4.1.00/16.0347 и КЗ.2.16/3.1.00/21515).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
D-(+) - Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
Pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
Standard office computer capable of running MATLAB | |||
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены