Perfusable сосудистая сеть с моделью ткани в устройстве Microfluidic

Протокол описывает инженер perfusable сосудистой сети в сфероида. Окружающие микроокружения сфероида разрабатывается побудить ангиогенеза и подключить сфероида к микроканалов microfluidic устройства. Метод позволяет перфузии сфероида, который является долгожданный технику в трехмерном культур.

Сфероиде (многоклеточных совокупности) рассматривается как хорошая модель живых тканей в организме человека. Несмотря на значительные улучшения в культурах сфероида perfusable сосудистой сети в сфероидов остается важнейшей задачей для долгосрочной культуры, необходимо поддерживать и развивать их функции, такие как выражения протеина и морфогенеза. Протокол представляет новый метод для интеграции perfusable сосудистой сети в пределах сфероида microfluidic устройства. Чтобы побудить perfusable сосудистой сети в сфероида, ангиогенных ростки, подключенных к микроканалов на сфероиде руководствовались используя ангиогенных факторов от человеческих легких фибробластов, культивируемых в сфероида. Ростки ангиогенных достиг сфероида, объединилась с эндотелиальных клеток, совместно культивируемых в сфероида и формируется непрерывный сосудистой сети. Сосудистой сети может perfuse интерьер сфероида без какой-либо утечки. Сконструированный сосудистой сети может далее использоваться в качестве маршрута для поставки питательных веществ и удаления отходов, имитируя циркуляцию крови в vivo. Этот метод предоставляет новую платформу в культуре сфероида сторону лучше перепросмотре живых тканей.

Переход от монослойном культивировании (двухмерный) к трехмерной культуре мотивируется необходимость работы с моделями культуры, которые имитируют клеточных функций живых тканей^1,2,3. Плоские и жесткие пластиковые субстраты, широко используется в культуре клеток не напоминают большую часть внеклеточных средах в человеческом теле. В самом деле многие исследования показывают, что трехмерная культуры воссоздать ткани конкретных архитектуры, механические и биохимических подсказки и связи ячеек, которые не наблюдались в обычных двумерных культуры^{4, 5,6,,78}.

Мультиклеточные агрегат или сфероида, является одним из наиболее перспективных методов для реализации этой трехмерной культуры^9,10. Клетки секретируют внеклеточного матрикса (ECM) и может взаимодействовать с другими в сфероида. Хотя некоторые другие биоинженерии подходы^11,12,13,14, например, клеток укладки, успешно реплицировать пространственная сложность человеческого тела, эти подходы имеют только два или три виды клеток для облегчения анализа и сосредоточены на только одной функции органов-мишеней. В отличие от клеток в сфероидов подвергаются различные культуры среды в зависимости от их позиции в сфероида из-за разнородных поставки питательных веществ и кислорода и паракринными Аутокринный сигнальных молекул в сфероида. Эта особенность сфероидов частично имитирует в естественных условиях состояния культуры и включить клетки в сфероидов для создания гораздо более сложной, организованной ткани структуры в vitro чем те, которые культивировали в укладки ткани^{9, 15 , 16}. Обратите внимание, что если сфероиде состоит из одного вида клеток, функции клеток в сфероида не равномерное вследствие неоднородной среды в сфероида. В последние несколько лет сфероиде культур позволило эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) или ткани резидентов стволовые клетки, чтобы имитировать в естественных условиях развития последовательностей и воссоздать мини органы как мозг¹⁷, печени¹⁸и почек^19,20.

Несмотря на значительный прогресс в сфероида культуры техники по-прежнему проблематично культивирования большой сфероидов долгое время. В трехмерные ткани клетки должны быть расположены в пределах 150-200 мкм кровеносного сосуда из-за ограниченное количество кислорода и питательных веществ,²¹. Сосудистой сети в пределах сфероида необходимы для пилки обмена веществ между кровью и тканями в естественных условиях. Для достижения этой цели, другие группы совместно культивируемых эндотелиальных клеток с целевой ячейки^22,,2324 или индуцированной дифференцировка плюрипотентных клеток в CD31-положительных клеток²⁰. Тем не менее сообщил корабля как структуры не имеют открытые концы lumina на поставку кислорода и питательных веществ в центр сфероида. Чтобы имитировать сосудистой роль питают клетки в трехмерном культуре, открытого и perfusable сосудистой сети должны разрабатываться в сфероида.

В течение последних нескольких лет некоторые исследовательские группы в поле микротехники сообщили методы построить perfusable сосудистой сети, спонтанно формируется в устройстве microfluidic используя ангиогенных факторов от cocultured фибробластов клетки^{25 ,26}. Эти сосудистой сети имеют аналогичные морфология с их коллегами в естественных условиях и может быть перестроен факторами окружающей среды, что делает их пригодными для подражая сосудистой функции в культуре сфероида. Цель настоящего Протокола заключается в строительстве perfusable сосудистой сети в сфероида, используя microfluidic платформа²⁷. Microfluidic устройство изменяется от ранее сообщалось устройство²⁵ , так что сфероиде могут быть включены. Направляя ангиогенных секреции от клетки фибробластов в сфероиде эндотелиальных клеток в микроканалов, ангиогенных ростки от микроканалов, анастамозные с сфероида и сформировали perfusable сосудистой сети. Этот метод позволяет прямой поставкой широкого круга веществ, таких как флуоресцентных молекул и микрометр шкала бусины в интерьер сфероиде, который обеспечивает основу для долгосрочной культуры ткани с сосудистой сети.

1. Изготовление прессформы Microfluidic устройства

1. Дизайн-шаблон microfluidic устройства с использованием имеющегося программного обеспечения (Clewin5 или AutoCAD 2016, и т.д.). Для функции Clewin5 смотрите руководство пользователя (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
   Примечание: Файл дизайн доступен в дополнительных файлов 1.
2. Перенесите файл дизайн микро модель генератора и загрузить инструмент с маской хром покрытием с позитивного фоторезиста.
3. Разоблачить позитивного фоторезиста в области шаблон, с помощью микро модель генератора.
4. Развитие позитивного фоторезиста, используя разработчик (Таблица материалов) и промойте маску с дейонизированной водой (DI).
5. Использование хрома etchant (Таблица материалов), etch хрома в пораженном участке, где был удален позитивный фоторезист. Смыть маску водой ди.
6. Удалите оставшиеся фоторезиста на маску с помощью ацетона.
   Примечание: Маски прозрачности может быть альтернативой для Cr маски.
7. Подготовьте чистую кремниевой пластины (4 дюйма, P(100)) и спин пальто Гексаметилдисилазан (ГМДО) при 3000 об/мин за 30 s.
8. Softbake HMDS 5 мин при 120 ° C и прохладный пластины для 5 мин при комнатной температуре.
9. Spincoat негативного фоторезиста (таблица материалов) на 500 rpm для 10 s и 1200 об/мин за 30 s.
   Примечание: Состояние покрытия спина должна принести слоёв фоторезиста с толщиной примерно 100 мкм на пластинах после фотолитографии.
10. Prebake негативного фоторезиста для 45 мин при 95 ° C и прохладный вафельные для 60 мин при комнатной температуре.
11. Проверка интенсивности света в каждом эксперименте и рассчитать время экспозиции для общей экспозиционной дозы энергии на 250 МВт/см². Место фотошаблонов (шаг 1.1-1.6) на пластины и подвергать их УФ-излучения.
12. Postbake негативного фоторезиста за 1 мин при температуре 65 ° C и 5 мин при 95 ° C. Разрешить вафельные остыть в течение 1 мин при комнатной температуре.
13. Разработка слой негативного фоторезиста для 15 мин в первой ванной разработчик (Таблица материалов) и 2 мин в втором баня. Промойте пластины в первой ванной изопропиловый спирт (IPA) для 10 s и второй ванной АПИ для 10 s.
14. Hardbake негативного фоторезиста на 30 минут при 200 ° C и прохладный пластины для 5 мин при комнатной температуре.
15. Измерьте толщину слоя негативного фоторезиста, используя профилировщик поверхности.
16. Поместите пластины в эксикатор, подключенных к вакуумного насоса и 200 мкл силана (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Включите насос за 10 мин, затем выключите его и держите пластины в эксикатор для 4 ч.

2. Изготовление шаги и Ассамблея PDMS слоев

1. Литой полидиметилсилоксан (PDMS) предварительно полимера (PDMS база: Вулканизирующий агент = 10:1 (w/w)) и Дега в вакуумной камере за 2 ч.
2. Лечение PDMS при 80° C в воздух вентилируемые печи на ночь.
3. Отделите PDMS из кремниевой пластины.
4. Пробейте отверстия 1A - 3B (рис. 1) и культура сфероида хорошо. Используйте удар диаметром 2 мм для отверстий 1A - 3B и диаметром 1 мм удар для сфероида хорошо.
5. Очистите плиты PDMS и стекла Крышка выскальзования (24 × 24 мм) с клейкой лентой, неоднократно наклеивания и отшелушивающим ленты. Затем обработать PDMS плиты с воздуха плазмой для 40 s (40 МВт, 50 sccm).
6. Бонд PDMS плиты на стекла Крышка выскальзования высылать воздушные пузыри от поверхности между PDMS плиты и крышка выскальзования и лечения при 80 ° C в течение 12 часов.

3. сфероида подготовка

Примечание: В исследовании, красный флуоресцирующий белок, выражая человеческие пупочной вены эндотелиальных клеток (ППК-HUVECs) и выражая Зеленый флуоресцирующий белок HUVECs (GFP-HUVECs) используются в сфероида и микроканалов, соответственно, чтобы отличить происхождение HUVECs после строительства perfusable сосудистой сети. Если происхождение HUVECs не нужна, неподписанном HUVECs являются достаточно для эксперимента.

1. Оттепель ЗП-HUVECs (3.0 × 10⁵ клеток/флакона) и легкое человека фибробластов (hLF) (1.0 × 10⁶ клеток/флакона) и добавить их в 10 мл среды для эндотелиальные клетки и клетки фибробластов, соответственно (Таблица материалов). Культура их в 100-мм блюдо на 37 ° C и 5% CO₂ на 2-3 дней для югу вырожденная ЗП-HUVECs и hLFs. Эта подготовка будет выход ~ 200 сфероидов.
2. Отсоединить ЗП-HUVECs и hLFs из блюд с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и остановить трипсина реакции с 4 мл DMEM, содержащие 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина.
3. После центрифугирования в 220 g x 3 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте ЗП-HUVECs и hLFs в эндотелиальных средне окончательный клеток концентрации на 2,5 × 10⁴ и 1.0 × 10⁵ кл/мл, соответственно.
4. Аккуратно добавьте 200 мкл суспензии клеток (5000 ячейки для ЗП-HUVECs) и 20 000 hLFs на хорошо в 96-луночных плита с ультра-низким привязки поверхностью.
5. Инкубируйте 96-луночных пластины при 37 ° C и 5% CO₂ в течение 2-4 дней.
   Примечание: Поскольку сфероида диаметр зависит от культуры периода и первоначальный мобильный номер в 96-луночных пластины, он может управляться этими двумя параметрами.

4. клетки посева в Microfluidic устройства

Примечание: Именования для отверстия, каналы и сфероида хорошо демонстрируются на рисунке 1. Мы определяем день 0 как день, когда ячейка уборки в устройство microfluidic закончена. Схема экспериментальной график показан на рисунке 2.

1. Загрузка сфероида день −1)
   Примечание: Следующий шаг должен выполняться на льду для предотвращения гелеобразования коллагена и фибрином.
   1. Растворите фибриногена в фосфатный буфер (PBS) для окончательного концентрации 2,80 мг/мл.
   2. Подготовьте нейтрализованы коллагена (3,0 мг/мл в PBS) согласно протоколу производителя.
   3. Объедините 107.2 мкл раствора фибриногена (2,80 мг/мл), 8.0 мкл нейтрализованы коллагена (3,0 мг/мл) и 3.6 мкл Апротинин (5 ед/мл) в реакции в трубку. Это решение обозначено как «мастер смесь решение» (МС).
      Примечание: Объем достаточен для загрузки одним сфероид. Если имеется более одного сфероида, умножьте количество сфероидов каждого тома.
   4. Растворите тромбина в PBS для конечной концентрации 50 ед/мл.
      Примечание: Аликвоты 50 ед/мл тромбина (20 мкл/трубка) хранятся в −30 ° C и разморожен перед каждой эксперимент.
   5. Место пластину 96-луночных, содержащий сфероидов внутри шкафа биобезопасности.
   6. Подготовьте два Петри 35-мм внутри шкафа, с одно блюдо на льду (1 блюдо) и другое блюдо на benchtop (блюдо 2) биобезопасности. Накапайте 99 µL из MS в центре блюдо 1 (рис. 3a) в форме капли.
   7. Обрежьте кончики 2 желтый (10-100 мкл) и 3 Очистите наконечники (1-100 мкл) для сбора сфероидов от 96-луночных пластины, смешивая тромбина с МС, точные коллекции сфероидов, впрыскивать сфероидов в устройство и инъекционных средств массовой информации в устройство , соответственно. Размер пор кончика должно быть немного больше, чем диаметр отверстия 1A - 3B каналов 1 и 3 или сфероида хорошо в канале 2 для snug вписывается.
      Примечание: Далее, если не указано иное, используйте пипетку советы, сократить в этом шаге. Фотография среза советы доступны на рисунке 4.
   8. Собирать сфероиде с 100 мкл среды от 96-луночных пластины и добавить его в блюдо 2 (рис. 3a).
   9. Подберите сфероида с минимальным объемом средств массовой информации из блюдо 2. Удерживая дозаторов вертикально, сфероида должен двигаться в направлении нижней части кончика пипетки самотеком. Сфероида выкинуть прикоснувшись наконечник пипетки на мениск MS капелька в блюдо 1 (рис. 3a).
      Примечание: Следующие шаги 4.1.10 & 4.1.11 должны выполняться быстро.
   10. 1 мкл тромбина (50 ед/мл) и перемешать аккуратно с кончик желтый пипетки.
   11. С пипеткой, равным 7 мкл подобрать сфероида и медленно, поместите его в скважину сфероида (рис. 3b).
   12. Инкубируйте 15 мин при 37 ° C для гелеобразования фибрина.
   13. Медленно вводить эндотелиальной среднего от отверстия 1A и 3A и заполнить каналы 1 и 3 с СМИ (20 ~ 30 мкл/канал).
   14. Поместите устройство в 100-мм блюдо с мокрой Kimwipe для предотвращения испарения СМИ от устройства (рис. 3 c).
   15. Поместите устройство на 37 ° C и 5% CO₂ для 24 h удалить пузырьки на стыке между СМИ и фибрином.
2. HUVECs день 0) Загрузка
   1. Оттепель GFP-HUVECs (3,0 x 10⁵ клеток/флакона) и добавить их в 10 мл эндотелиальной среды. Культура их в тарелку 100-мм при 37 ° C и 5% CO₂ на 2-3 дней, чтобы достичь суб confluency. Одно блюдо югу вырожденная GFP-HUVECs достаточно для приготовления 8-10 устройств.
   2. Отсоединить GFP-HUVECs из блюд с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и остановить трипсина реакции с 4 мл DMEM, содержащие 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина.
   3. После центрифугирования в 220 g x 3 мин Ресуспензируйте GFP-HUVECs в среде эндотелиальной 5.0 x 10⁶ клеток/мл.
   4. Инъекционные суспензии клеток HUVECs в канал 1 через отверстие 1B (20 мкл/канал).
   5. Наклоните устройство microfluidic 90°, поместите его на стороне и инкубировать при 37 ° C за 30 минут, чтобы обеспечить соблюдение HUVECs фибрина в канале 2.
      1. Подтвердите вложение HUVECs на фибрин. Когда количество HUVECs, придает на стыке между гелем и среднего не является достаточным, сосудистую может быть отключен в корне сосудистых после нескольких дней культуры устройства (рис. 5). В протоколе, успех перфузии составляет > 50%.
   6. Повторите шаги 4.2.4 и 4.2.5 для канала 3.
   7. Культура клетки в 100-мм блюдо с влажной Kimwipe при 37 ° C и 5% CO₂ на 7-14 дней.
3. День 1 ~) Обмен СМИ
   1. Обмен половина средств массовой информации в каналах 1 и 3 каждый день.

5. окрашивания ядер

1. Подготовьте параформальдегида 4% (PFA) в PBS.
2. Извлеките из каналы 1 и 3 и 20 мкл 4% PFA на канал. Чтобы заменить решение в 4% PFA, повторить удаление решения из устройства и добавление 4% PFA три раза.
3. Инкубируйте устройство на 4 ° C на ночь.
4. Удалите 4% PFA от устройства и мыть каналы три раза с PBS.
5. 20 мкл 10 мкг/мл Люминесцентную краску (Таблица материалов), на канал пятно клеточных ядер. Для обмена решение в устройство, повторите удаление решения из устройства и добавление 10 мкг/мл Люминесцентную краску три раза.
6. Храните прибор при температуре 4 ° C на 24 часа.

6. жидкости перфузии сфероида

1. Подготовьте сфероида после культивирования для более чем 7 дней в устройстве при 37 ° C и 5% CO₂ для завершения непрерывной сосудистые пути.
2. Удалите носитель из отверстия 1A, 1B, 3A и 3B.
3. Ввести 10 мкл 10 мкм решения флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстрана в PBS в отверстия 1A и 1B.
4. Мониторинг потока микрошарики или FITC краска под инвертированным микроскопом.

7. Количественная оценка длины Росток

Примечание: ImageJ ver. 1,49 программное обеспечение используется для анализа изображения в этом исследовании.

1. Перекрытие изображений GFP-HUVECs дней, 0, 1, 3, 5 и 7.
2. Вычтите положение кончика сосудистую день 0 из той же позиции на снимки, сделанные на 1, 3, 5 и 7 дней.
3. Определите рост сосудов подсказка от корневого позиции (рис. 6). Расстояние между сосудистой наконечник и корень был определен как длина прорастают в этом исследовании (рис. 7b).

8. Количественная оценка сосудистой углов

Примечание: Сосудистая угол был определен как угол состояла сосудистой угол, корень и центр сфероида (рис. 7 c).

1. Бинаризация флуоресцентного изображения coculture сфероида, содержащих ЗП-HUVECs и измерить положение «центр тяжести», функции анализа в ImageJ. В этом исследовании измеренные «центр тяжести» положение определяется как центр сфероида (рис. 6).
2. Определите положение сосудистой советы и корни в так же, как в шаге 7.
3. Измерьте сосудистой углов с помощью функции анализа в ImageJ программного обеспечения.

Рисунок 1 показывает, Дизайн и фото microfluidic устройства. Она имеет три параллельных каналов, в котором канал 2 содержит сфероида хорошо. Для культуры HUVEC используются каналы 1 и 3 и 2 канал для сфероида. Каждый канал отделяется трапециевидной microposts предназначен шаблон PDMS. Microposts предотвратить гидрогеля на канале 2 от утечки в каналах 1 и 3, поверхностное натяжение и позволяют обмена веществ между сфероида и HUVECs в микроканалов²⁸.

7а Рисунок показывает центр microfluidic устройства после заполнения ячейки. Яркие области и флуоресцентных изображений, снятых в день 0 показывают, что фибрина Гель заполнены только канал 2 без какой-либо утечки в каналы 1 и 3, и HUVECs успешно подключился к боковине гель фибрина. Светлые области изображения находится в фокусе на обоих загруженного сфероида и microposts, указав, что сфероида должным образом урегулирован в нижней части устройства. Ростки ангиогенных наблюдаются на 1 день и длина проростков увеличивается с течением времени (рис. 7b). На 3 день длинный Росток достиг сфероида, и на 7 день, большая часть ангиогенных ростки достигла сфероида (среднее расстояние от каналы 1 и 3 на сфероиде < 500 мкм). В лучшем случае после 4 дней в культуре устройства, можно наблюдать поток через сосудистые люмен. Сосудистые угол был определен как направления кончик сосудистой и центр сфероида от сосудистых корня. Рисунок 7 c показывает количественных сосудистой угол во время 7 дней в культуре устройства. Сосудистая углы сократилась в зависимости от времени, указывающее, что ростки ангиогенных мигрировали к сфероида.

Рисунок 8 показывает раздел сосудистой сети, где слились ЗП-HUVECs и GFP-HUVECs. ЗП-HUVECs и GFP-HUVECs соответственно сформировали единый сосудистой люмен как показано стрел, который четко указывают ангиогенных ростки от каналы 1 и 3, анастамозные для ЗП-HUVECs в сфероида и сформировали непрерывной сосудистой сети. Для подтверждения perfusability сосудистой сети, FITC-декстран было впрыснуто в канал 1. FITC-декстрана в канале 1 пропустило в построенных сосудистой сети и интерьер сфероида и наконец достигли канал 3 (рис. 9). Во время перфузии FITC-декстран решения нет никакой утечки из сосудистой сети в внесосудистой пространства. Ранее было показано, что малые молекулы, вводят в просвете сосудов проходят через сосудистую стенку и реагировать с клетками в внесосудистой регионах. Кроме того коэффициент проницаемости сосудистой сети было показано рядом что в естественных условиях²⁷. Эти результаты подразумевают что интегрированной сосудистой сети может поставлять питательные вещества для сфероида и удаления отходов продукта.

Рисунок 1 : Дизайн и фотография устройства microfluidic. a обзор дизайн microfluidic устройства. Серая область указывает три microfluidic каналы, разделенные трапециевидной microposts. Канал 2 имеет хорошо сфероида культуры. Правом рисунке показано увеличенное изображение в красный прямоугольник в левом. (b) фотография microfluidic устройства, чьи каналы заполнены с красными чернилами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Экспериментальная время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Метод для загрузки в устройство microfluidic сфероида. a обеспечения падение MS и СМИ с сфероиде в двух отдельных блюд. Затем перевести сфероида на MS с тромбина. (b) Схематический разрез устройства во время инъекции сфероида. Избыточное количество геля вытекает через отверстия 2A и 2B. Однако сфероида остается в нижней части устройства из-за физической изоляции. (c) схема устройства, когда они находятся в инкубаторе. Мокрые Kimwipe был помещен в блюдо 100-мм и два блюда 35-мм с устройством были поставлены на Kimwipe. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Фотографии наконечники вырезать для посева на устройство ячейки. Левый белый кончик предназначен для отверстия 1A, 1B, 3A и 3C и передачи сфероида капля геля фибрина (шаги 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 и 4.2.6). Средний Желтый наконечник предназначен для коллекции сфероида от 96-луночных (шаг 4.1.7). Право белым кончиком предназначен для хорошо сфероида (шаг 4.1.11). Советы перед вырезать также показан на фотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Non-perfusable сосудистую. Ангиогенных ростки от микроканалов не удалось подключиться к открытию между microposts и потерял связь между люмен и микроканалов (черные стрелки). Это вызвано недостаточной HUVECs посеяны в каналах 1 и 3. Красный: ППП-HUVECs в сфероида, зеленый: GFP-HUVECs от микроканалов. Клетки были культивировали в устройстве на 14 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Определение сосудистой корень, наконечник и центр сфероида. () метод для определения позиции сосудистой корня и наконечник, чтобы измерить длину прорастают. После пристрелки покадровой флуоресцентного изображения, флуоресцентный изображение, принятое за несколько дней после культивирования в устройстве вычитается в изображении на день 0. Мы измерили длину ростки после вычитания ImageJ программного обеспечения. (b) определение центр сфероида. Флуоресцентного изображения ЗП-HUVECs binarized и измеряется в ее центр тяжести ImageJ программного обеспечения. Мы определяем центроид как центр сфероида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Формирование сосудистой сети в устройстве microfluidic. (a) промежуток времени изображения центра microfluidic устройства после заполнения ячейки. Красный: ППП-HUVECs культивировали в сфероида, зеленый: GFP-HUVECs собирают в каналах 1 и 3. Количественный анализ Росток Длина (b) и сосудистой угол (c) (n = 42 ростки в 3 устройств, погрешностей указывают стандартные ошибки (ФБ)). Росток длина был определен как расстояние от позиции HUVECs в день 0 сосудистой оконечности (b, сверху). Угол (∠TRS) определяется сосудистой корень (R), наконечник (T) и центр сфероида (S) (c, сверху). Для определения сосудистой корень, подсказки и центр сфероида см. Рисунок 6 . Эти данные были получены с помощью ImageJ программного обеспечения. Схемы, объясняя определение длины прорастают и сосудистой угол изменяются от Насимото, ю. и др. ²⁷. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8 : Формирование сосудистой люмен микроканалов и сфероида, HUVECs. () флуоресцентных изображение обзор образца после 14 дней в культуре устройства. Желтый прямоугольник указывает позицию x-y оптических секции показано в пункте (b). (b) x-y, y-z и x-z оптических Секция сконструированный сосудистой сети. Белые стрелки указывают просвета сосудов. Красный: ППП-HUVECs культивировали в сфероида, зеленый: GFP-HUVECs культивировали в микроканалов, синий: клеточных ядер. () показывает не голубой флуоресценцией, потому что (а) представляет собой изображение до фиксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9 : Перфузии сфероида, с использованием сконструированного сосудистой сети. Яркие области (а) и флуоресцентные (b) изображения сфероида после 7 дней в культуре устройства. (c) флуоресцентного изображения же сфероида после FITC-декстрана (70 кДа) загрузки. Красный: ППП-HUVECs в сфероида и каналы 1 и 3, зеленый: FITC-декстрана, синий: клеточных ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: дизайн устройства microfluidic. Файл находится в формате dxf. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Предыдущие доклады показывают, что hLFs выделяют коктейль из нескольких ангиогенных факторов, таких, как Ангиопоэтин-1, Ангиогенин, фактора роста гепатоцитов, превращая фактор роста α, фактора некроза опухоли и некоторые внеклеточного матрикса белки^{29, 30}. Этот assay полагается на секрецию ангиогенных из hLFs в coculture сфероиде, который является ограничение техники. Таким образом крайне важно для формирования стабильной сосудистой установить сфероиде coculture в нижней части хорошо, таким образом, чтобы расстояние между сфероида coculture и HUVECs в каналах 1 и 3 может быть сокращен. Сосудистые длиной от фибробластов был обратно пропорциональна расстоянию между эндотелиальных клеток и фибробластов³¹, так что короче расстояние является выгодным для стабильного формирования сосудов. Однако чтобы открыть отверстие сфероида (1 мм в диаметре) без повреждения каналы 1 и 3, минимальная ширина канала 2 был 1,5 мм.

Хотя сфероида оседает на дне колодца, сосудистая корни иногда были отключены от microposts или микроканалов (рис. 5). В этом случае не реагент может достичь сосудистой люмен через микроканалов (каналы 1 или 3). Хотя мы не могли решить эту проблему полностью, мы предполагаем, что эта проблема обусловлена недостаточное количество HUVECs на поверхности геля фибрина (шаг 4.2.1-4.2.6). Убедитесь, что HUVECs стабильно Прикрепите боковой стенке канала 2.

К успешным инъекций сфероиде в колодец, оптимизировать внутренний и наружный диаметр микропипеткой советы на шаге 4.1.7 имеет важное значение: 1) внутренний диаметр должен быть больше, чем сфероида. 2 Наружный диметр должны соответствовать на край колодца, так что никакой утечки геля происходит в верхней части колодца во время инъекции и чаевые могут быть легко удалены после инъекции геля. В настоящем Протоколе (φ1 мм сфероиде хорошо) около 700 мкм-максимальный диаметр для инъекционного сфероида. Если хорошо диаметр предназначен больше, чем в настоящем Протоколе, больше сфероидов могут быть введены, потому что можно отрезать кончик иметь больше внутреннего диаметра. Сфероида диаметра можно легко контролировать путем изменения количества клеток, найденным в 96-луночных пластины.

Во-первых, этот протокол показывает Роман microfluidic платформа для построения perfusable сосудистой сети в сфероида. Хотя coculture с HUVECs позволяет формирование судна подобных структур в сфероида^18,23,24, это были не perfusable из-за мертвых заканчивается lumina. Потому что фибробласты, клетки существуют в универсальный тканях (кости, Адипоцит и рака, и т.д.), путем добавления некоторых других ориентации клетки coculture сфероида, васкуляризации различного вида сфероидов можно ожидать, что можно имитировать в VIVO лучше, чем обычные сфероида культуры окружающей среды. Чтобы расширить применение техники, будущая работа будет включать васкуляризации сфероидов без добавления клетки фибробластов. Некоторые недавние работ доклад костного стромальные клетки³² и мышечные клетки³³ может вызвать ангиогенеза в microfluidic приборы. Используя стромальные или мышечные клетки вместо клетки фибробластов увеличит количество тканей, которые могут быть васкуляризированной microfluidic устройство. Этот протокол обеспечивает базовую платформу васкуляризации ткани, что долгожданный технику в области три размерные культур.

Автор заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Эта работа была поддержана гребень JST (Грант № JPMJCR14W4), общества для поощрения от науки (JSP) KAKENHI (номер 25600060, 16K 16386 Грант), центр инновационной программы от МПКСНТ и JST, проект был сосредоточен на разработке технологии оценки ключ от Японское агентство для медицинских исследований и развития, AMED, Mizuho Фонд содействия развитию наук. Микротехнологий поддержали Киотский университет нано технологии концентратора.